引用本文： 喻磊, 谷天祥, 师恩祎, 张光伟, 毛乃惠, 程实. 深低温停循环肾损伤及其早期检测. 中国胸心血管外科临床杂志, 2014, 21(1): 90-96. doi: 10.7507/1007-4848.20140024 复制
主动脉弓置换术是一类复杂的心脏外科手术，需要在深低温停循环（deep hypothermic circulatory arrest，DHCA）下施行，即使围术期采取了多种措施，手术也会造成重要器官，尤其是肾脏的缺血损伤，术后发生急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）[1]。DHCA术后急性肾损伤的发生率高达5%～50% [2-4]，同时DHCA术后肾功能不全已经是患者死亡的重要危险因素[5-6]。然而DHCA术后急性肾损伤的检测仍是目前困扰临床的棘手问题，血肌酐和尿量是目前急性肾损伤的诊断指标，但受到很多因素影响，敏感性和特异性都不高。因诊断滞后，常贻误治疗的最佳时期。寻求具有高敏感性、特异性、易检测的新生物标志物已经成为当前研究热点之一。
进行DHCA所致肾脏损伤的研究需要一个合适的动物模型，既往DHCA研究模型常用猪、犬等动物，实验花费高昂并且操作比较复杂[7-8]。近年来有应用兔模型来研究DHCA，但术后均不能长期生存[9-10]。我们成功地建立了术后能够长期生存的不开胸DHCA兔模型，并应用于DHCA对肾脏的损伤及早期检测指标的研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物模型和分组
新西兰大耳兔（雌雄不拘）42只，体重3.5～4.0 kg（1～2岁龄），由中国医科大学实验动物中心提供。分为两组：A组（体外循环组）和B组（DHCA组），每组各21只。
1.1.2 体外循环及DHCA模型的建立
实验前禁食禁水6 h，每只兔子麻醉前给予肌肉注射速眠新0.5 mg/kg，穿刺耳缘静脉，建立静脉通道，并固定确切。静脉推注阿托品0.01 mg/kg，以减少麻醉过程中支气管粘液分泌。用地西泮和芬太尼维持麻醉。切开气管内插管，使用小动物呼吸机（江西省特力麻醉呼吸设备公司DW-3000型）辅助呼吸，潮气量10～15 ml/kg，呼吸频率30～45次/分，吸入氧浓度50%，监测动脉血气使pH值及二氧化碳分压（PCO2）在生理范围内。左腹股沟皮肤放置血氧饱和度监测探头。四肢皮下置入心电图针形电极。放置鼻咽温和肛温探头。再游离出左或右股动、静脉。股动脉连接三通和压力换能器，用于动脉血取样和连续监测动脉血压，股静脉穿刺用于输液。体外循环前体温用变温毯维持在37.5 °C～38.5 °C之间。
体外循环的构成包括：StockertⅢ型体外循环机、膜肺（Dideco901），变温水箱（Stockert）和超滤装置（MAQUET）。为减少预充量所有连接管道内径为3 mm（西京医疗器材有限公司）。预充液包括：同种兔血100 ml、50 ml生理盐水、林格液（210 ml）、地塞米松（1 mg/kg）、呋塞米（5 mg）、甘露醇（1.5 g）、碳酸氢钠（0.25 g）、先锋霉素Ⅴ（0.5 g）、硫酸镁（2 mg）、肝素钠（500 U）。游离出左、右颈总动、静脉，右颈动静脉用于插管建立体外循环，左颈总动脉插管进行选择性脑灌注。采用18G套管针经右颈总动脉逆行插入作为动脉灌注管，经右颈总静脉将带有多个侧孔的内径4 mm的静脉引流管插入右心房（图 1、2），再分别用近心端缝线妥善固定，静脉推注肝素3 mg/kg，当激活全血凝固时间（ACT）>480 s时转流开始。体外循环开始时转流量为80～90 ml /（kg•min）转流过程中动脉压保持在60 mm Hg以上，转流量逐渐增加达到120 ml /（kg•min）（图 3）。体外循环转流开始后为防止肺不张机械通气采用持续正压通气（5 cm H2O），吸入氧浓度21%，但在DHCA期间停止机械通气。