引用本文： 曹春风, 邵高海, 张铭华, 李波, 徐海涛, 张红军, 屈一鸣. 基于Notch/STAT3信号通路探讨bFGF对大鼠脊髓损伤的治疗机制. 中国修复重建外科杂志, 2024, 38(4): 480-486. doi: 10.7507/1002-1892.202312066 复制
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是临床常见神经系统疾病，可引起神经元损伤，并伴随星形胶质细胞活化及炎症反应[1-2]。SCI具有较高致死率和致残率，目前尚无有效治疗手段，探索安全有效治疗方法一直是临床研究热点[3]。星形胶质细胞活化及随之形成的胶质瘢痕是阻碍脊髓再生修复的主要原因[4]。研究表明，Notch基因在细胞分化、增殖和凋亡过程中起着重要作用，可调控神经元生长、分化及SCI后星形胶质细胞活化过程，与STAT3相互作用，在神经毒性A1星形胶质细胞分化过程中发挥重要作用，因此阻断Notch信号通路可抑制SCI后神经毒性A1星形胶质细胞的激活，是治疗SCI的重要靶点[5]。STAT3是神经元分化、调控和功能恢复的重要转录因子，研究显示抑制STAT3有利于大鼠SCI后的功能恢复，促进组织修复，改善损伤部位神经元分化[6]。另有研究证实，抑制Notch/STAT3信号通路可调控胶质母细胞增殖、凋亡及神经元生长、分化过程，并参与SCI后星形胶质细胞活化、神经元分化及轴突再生过程[7]。故探究Notch/STAT3信号通路在SCI中的调控作用，对阐明SCI神经再生修复机制具有一定意义。
bFGF是一种多功能细胞生长因子，广泛存在于神经元中，可促进神经元分化和成熟，诱导突触向神经纤维生长，维持神经元正常功能 [8-10]。近来研究发现bFGF可减少SCI神经元损伤并改善神经功能恢复，但具体分子生物学机制尚未明确[11]。我们分析bFGF可能通过调控Notch/STAT3信号通路促进脊髓再生修复，本研究通过建立大鼠SCI模型对此进行验证，以期阐明其分子生物学机制，为临床治疗SCI提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
10周龄清洁级雄性SD大鼠56只，体质量358～379 g，购自重庆腾鑫生物公司，于重庆医科大学实验动物中心常规饲养。
bFGF冻干粉（北京博尔西科技有限公司），实验前以生理盐水溶解制备成浓度为10 μg/mL的bFGF溶液；HE染色试剂盒、Nissl染色试剂盒、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色试剂盒、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）单克隆抗体、羊抗兔二抗、IL-1β、TNF-α、干扰素γ（interferon γ，IFN-γ）ELISA试剂盒、蛋白抽提试剂（重庆叶脉生物技术有限责任公司）；Notch、STAT3、磷酸化-STAT3（phosphoryl-STAT3，p-STAT3）、BMP-2、β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（苏州天隆生物科技有限公司）。
显微镜、酶标仪（福州康泰生物科技有限公司）；蛋白成像仪（湛江安度斯生物有限公司）；Image J 软件（美国国立卫生研究院）；Image Pro Plus 5.0 图像分析系统（Media Cybernetics公司，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 大鼠SCI模型建立及分组方法
实验分为模型组、bFGF组、假手术组。首先，参照文献 ［12］ 方法构建SCI大鼠模型。取40只大鼠俯卧位固定于手术台，腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，作背部正中切口，钝性分离皮下和肌肉组织，暴露T10棘突、椎板及其对应的硬脊膜及脊髓，将25 g击打棍从35 cm高度自由落体撞击T10棘突及对应脊髓。以鼠尾痉挛卷曲、双后肢回缩且呈痉挛性摆动、撞击部位脊髓水肿出血呈紫红色、硬脊膜完整作为判断SCI造模成功标准[12]。其中32只大鼠SCI造模成功，随机分为模型组和bFGF组，每组16只。另取16只健康大鼠，参照上述方式麻醉后，作切口仅暴露T10棘突、硬脊膜和脊髓，作为假手术组。
造模后bFGF组大鼠按照100 μg/kg剂量腹腔注射bFGF[13]，模型组和假手术组腹腔注射生理盐水（100 μg/kg）；每天注射1次，连续给药28 d。术后3 d内，每天肌肉注射1次头孢噻肟钠注射剂（0.2 g/kg）预防感染。
1.2.2 观测指标
① 运动功能评估：造模后观察各组大鼠存活以及双后肢功能恢复情况。于造模前及造模后即刻（0 d）及14 、28 d，对各组大鼠行BBB评分[14]，由2名实验观察者进行盲检并评分。
