引用本文： 张冬坤, 苏晓东, 张旭, 胡祎, 戎铁华. Cyclin D1蛋白在T2～3N0M0期食管癌中的表达及其与预后的关系. 中国胸心血管外科临床杂志, 2014, 21(1): 47-51. doi: 10.7507/1007-4848.20140014 复制
食管癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，外科手术仍为治疗食管癌的主要方法，近30年来食管癌外科治疗5年生存率仍在30%左右，因此，目前有关食管癌的发生、发展以及预后的相关分子标记物研究成为热点之一。细胞周期素Dl（Cyclin D1）是重要的细胞周期调节蛋白，其与细胞周期蛋白依赖性激酶结合，促使细胞从G期顺利进入S期，使细胞发生分裂与增殖[1]。Cyclin D1蛋白的过度表达可促使细胞持续增殖，并可能导致细胞发生恶性转化[2]。已发现Cyclin D1在多种肿瘤（如喉癌[3]、肝癌[4]、结直肠癌[5]、口腔癌[6]、卵巢癌[7]等）中的表达明显增高，并与预后密切相关。目前Cyclin D1过表达与食管癌预后的关系结论不一，我们利用组织芯片技术和免疫组织化学染色方法检测Cyclin Dl蛋白在T2～3N0M0期食管癌组织中的表达，旨在探讨其表达与食管癌临床病理特征和预后的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取1997年1月至2004年12月，在中山大学附属肿瘤医院接受手术治疗的食管癌患者，入选标准：（1）切除后显微镜下无残留（R0切除）的胸段食管鳞状细胞癌；（2）术后病理分期T2～3N0M0；（3）手术入路经左胸或右胸；（4）术前未行化疗和/或放射治疗；（5）蜡块保存完整并能完成组织芯片制作。排除术后死亡（术后住院期间或术后30 d内死亡）和多原发癌的患者。227例患者符合入选标准，其中男165例，女62例；年龄32～77岁，中位年龄58岁，<65岁168例，≥65岁59例；肿瘤部位：胸上段25例，胸中段152例，胸下段50例；≤5 cm155例，>5 cm72例；pT2 88例和pT3 139例；高分化57例，中分化114例，低分化56例。所有患者术后均未行辅助治疗，术前常规接受胸部CT扫描，腹部B超或CT检查排除肺、肝等远处转移。
1.2 方法
我院提供食管癌患者的原始蜡块，在陕西超英生物科技有限公司实验室制作完成组织芯片。用组织芯片仪（美国Beecher公司生产）在空白的受体蜡块上钻孔，孔径1 mm，然后在原始蜡块上穿刺取2～3条直径为1 mm、有代表性的肿瘤组织芯放入受体蜡块孔内，直至将所有组织标本全部种植于受体蜡块中，4 μm厚连续切片。免疫组织化学实验所用鼠抗人Cyclin D1单抗、SP染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。实验方法参照免疫组织化学SP试剂盒说明书进行操作，每组实验均设阳性和阴性对照，阳性对照片为试剂公司提供，阴性对照用PBS代替一抗。
在观察免疫组织化学染色结果时，根据阳性细胞占全部细胞的比例分为：无阳性细胞记录为“0”；阳性细胞数<10%记录为“1”；阳性细胞数10%～25%记录为“2”；阳性细胞数26%～50%记录为“3”；阳性细胞数51%～75%记录为“4”；阳性细胞数>75%记录为“5”。染色强度分为3级：弱（浅黄色）记录为“1”；中（棕黄色）记录为“2”；强（棕褐色）记录为“3”。免疫组织化学染色结果计算时取每一个指标的染色强度与阳性细胞占全部细胞比例的乘积和的平均值[8]，即（染色强度１×细胞比例1+染色强度2×细胞比例2+染色强度3×细胞比例3）/3。由两位病理学专家独立阅片，确定免疫组织化学结果。不一致之处协商讨论决定免疫组织化学结果。本研究应用ROC曲线确定最佳免疫组织化学分界点[8-10]。
1.3 统计学分析