整个体外循环中直肠温度和血液温度始终保持在10℃以内，肛温降至30 ℃时，静脉内推注10%氯化钾6 ml使心脏在10 s内停跳。A组肛温维持在28 ℃持续体外循环，B组在30 min内肛温降至16～18 ℃时停循环，顺行性脑灌注8～10 ml /（kg•min），停循环60 min后开放循环复温，在30 min内复温至肛温35 ℃，之后维持体外循环30 min。复温期间不能自动复跳出现心室颤动时给予体外电除颤10 Ws/kg（盐水侵湿的两个电极分别放在备过皮的前胸壁和右侧腹股沟区，必要时可以反复除颤）。复温期间静脉应用多巴胺及副肾维持动脉压在50 mm Hg以上直到肛温达到35 ℃以上或流量达到60 ml /（kg•min）以上。所有动物复温达到肛温36 ℃，混合静脉血氧饱和度达到70%以上，自主循环稳定时鱼精蛋白1︰1中和后脱离体外循环。一旦自主呼吸恢复停止机械通气改为插管处吸氧。术中血气监测当温度高于28 ℃时采用alpha-stat策略，当温度低于28 ℃时采用PH-stat策略。术中采用常规超滤加零平衡超滤，术中维持红细胞压积0.25±0.05，体外循环结束后采用改良超滤（经颈动脉灌注管抽血、颈静脉引流管还血，流量保持在10～15 ml /（kg•min）超滤约10 min红细胞压积维持在0.30±0.05左右。如果2 h内不能脱离体外循环认为动物死亡。
图1
经颈总动脉及颈内静脉插管建立体外循环 图 2 动脉灌注管及静脉引流管 图 3 DHCA术中
1.2 标本采集
在术前、术后6 h、24 h及48 h分别采集静脉血及尿样，血液标本和尿液标本收集后立即在3 000转/分转速下离心10 min，取等量上清液，存放于-80℃冰箱中。两组分别在术前、术后6 h、24 h及48 h处死动物各4只，立即进腹，游离双侧肾脏及肾动静脉，结扎肾动脉近端，然后以生理盐水经肾动脉冲洗肾脏3次，取下肾脏。血液标本分别检测血清肌酐（Cr）、β-痕迹蛋白（β-TP）、尿样行尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）值。留取肾脏组织经过处理后分别检测丙二醛（MDA）含量、HE染色和凋亡指标缺口末端标法（TUNEL）染色以及透射电子显微镜观察肾小管上皮细胞形态。Β-TP及NGAL的酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒由Life Science Lab（Dade Behring，Marburg，Germany）提供，其余试剂盒均购自南京建成生物制品公司。
1.3 统计学分析
所有数据均以均数±标准差（
2 结果
两组术前资料及术中体外循环指标差异无统计学意义。A组死亡4只（2只术后不能脱离体外循环，2只因插静脉引流管时引起大出血），B组死亡5只（3只术后不能脱离体外循环，1只因术后心脏不复跳，1只因插静脉引流管时引起心搏骤停）。（1）血清Cr值（表 1）：A组组内各时间点之间差异无统计学意义（P>0.05），B组在术后24 h与组内及A组间比较明显升高（P<0.05）。（2）血β-TP（表 2）及尿NGAL值（表 3）：A组组内各时间点之间差异无统计学意义（P>0.05）。B组内术后6 h、24 h、48 h与术前比较明显升高（P<0.05），B组在术后24 h与组内其它时间点比较明显升高（P<0.05）。B组术后6 h、24 h、48 h与A组比较明显升高（P<0.05）。（3）肾组织MDA含量（表 4）：B组在术后24 h与组内及组间比较明显升高（P<0.05），其它时间点在组内及组间差异无统计学意义（P>0.05）。（4）HE染色可见B组在术后24 h局部肾小管上皮细胞肿胀，出现水样变性和空泡变性、灶状坏死，肾髓质及皮髓交界处肾小管排列稀疏、紊乱，肾小管扩张明显。A组肾小管排列整齐，间质无充血、水肿及炎症细胞浸润（图 4）。（5）TUNEL染色阳性率：凋亡的组织细胞体积较小，核呈棕褐色或深棕色，非凋亡细胞核呈蓝色。B组在术后24 h与组内及组间比较明显升高（P<0.05），其它时间点在组内及组间差异无统计学意义（P>0.05，表 5、图 5）。（6）电子显微镜观察可见B组在术后24 h肾小管上皮细胞基底膜增厚，薄厚不均、线粒体肿胀溶解、细胞核外膜不清、内质网肿胀脱颗粒。A组肾小管上皮细胞基底膜完整，厚度一致，线粒体呈梭形，膜完整，无肿胀溶解（图 6）。