② 组织学观察：造模后28 d BBB评分后，采用注射过量麻醉药物处死各组大鼠，经原切口入路暴露T10脊髓。每组取其中8只大鼠损伤部位脊髓组织置于−70℃冰箱保存；余8只大鼠脊髓组织置于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，冠状切片，片厚5 µm。取部分切片行HE、Nissl和PI染色，3种染色每只大鼠均使用3张连续切片，显微镜下观察损伤部位脊髓组织病理学变化、神经元存活和凋亡情况，随机取6个视野计数尼氏体和PI红染细胞，取均值。
③ 免疫组织化学染色观察： 取剩余切片（每只大鼠取3张连续冠状切片），脱蜡、水化、抗原修复，添加GFAP一抗（1∶830）孵育10 h，继续添加羊抗兔二抗（1∶2 460）孵育2.5 h，DAB显色，苏木精复染、透明、封片。光镜下观察呈棕色染色表示GFAP阳性表达，即活化星形胶质细胞。随机取5个视野，用Image Pro Plus 5.0图像分析系统对GFAP表达进行半定量分析，取均值。
④ ELISA检测：取–70℃保存脊髓组织，室温下解冻匀浆。取部分脊髓组织以3000×g离心10 min，取上清液，参照ELISA试剂盒说明书检测脊髓组织炎症因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平。
⑤ Western blot检测：取部分脊髓组织匀浆液，蛋白抽提试剂提取并测定蛋白浓度后，进行电泳、转膜和封闭操作，加入一抗 ［Notch（1∶1 380）、STAT3（1∶1 070）、p-STAT3（1∶1 070）、BMP-2（1∶1 450）、β-actin（1∶1 950）］ 孵育12 h，继续添加二抗（1∶2 530）孵育2.5 h，化学发光法显色并拍照，Image J软件分析各目的蛋白相对表达量，以与内参β-actin比值分别定量Notch和BMP-2相对表达，以p-STAT3/STAT3定量STAT3的磷酸化表达。
1.3 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov检验行正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示。BBB评分组间比较采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser法进行校正，同一组别不同时间点间比较采用 Bonferroni 法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析。其余指标组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 运动功能评估
各组大鼠均存活至实验完成。组间比较：造模前，3组BBB评分差异均无统计学意义（P>0.05）。造模后即刻，模型组及bFGF组BBB评分均较假手术组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。造模后14、28 d，模型组BBB评分较假手术组降低，bFGF组较模型组升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。组内比较：假手术组各时间点间差异均无统计学意义（P>0.05）。模型组、bFGF组与造模前比较，造模后即刻BBB评分降低，14、28 d评分逐渐升高，各时间点间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1。
图1
各组BBB评分变化趋势
Figure1.
Change trend of BBB score in each group
2.2 组织学观察
2.2.1 HE染色
假手术组脊髓组织结构正常；模型组脊髓组织出现较多坏死灶，囊腔样变化，可见较多胶质瘢痕及空洞；bFGF组可见脊髓组织坏死灶、胶质瘢痕及空洞较模型组明显减少。见图2a。
图2
各组脊髓组织组织学观察（×400）
从左至右分别为假手术组、模型组、bFGF组 a. HE染色；b. Nissl染色；c. PI染色
Figure2. Histological observation of spinal cord tissue in each group (×400)From left to right for the sham-operation group, model group, and bFGF group, respectively a. HE staining; b. Nissl staining; c. PI staining
2.2.2 Nissl染色
假手术组脊髓组织尼氏体较多且结构清晰；模型组脊髓组织尼氏体呈细小颗粒状，结构正常尼氏体较少；bFGF组脊髓组织尼氏体呈粗颗粒状，可见部分结构正常尼氏体。见图2b。模型组脊髓组织尼氏体数量较假手术组减少，bFGF组较模型组增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
表1
各组观测指标比较（n=8，
）
Table1.