随访至2007年12月或死亡，生存时间按手术日期至死亡日期计算，至末次随访时间仍生存患者和死于非肿瘤原因患者的生存时间按删失值处理。采用SPSS 16.0统计软件包进行数据处理。ROC曲线的生成和分析采用MedCalc统计软件包11.0.1（MedCalc软件公司，比利时）。组间阳性率比较采用χ2检验，Kaplan-Meier生存曲线法计算患者生存率，Log-rank检验比较生存率间有无统计学差异，Cox比例风险回归模型进行预后多因素生存分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Cyclin D1阳性表达的部位和免疫组织化学染色记分的ROC曲线图和界点的选择
Cyclin D1阳性表达主要位于细胞核内，见图 1。根据ROC曲线分析判定3.0为Cyclin D1免疫组织化学高表达和低表达的分界点，见图 2。
图1
Cyclin D1蛋白在T2～3N0M0期食管癌中的表达×400
图2
Cyclin D1免疫组织化学染色记分的ROC曲线图和界点的选择
2.2 Cyclin D1表达与食管癌临床病理特征的关系
将Cyclin D1的表达分为低表达组（≤3.0）90例和高表达组（>3.0）137例。Cyclin D1蛋白的表达与性别（P=0.298）、年龄（P=0.525）、肿瘤位置（P=0.570）、肿瘤长度（P=0.056）、分化程度（P=0.713）和浸润深度（P=0.557）无明显相关性，见表 1。
表1
227例T2～3N0M0期食管癌Cyclin D1蛋白表达与临床病理特征的关系（例）
2.3 Cyclin D1表达与食管癌预后的关系
Kaplan-Meier单因素生存分析结果显示，肿瘤浸润深度和Cyclin D1的表达与食管癌预后有关。Cyclin D1低表达组与高表达组总的1年、3年、5年生存率分别为87.8%、51.1%、43.3%和79.6%、43.8%、30.7%，Log-rank检验差异有统计学意义（P=0.047），生存曲线见图 3。
图3
Cyclin D1表达的T2～3N0M0期食管癌患者的生存曲线
2.4 Cox风险比例模型分析结果
将食管癌患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤长度、肿瘤分化、肿瘤浸润深度和Cyclin D1蛋白表达7个因素引入Cox比例风险模型，多因素生存分析结果发现仅肿瘤浸润深度是影响食管癌预后的独立危险因素（P=0.027）；Cyclin D1不是食管癌的独立预后因素（RR值=1.378，95% CI 0.990-1.919，P=0.057）；见表 2。
表2
227例T2～3N0M0期食管癌的Cox风险比例模型分析结果
3 讨论
Cyclin Dl是细胞周期蛋白家族的重要成员，定位于染色体11q13，长约120 kb，基因跨距约15 kb，含有5个外显子，编码295个氨基酸构成的蛋白质，相对分子质量为34 000 [11]，含量随细胞周期呈周期性变化，它是细胞周期G1期增殖信号的关键蛋白，为G1/S期检查点的主要正向调控因子，Cyclin Dl扩增或过表达时G1/S期缩短，促使细胞过度增殖形成肿瘤[12]。近年来，不少研究表明Cyclin D1基因参与肿瘤的发生、发展，并被认为是一种促癌基因，其过度表达对肿瘤的诊断和预后具有重要的意义[13-14]。
Cyclin D1与肿瘤分化、浸润深度、淋巴结转移、分期和预后的相关性尚不明确。Nagasawa等[15]报道，食管癌Cyclin D1的过表达与淋巴结转移、淋巴血管侵犯和不良预后有关，是食管癌独立预后的指标，同时Cyclin D1的表达增高也降低了食管癌对化疗的敏感性。张旭等[16]应用组织芯片免疫组织化学法检测Cyclin D1在食管癌组织中的表达状态，结果Cyclin D1在晚期食管癌组织中的表达显著增加，T3和T4期Cyclin D1的表达率为70%，T1和T2期的表达率为40%，两组表达差异有统计学意义（P<0.05）。另外Cyclin D1表达与肿瘤分化、淋巴结转移、性别和年龄临床病理因素的差异均无统计学意义（P>0.05）。Itami等[17]对156例食管癌进行多因素生存分析，Cyclin D1是食管癌独立的预后因素。