表1
两组兔子血清Cr水平比较（μmol/L，
表2
两组兔子血清β-TP值比较（mg/L，
表3
两组兔子尿NGAL值比较（μg/L，
表4
两组兔子肾组织MDA含量比较[nmol /（mg•port），
图4
A组肾小管 HE×400
注：A，B为A组，C为B组
表5
两组兔子肾小管上皮细胞凋亡率（%，
图5
肾小管组织 TUNEL×400
注：A为A组；B为B组
图6
电子显微镜观察肾组织 EM×8000
注：A，B为A组；C为B组
3 讨论
既往研究应用兔为动物模型需要开胸，术中血液丢失较多，术后容易出现气胸，并且术后均不能长期生存。我们经过改进成功建立了兔不开胸DHCA模型，因不开胸术中丢失血液较少，术后没有气胸发生，并且建模的成功率达到79%。因此本实验的模型对于研究DHCA造成的器官损伤是一种简单、方便、经济并且能够长期生存的动物模型。成功建立DHCA模型术中需要注意以下几点：（1）静脉引流管需要带有多个侧孔，内径能够达到4 mm并且插入右心房才能满足体外循环的流量（我们应用成人吸痰管前端剪开几个小侧孔）。（2）静脉引流管经右颈静脉插入时避免过分粗暴以免造成静脉破裂大出血。（3）静脉引流管插入深度大约3 cm左右，插管时需要监测动脉血压及心电图，如果血压突然升高或心电图有心律失常发生说明静脉引流管已经插入右心房。（4）膜肺高度应低于右心房水平50 cm左右，尽量减少静脉引流管及动脉灌注管的长度。
胸主动脉疾病包括胸主动脉瘤和主动脉夹层，病变常累及主动脉弓，手术需要在DHCA下施行，即使围术期采取了多种措施，手术也会造成重要器官，尤其是肾脏的缺血损伤[11]。随着现代体外循环技术的发展，近年来心脏术后急性肾功能衰竭的发病率已趋下降，但一旦发生，其死亡率高达45%～100%[12-13]。预防和治疗DHCA肾损伤是大血管外科期待解决的难题之一。目前DHCA术后发生急性肾损伤（AKI）的确切机制尚不明确，虽然在停循环各个器官缺血时，深低温已经被证明是一种很有效的保护技术，但它同样会产生器官的缺血-再灌注损伤[5]。同时由于体外循环的血流特点对肾脏供血的特殊性[14]，因此它与常温肾脏缺血-再灌注又不完全相同。我们的研究中DHCA组术后24 h血Cr、尿NGAL、血β-TP较体外循环组均明显增高，肾组织MDA含量较体外循环组均明显升高，这些结果说明DHCA会造成术后肾脏损伤，且以术后24 h表现最为明显，而且光学显微镜、电子显微镜均证实肾脏损伤的病理改变。同时我们发现肾脏损伤是以肾小管上皮细胞凋亡为主，并未发现明显细胞坏死的改变，这说明可能是因为深低温对肾脏的缺血有一定的保护作用。
肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）是评价肾功能的金标准[15]。GFR的检测可以由菊粉清除率或者其它检测方法如99mTc-DTPA和51Cr-EDTA的检测，但没有一种可有效地用于临床[16-17]。24 h肌酐清除率经常被用来评价肾功能，但它也缺乏精准度。并且由于需要收集24 h的尿液样本使其应用更加受限。而目前临床检测肾小球滤过功能的标志物常用肌酐值，但它对于早期GFR损伤的预测敏感度较低，在GFR下降50%以上才会升高。在临床检测中Cr在体外循环急性肾损伤后24～48 h才会升高。因此以Cr的变化来诊断急性肾损伤及给予干预治疗，可能使治疗延误及治疗效果不良，因此能够早期检测肾脏损伤对于术后治疗非常重要。
NGAL是一种调控肾小管上皮细胞凋亡的分子，正常情况下肾组织很少表达，肾缺血后NGAL基因是上调最显著的基因之一，NGAL也是过表达最显著的蛋白之一[18]。Martensson等[19]研究发现，血NGAL水平在伴或不伴有AKI的全身炎性反应综合征、严重脓毒症及脓毒症休克患者都有升高，可能因为它是由活化的中性粒细胞所释放的，所以多种其它疾病及其并发症也可能使重症患者的NGAL测值升高，故特异性不高，而尿NGAL更有利于诊断，因为在脓毒症患者中，未发生AKI的患者其尿NGAL水平并不高。研究表明在肾缺血-再灌注损伤时，血和尿NGAL水平显著增加[20]，在肾缺血引起肾损害时其在肾组织中的表达明显上调并在数小时内可以在尿液中检测到[21]，证明尿NGAL比血清肌酐更早期、更敏感反映AKI。近年来随着研究的不断深入，发现血清β-TP可以用来评价早期的肾小球滤过功能的损害。β-TP是脂质运载蛋白型前列腺素D合酶（lipocalin-type prostaglandin Dynthase，L-PGDS），最初由此Leone等[22]于1961年首次发现并将其命名为β-TP。β-TP是人脑脊液中的主要蛋白质，同时可以在人的血和尿中检测到[23]。其生理功能为作为一种酶催化前列腺素H2（prostaglandin H2，PGH2）转化为前列腺素D2（prostaglandin D2，PGD2）；作为Lipocalin超家族的成员，具有结合和转运疏水性分子的性能，协同PGD2调控睡眠的作用。近年来有研究显示慢性肾脏疾病患者β-TP己明显升高，在血清Cr正常时（所谓肌酐盲区）也升高，β-TP可能是提示肾小球滤过率下降的一个早期检测指标，是比较理想的反映肾小球滤过率的标记物[24]。我们发现DHCA术后6 h尿NGAL及血β-TP与对照组比较就已经明显升高，术后24 h达到最高值，而血Cr只在术后24 h与对照组比较才明显升高，这说明尿NGAL及血β-TP是DHCA术后肾损伤的早期检测指标，与血Cr相比更加敏感。
不开胸DHCA兔模型对于研究深低温停循环造成的器官损伤是一种简单、方便、经济并且能够长期生存的动物模型。在DHCA手术后24 h肾损伤最严重，血β-TP和尿NGAL是DHCA肾损伤的早期检测指标。
主动脉弓置换术是一类复杂的心脏外科手术，需要在深低温停循环（deep hypothermic circulatory arrest，DHCA）下施行，即使围术期采取了多种措施，手术也会造成重要器官，尤其是肾脏的缺血损伤，术后发生急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）[1]。DHCA术后急性肾损伤的发生率高达5%～50% [2-4]，同时DHCA术后肾功能不全已经是患者死亡的重要危险因素[5-6]。然而DHCA术后急性肾损伤的检测仍是目前困扰临床的棘手问题，血肌酐和尿量是目前急性肾损伤的诊断指标，但受到很多因素影响，敏感性和特异性都不高。因诊断滞后，常贻误治疗的最佳时期。寻求具有高敏感性、特异性、易检测的新生物标志物已经成为当前研究热点之一。
进行DHCA所致肾脏损伤的研究需要一个合适的动物模型，既往DHCA研究模型常用猪、犬等动物，实验花费高昂并且操作比较复杂[7-8]。近年来有应用兔模型来研究DHCA，但术后均不能长期生存[9-10]。我们成功地建立了术后能够长期生存的不开胸DHCA兔模型，并应用于DHCA对肾脏的损伤及早期检测指标的研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物模型和分组
新西兰大耳兔（雌雄不拘）42只，体重3.5～4.0 kg（1～2岁龄），由中国医科大学实验动物中心提供。分为两组：A组（体外循环组）和B组（DHCA组），每组各21只。
1.1.2 体外循环及DHCA模型的建立