另一方面，Shiozaki等[18]的研究指出，Cyclin D1的过表达与淋巴结转移、淋巴血管侵犯及预后无明显相关性。Zhao等[19]报道Meta分析20篇（n=2 041例），应用免疫组织化学染色方法研究Cyclin D1与食管鳞癌临床病理特征和预后的文献，Meta分析结果显示，Cyclin D1过表达与食管鳞癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移和分期均显著相关（P<0.05），有10篇[15, 20-28]Cyclin D1的表达与预后关系的文献，其中8篇文献Cyclin D1是食管鳞癌独立预后因素，2篇文献Cyclin D1和预后无相关性，合并风险比为1.78（95% CI：1.49-2.12，P=0.000），结果Cyclin D1过表达与食管癌不良预后显著相关。
导致Cyclin D1的过表达与食管癌预后报道不一致的主要原因可能是目前缺乏统一的、被广泛接受的免疫组织化学评分方法，由于选用了不同的免疫组织化学评分方法，并且其界点选择也存在一定的主观性。我们的研究采用了联合免疫组织化学染色百分比和染色强度的可重复记分方法，根据ROC曲线分析判定Cyclin D1高表达和低表达的界点，该方法可比较客观地进行最大整体数量的正确分类。本组以3为判定Cyclin D1高表达和低表达的分界点，Cyclin D1表达与患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤长度、肿瘤分化和肿瘤浸润深度均无明显相关性（P>0.05）。Cyclin D1低表达组与高表达组总的1、3、5年生存率分别为87.8%、51.1%、43.3%和79.6%、43.8%、30.7%，差异有统计学意义（P=0.047）；经Cox回归多因素生存分析Cyclin D1虽然不是T2～3N0M0期食管癌预后的独立影响因素，但接近有统计学差异（P=0.057）。本组研究结果与多数文献结果有相似之处，这种研究结果的差别可能与有无食管癌分期分层分析，免疫组织化学评分系统和分界点的选择不同，样本量的大小以及病例选择偏倚等因素有关。因此，Cyclin D1蛋白在食管癌中的表达及与预后的关系还需进行深入地研究。
食管癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，外科手术仍为治疗食管癌的主要方法，近30年来食管癌外科治疗5年生存率仍在30%左右，因此，目前有关食管癌的发生、发展以及预后的相关分子标记物研究成为热点之一。细胞周期素Dl（Cyclin D1）是重要的细胞周期调节蛋白，其与细胞周期蛋白依赖性激酶结合，促使细胞从G期顺利进入S期，使细胞发生分裂与增殖[1]。Cyclin D1蛋白的过度表达可促使细胞持续增殖，并可能导致细胞发生恶性转化[2]。已发现Cyclin D1在多种肿瘤（如喉癌[3]、肝癌[4]、结直肠癌[5]、口腔癌[6]、卵巢癌[7]等）中的表达明显增高，并与预后密切相关。目前Cyclin D1过表达与食管癌预后的关系结论不一，我们利用组织芯片技术和免疫组织化学染色方法检测Cyclin Dl蛋白在T2～3N0M0期食管癌组织中的表达，旨在探讨其表达与食管癌临床病理特征和预后的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取1997年1月至2004年12月，在中山大学附属肿瘤医院接受手术治疗的食管癌患者，入选标准：（1）切除后显微镜下无残留（R0切除）的胸段食管鳞状细胞癌；（2）术后病理分期T2～3N0M0；（3）手术入路经左胸或右胸；（4）术前未行化疗和/或放射治疗；（5）蜡块保存完整并能完成组织芯片制作。排除术后死亡（术后住院期间或术后30 d内死亡）和多原发癌的患者。227例患者符合入选标准，其中男165例，女62例；年龄32～77岁，中位年龄58岁，<65岁168例，≥65岁59例；肿瘤部位：胸上段25例，胸中段152例，胸下段50例；≤5 cm155例，>5 cm72例；pT2 88例和pT3 139例；高分化57例，中分化114例，低分化56例。所有患者术后均未行辅助治疗，术前常规接受胸部CT扫描，腹部B超或CT检查排除肺、肝等远处转移。