实验前禁食禁水6 h，每只兔子麻醉前给予肌肉注射速眠新0.5 mg/kg，穿刺耳缘静脉，建立静脉通道，并固定确切。静脉推注阿托品0.01 mg/kg，以减少麻醉过程中支气管粘液分泌。用地西泮和芬太尼维持麻醉。切开气管内插管，使用小动物呼吸机（江西省特力麻醉呼吸设备公司DW-3000型）辅助呼吸，潮气量10～15 ml/kg，呼吸频率30～45次/分，吸入氧浓度50%，监测动脉血气使pH值及二氧化碳分压（PCO2）在生理范围内。左腹股沟皮肤放置血氧饱和度监测探头。四肢皮下置入心电图针形电极。放置鼻咽温和肛温探头。再游离出左或右股动、静脉。股动脉连接三通和压力换能器，用于动脉血取样和连续监测动脉血压，股静脉穿刺用于输液。体外循环前体温用变温毯维持在37.5 °C～38.5 °C之间。
体外循环的构成包括：StockertⅢ型体外循环机、膜肺（Dideco901），变温水箱（Stockert）和超滤装置（MAQUET）。为减少预充量所有连接管道内径为3 mm（西京医疗器材有限公司）。预充液包括：同种兔血100 ml、50 ml生理盐水、林格液（210 ml）、地塞米松（1 mg/kg）、呋塞米（5 mg）、甘露醇（1.5 g）、碳酸氢钠（0.25 g）、先锋霉素Ⅴ（0.5 g）、硫酸镁（2 mg）、肝素钠（500 U）。游离出左、右颈总动、静脉，右颈动静脉用于插管建立体外循环，左颈总动脉插管进行选择性脑灌注。采用18G套管针经右颈总动脉逆行插入作为动脉灌注管，经右颈总静脉将带有多个侧孔的内径4 mm的静脉引流管插入右心房（图 1、2），再分别用近心端缝线妥善固定，静脉推注肝素3 mg/kg，当激活全血凝固时间（ACT）>480 s时转流开始。体外循环开始时转流量为80～90 ml /（kg•min）转流过程中动脉压保持在60 mm Hg以上，转流量逐渐增加达到120 ml /（kg•min）（图 3）。体外循环转流开始后为防止肺不张机械通气采用持续正压通气（5 cm H2O），吸入氧浓度21%，但在DHCA期间停止机械通气。整个体外循环中直肠温度和血液温度始终保持在10℃以内，肛温降至30 ℃时，静脉内推注10%氯化钾6 ml使心脏在10 s内停跳。A组肛温维持在28 ℃持续体外循环，B组在30 min内肛温降至16～18 ℃时停循环，顺行性脑灌注8～10 ml /（kg•min），停循环60 min后开放循环复温，在30 min内复温至肛温35 ℃，之后维持体外循环30 min。复温期间不能自动复跳出现心室颤动时给予体外电除颤10 Ws/kg（盐水侵湿的两个电极分别放在备过皮的前胸壁和右侧腹股沟区，必要时可以反复除颤）。复温期间静脉应用多巴胺及副肾维持动脉压在50 mm Hg以上直到肛温达到35 ℃以上或流量达到60 ml /（kg•min）以上。所有动物复温达到肛温36 ℃，混合静脉血氧饱和度达到70%以上，自主循环稳定时鱼精蛋白1︰1中和后脱离体外循环。一旦自主呼吸恢复停止机械通气改为插管处吸氧。术中血气监测当温度高于28 ℃时采用alpha-stat策略，当温度低于28 ℃时采用PH-stat策略。术中采用常规超滤加零平衡超滤，术中维持红细胞压积0.25±0.05，体外循环结束后采用改良超滤（经颈动脉灌注管抽血、颈静脉引流管还血，流量保持在10～15 ml /（kg•min）超滤约10 min红细胞压积维持在0.30±0.05左右。如果2 h内不能脱离体外循环认为动物死亡。
图1
经颈总动脉及颈内静脉插管建立体外循环 图 2 动脉灌注管及静脉引流管 图 3 DHCA术中
1.2 标本采集
在术前、术后6 h、24 h及48 h分别采集静脉血及尿样，血液标本和尿液标本收集后立即在3 000转/分转速下离心10 min，取等量上清液，存放于-80℃冰箱中。两组分别在术前、术后6 h、24 h及48 h处死动物各4只，立即进腹，游离双侧肾脏及肾动静脉，结扎肾动脉近端，然后以生理盐水经肾动脉冲洗肾脏3次，取下肾脏。血液标本分别检测血清肌酐（Cr）、β-痕迹蛋白（β-TP）、尿样行尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）值。留取肾脏组织经过处理后分别检测丙二醛（MDA）含量、HE染色和凋亡指标缺口末端标法（TUNEL）染色以及透射电子显微镜观察肾小管上皮细胞形态。Β-TP及NGAL的酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒由Life Science Lab（Dade Behring，Marburg，Germany）提供，其余试剂盒均购自南京建成生物制品公司。
1.3 统计学分析
所有数据均以均数±标准差（
2 结果
两组术前资料及术中体外循环指标差异无统计学意义。A组死亡4只（2只术后不能脱离体外循环，2只因插静脉引流管时引起大出血），B组死亡5只（3只术后不能脱离体外循环，1只因术后心脏不复跳，1只因插静脉引流管时引起心搏骤停）。（1）血清Cr值（表 1）：A组组内各时间点之间差异无统计学意义（P>0.05），B组在术后24 h与组内及A组间比较明显升高（P<0.05）。（2）血β-TP（表 2）及尿NGAL值（表 3）：A组组内各时间点之间差异无统计学意义（P>0.05）。B组内术后6 h、24 h、48 h与术前比较明显升高（P<0.05），B组在术后24 h与组内其它时间点比较明显升高（P<0.05）。B组术后6 h、24 h、48 h与A组比较明显升高（P<0.05）。（3）肾组织MDA含量（表 4）：B组在术后24 h与组内及组间比较明显升高（P<0.05），其它时间点在组内及组间差异无统计学意义（P>0.05）。（4）HE染色可见B组在术后24 h局部肾小管上皮细胞肿胀，出现水样变性和空泡变性、灶状坏死，肾髓质及皮髓交界处肾小管排列稀疏、紊乱，肾小管扩张明显。A组肾小管排列整齐，间质无充血、水肿及炎症细胞浸润（图 4）。（5）TUNEL染色阳性率：凋亡的组织细胞体积较小，核呈棕褐色或深棕色，非凋亡细胞核呈蓝色。B组在术后24 h与组内及组间比较明显升高（P<0.05），其它时间点在组内及组间差异无统计学意义（P>0.05，表 5、图 5）。（6）电子显微镜观察可见B组在术后24 h肾小管上皮细胞基底膜增厚，薄厚不均、线粒体肿胀溶解、细胞核外膜不清、内质网肿胀脱颗粒。A组肾小管上皮细胞基底膜完整，厚度一致，线粒体呈梭形，膜完整，无肿胀溶解（图 6）。
表1
两组兔子血清Cr水平比较（μmol/L，
表2
两组兔子血清β-TP值比较（mg/L，
表3
两组兔子尿NGAL值比较（μg/L，
表4
两组兔子肾组织MDA含量比较[nmol /（mg•port），
图4
A组肾小管 HE×400
注：A，B为A组，C为B组
表5
两组兔子肾小管上皮细胞凋亡率（%，
图5
肾小管组织 TUNEL×400
注：A为A组；B为B组
图6
电子显微镜观察肾组织 EM×8000
注：A，B为A组；C为B组
3 讨论
既往研究应用兔为动物模型需要开胸，术中血液丢失较多，术后容易出现气胸，并且术后均不能长期生存。我们经过改进成功建立了兔不开胸DHCA模型，因不开胸术中丢失血液较少，术后没有气胸发生，并且建模的成功率达到79%。因此本实验的模型对于研究DHCA造成的器官损伤是一种简单、方便、经济并且能够长期生存的动物模型。成功建立DHCA模型术中需要注意以下几点：（1）静脉引流管需要带有多个侧孔，内径能够达到4 mm并且插入右心房才能满足体外循环的流量（我们应用成人吸痰管前端剪开几个小侧孔）。（2）静脉引流管经右颈静脉插入时避免过分粗暴以免造成静脉破裂大出血。（3）静脉引流管插入深度大约3 cm左右，插管时需要监测动脉血压及心电图，如果血压突然升高或心电图有心律失常发生说明静脉引流管已经插入右心房。（4）膜肺高度应低于右心房水平50 cm左右，尽量减少静脉引流管及动脉灌注管的长度。