1.2 方法
我院提供食管癌患者的原始蜡块，在陕西超英生物科技有限公司实验室制作完成组织芯片。用组织芯片仪（美国Beecher公司生产）在空白的受体蜡块上钻孔，孔径1 mm，然后在原始蜡块上穿刺取2～3条直径为1 mm、有代表性的肿瘤组织芯放入受体蜡块孔内，直至将所有组织标本全部种植于受体蜡块中，4 μm厚连续切片。免疫组织化学实验所用鼠抗人Cyclin D1单抗、SP染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。实验方法参照免疫组织化学SP试剂盒说明书进行操作，每组实验均设阳性和阴性对照，阳性对照片为试剂公司提供，阴性对照用PBS代替一抗。
在观察免疫组织化学染色结果时，根据阳性细胞占全部细胞的比例分为：无阳性细胞记录为“0”；阳性细胞数<10%记录为“1”；阳性细胞数10%～25%记录为“2”；阳性细胞数26%～50%记录为“3”；阳性细胞数51%～75%记录为“4”；阳性细胞数>75%记录为“5”。染色强度分为3级：弱（浅黄色）记录为“1”；中（棕黄色）记录为“2”；强（棕褐色）记录为“3”。免疫组织化学染色结果计算时取每一个指标的染色强度与阳性细胞占全部细胞比例的乘积和的平均值[8]，即（染色强度１×细胞比例1+染色强度2×细胞比例2+染色强度3×细胞比例3）/3。由两位病理学专家独立阅片，确定免疫组织化学结果。不一致之处协商讨论决定免疫组织化学结果。本研究应用ROC曲线确定最佳免疫组织化学分界点[8-10]。
1.3 统计学分析
随访至2007年12月或死亡，生存时间按手术日期至死亡日期计算，至末次随访时间仍生存患者和死于非肿瘤原因患者的生存时间按删失值处理。采用SPSS 16.0统计软件包进行数据处理。ROC曲线的生成和分析采用MedCalc统计软件包11.0.1（MedCalc软件公司，比利时）。组间阳性率比较采用χ2检验，Kaplan-Meier生存曲线法计算患者生存率，Log-rank检验比较生存率间有无统计学差异，Cox比例风险回归模型进行预后多因素生存分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Cyclin D1阳性表达的部位和免疫组织化学染色记分的ROC曲线图和界点的选择
Cyclin D1阳性表达主要位于细胞核内，见图 1。根据ROC曲线分析判定3.0为Cyclin D1免疫组织化学高表达和低表达的分界点，见图 2。
图1
Cyclin D1蛋白在T2～3N0M0期食管癌中的表达×400
图2
Cyclin D1免疫组织化学染色记分的ROC曲线图和界点的选择
2.2 Cyclin D1表达与食管癌临床病理特征的关系
将Cyclin D1的表达分为低表达组（≤3.0）90例和高表达组（>3.0）137例。Cyclin D1蛋白的表达与性别（P=0.298）、年龄（P=0.525）、肿瘤位置（P=0.570）、肿瘤长度（P=0.056）、分化程度（P=0.713）和浸润深度（P=0.557）无明显相关性，见表 1。
表1
227例T2～3N0M0期食管癌Cyclin D1蛋白表达与临床病理特征的关系（例）
2.3 Cyclin D1表达与食管癌预后的关系
Kaplan-Meier单因素生存分析结果显示，肿瘤浸润深度和Cyclin D1的表达与食管癌预后有关。Cyclin D1低表达组与高表达组总的1年、3年、5年生存率分别为87.8%、51.1%、43.3%和79.6%、43.8%、30.7%，Log-rank检验差异有统计学意义（P=0.047），生存曲线见图 3。
图3
Cyclin D1表达的T2～3N0M0期食管癌患者的生存曲线
2.4 Cox风险比例模型分析结果
将食管癌患者性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤长度、肿瘤分化、肿瘤浸润深度和Cyclin D1蛋白表达7个因素引入Cox比例风险模型，多因素生存分析结果发现仅肿瘤浸润深度是影响食管癌预后的独立危险因素（P=0.027）；Cyclin D1不是食管癌的独立预后因素（RR值=1.378，95% CI 0.990-1.919，P=0.057）；见表 2。