胸主动脉疾病包括胸主动脉瘤和主动脉夹层，病变常累及主动脉弓，手术需要在DHCA下施行，即使围术期采取了多种措施，手术也会造成重要器官，尤其是肾脏的缺血损伤[11]。随着现代体外循环技术的发展，近年来心脏术后急性肾功能衰竭的发病率已趋下降，但一旦发生，其死亡率高达45%～100%[12-13]。预防和治疗DHCA肾损伤是大血管外科期待解决的难题之一。目前DHCA术后发生急性肾损伤（AKI）的确切机制尚不明确，虽然在停循环各个器官缺血时，深低温已经被证明是一种很有效的保护技术，但它同样会产生器官的缺血-再灌注损伤[5]。同时由于体外循环的血流特点对肾脏供血的特殊性[14]，因此它与常温肾脏缺血-再灌注又不完全相同。我们的研究中DHCA组术后24 h血Cr、尿NGAL、血β-TP较体外循环组均明显增高，肾组织MDA含量较体外循环组均明显升高，这些结果说明DHCA会造成术后肾脏损伤，且以术后24 h表现最为明显，而且光学显微镜、电子显微镜均证实肾脏损伤的病理改变。同时我们发现肾脏损伤是以肾小管上皮细胞凋亡为主，并未发现明显细胞坏死的改变，这说明可能是因为深低温对肾脏的缺血有一定的保护作用。
肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）是评价肾功能的金标准[15]。GFR的检测可以由菊粉清除率或者其它检测方法如99mTc-DTPA和51Cr-EDTA的检测，但没有一种可有效地用于临床[16-17]。24 h肌酐清除率经常被用来评价肾功能，但它也缺乏精准度。并且由于需要收集24 h的尿液样本使其应用更加受限。而目前临床检测肾小球滤过功能的标志物常用肌酐值，但它对于早期GFR损伤的预测敏感度较低，在GFR下降50%以上才会升高。在临床检测中Cr在体外循环急性肾损伤后24～48 h才会升高。因此以Cr的变化来诊断急性肾损伤及给予干预治疗，可能使治疗延误及治疗效果不良，因此能够早期检测肾脏损伤对于术后治疗非常重要。
NGAL是一种调控肾小管上皮细胞凋亡的分子，正常情况下肾组织很少表达，肾缺血后NGAL基因是上调最显著的基因之一，NGAL也是过表达最显著的蛋白之一[18]。Martensson等[19]研究发现，血NGAL水平在伴或不伴有AKI的全身炎性反应综合征、严重脓毒症及脓毒症休克患者都有升高，可能因为它是由活化的中性粒细胞所释放的，所以多种其它疾病及其并发症也可能使重症患者的NGAL测值升高，故特异性不高，而尿NGAL更有利于诊断，因为在脓毒症患者中，未发生AKI的患者其尿NGAL水平并不高。研究表明在肾缺血-再灌注损伤时，血和尿NGAL水平显著增加[20]，在肾缺血引起肾损害时其在肾组织中的表达明显上调并在数小时内可以在尿液中检测到[21]，证明尿NGAL比血清肌酐更早期、更敏感反映AKI。近年来随着研究的不断深入，发现血清β-TP可以用来评价早期的肾小球滤过功能的损害。β-TP是脂质运载蛋白型前列腺素D合酶（lipocalin-type prostaglandin Dynthase，L-PGDS），最初由此Leone等[22]于1961年首次发现并将其命名为β-TP。β-TP是人脑脊液中的主要蛋白质，同时可以在人的血和尿中检测到[23]。其生理功能为作为一种酶催化前列腺素H2（prostaglandin H2，PGH2）转化为前列腺素D2（prostaglandin D2，PGD2）；作为Lipocalin超家族的成员，具有结合和转运疏水性分子的性能，协同PGD2调控睡眠的作用。近年来有研究显示慢性肾脏疾病患者β-TP己明显升高，在血清Cr正常时（所谓肌酐盲区）也升高，β-TP可能是提示肾小球滤过率下降的一个早期检测指标，是比较理想的反映肾小球滤过率的标记物[24]。我们发现DHCA术后6 h尿NGAL及血β-TP与对照组比较就已经明显升高，术后24 h达到最高值，而血Cr只在术后24 h与对照组比较才明显升高，这说明尿NGAL及血β-TP是DHCA术后肾损伤的早期检测指标，与血Cr相比更加敏感。
不开胸DHCA兔模型对于研究深低温停循环造成的器官损伤是一种简单、方便、经济并且能够长期生存的动物模型。在DHCA手术后24 h肾损伤最严重，血β-TP和尿NGAL是DHCA肾损伤的早期检测指标。