表2
227例T2～3N0M0期食管癌的Cox风险比例模型分析结果
3 讨论
Cyclin Dl是细胞周期蛋白家族的重要成员，定位于染色体11q13，长约120 kb，基因跨距约15 kb，含有5个外显子，编码295个氨基酸构成的蛋白质，相对分子质量为34 000 [11]，含量随细胞周期呈周期性变化，它是细胞周期G1期增殖信号的关键蛋白，为G1/S期检查点的主要正向调控因子，Cyclin Dl扩增或过表达时G1/S期缩短，促使细胞过度增殖形成肿瘤[12]。近年来，不少研究表明Cyclin D1基因参与肿瘤的发生、发展，并被认为是一种促癌基因，其过度表达对肿瘤的诊断和预后具有重要的意义[13-14]。
Cyclin D1与肿瘤分化、浸润深度、淋巴结转移、分期和预后的相关性尚不明确。Nagasawa等[15]报道，食管癌Cyclin D1的过表达与淋巴结转移、淋巴血管侵犯和不良预后有关，是食管癌独立预后的指标，同时Cyclin D1的表达增高也降低了食管癌对化疗的敏感性。张旭等[16]应用组织芯片免疫组织化学法检测Cyclin D1在食管癌组织中的表达状态，结果Cyclin D1在晚期食管癌组织中的表达显著增加，T3和T4期Cyclin D1的表达率为70%，T1和T2期的表达率为40%，两组表达差异有统计学意义（P<0.05）。另外Cyclin D1表达与肿瘤分化、淋巴结转移、性别和年龄临床病理因素的差异均无统计学意义（P>0.05）。Itami等[17]对156例食管癌进行多因素生存分析，Cyclin D1是食管癌独立的预后因素。另一方面，Shiozaki等[18]的研究指出，Cyclin D1的过表达与淋巴结转移、淋巴血管侵犯及预后无明显相关性。Zhao等[19]报道Meta分析20篇（n=2 041例），应用免疫组织化学染色方法研究Cyclin D1与食管鳞癌临床病理特征和预后的文献，Meta分析结果显示，Cyclin D1过表达与食管鳞癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移和分期均显著相关（P<0.05），有10篇[15, 20-28]Cyclin D1的表达与预后关系的文献，其中8篇文献Cyclin D1是食管鳞癌独立预后因素，2篇文献Cyclin D1和预后无相关性，合并风险比为1.78（95% CI：1.49-2.12，P=0.000），结果Cyclin D1过表达与食管癌不良预后显著相关。
导致Cyclin D1的过表达与食管癌预后报道不一致的主要原因可能是目前缺乏统一的、被广泛接受的免疫组织化学评分方法，由于选用了不同的免疫组织化学评分方法，并且其界点选择也存在一定的主观性。我们的研究采用了联合免疫组织化学染色百分比和染色强度的可重复记分方法，根据ROC曲线分析判定Cyclin D1高表达和低表达的界点，该方法可比较客观地进行最大整体数量的正确分类。本组以3为判定Cyclin D1高表达和低表达的分界点，Cyclin D1表达与患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤长度、肿瘤分化和肿瘤浸润深度均无明显相关性（P>0.05）。Cyclin D1低表达组与高表达组总的1、3、5年生存率分别为87.8%、51.1%、43.3%和79.6%、43.8%、30.7%，差异有统计学意义（P=0.047）；经Cox回归多因素生存分析Cyclin D1虽然不是T2～3N0M0期食管癌预后的独立影响因素，但接近有统计学差异（P=0.057）。本组研究结果与多数文献结果有相似之处，这种研究结果的差别可能与有无食管癌分期分层分析，免疫组织化学评分系统和分界点的选择不同，样本量的大小以及病例选择偏倚等因素有关。因此，Cyclin D1蛋白在食管癌中的表达及与预后的关系还需进行深入地研究。