Comparison of indicators in the three groups (n=8, 
)
2.2.3 PI染色
3组均可见PI红染细胞（图2c）。模型组脊髓组织PI红染细胞数量较假手术组增加，bFGF组较模型组减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
2.3 免疫组织化学染色观察
镜下3组均可见活化星形胶质细胞（图3）。模型组脊髓组织GFAP表达水平较假手术组升高，bFGF组较模型组降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
图3
各组脊髓组织GFAP免疫组织化学染色观察（×400）
从左至右分别为假手术组、模型组、bFGF组
Figure3. GFAP immunohistochemical staining of spinal cord tissue in each group (×400)From left to right for the sham-operation group, model group, and bFGF group, respectively
2.4 ELISA检测
模型组脊髓组织IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平均较假手术组升高，bFGF组上述指标均较模型组降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
2.5 Western blot检测
模型组脊髓组织p-STAT3/STAT3及Notch、BMP-2蛋白相对表达量较假手术组升高，bFGF组上述指标均较模型组降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2及图4。
图4
Western blot检测脊髓组织Notch、p-STAT3、STAT3、BMP-2蛋白表达
1：假手术组 2：模型组 3：bFGF组
Figure4. Notch, p-STAT3, STAT3, and BMP-2 protein expressions in spinal cord tissue detected by Western blot1: Sham-operation group 2: Model group 3: bFGF group
3 讨论
SCI是一种致残率高、恢复欠佳的中枢神经系统疾病，可造成不同程度四肢瘫痪或截瘫[15-16]。研究证实SCI受损部位的星形胶质细胞胞体肥大、突起增多增大，活化星形胶质细胞增加并分泌神经抑制因子、胞外基质分子等，导致神经元凋亡和轴突再生障碍[17]。本研究发现，模型组大鼠脊髓组织出现较多坏死灶，结构正常尼氏体较少，运动功能BBB评分、脊髓组织尼氏体数量降低，脊髓组织PI红染细胞数、GFAP表达及炎症因子水平升高；表明SCI大鼠运动功能存在障碍，SCI处星形胶质细胞过度活化且伴随炎症反应，脊髓组织病理损伤严重，神经元存活状况较差且凋亡严重。
bFGF可促进神经元分化和成熟，保护神经元并维持其正常功能[18]。Wu等[19]研究发现bFGF可促进SCI大鼠脐静脉内皮细胞形成和血管新生，改善SCI部位炎症微环境，抑制神经元凋亡和轴突萎缩。Huang等[20]报道过表达bFGF可减少SCI小鼠脊髓胶质瘢痕形成，使得神经再生和内源性神经干细胞增殖能力增强，恢复SCI小鼠运动功能。本研究采用腹腔注射bFGF，bFGF进入动物体内后会随着血液循环被运输到各个组织和器官，包括脊髓，并在脊髓中发挥作用[21]。研究结果显示，在给予SCI大鼠bFGF干预后，脊髓组织坏死灶、胶质瘢痕及空洞较模型组明显减少，尼氏体呈粗颗粒状，可见部分结构正常尼氏体，BBB评分、脊髓组织尼氏体数量升高，PI红染细胞数量、GFAP表达水平及炎症因子水平降低，与Wu等[19]和Huang等[20]研究结果一致。提示bFGF可抑制神经元凋亡、星形胶质细胞活化、胶质瘢痕生成及炎症反应，改善SCI大鼠脊髓组织病理损伤、神经元存活及运动功能，然而其作用机制并不明确。
Notch/STAT3信号通路参与SCI进程，SCI后会导致Notch信号被激活，进而促进下游因子STAT3通过活化p-STAT3使神经干细胞向星形胶质细胞分化，阻滞神经干细胞向神经元分化及神经再生[5, 22]。BMP-2是STAT3下游靶分子之一，SCI后活化的星形胶质细胞分泌BMP-2，促进脊髓胶质瘢痕形成[23]。研究表明，抑制Notch/STAT3信号通路可促进SCI大鼠脊髓神经元存活，增强神经元抗凋亡能力，抑制星形胶质细胞活性，从而发挥SCI治疗作用[24]。本研究发现，模型组脊髓组织Notch、p-STAT3/STAT3、BMP-2蛋白表达水平较假手术组升高，表明SCI大鼠脊髓组织中Notch/STAT3信号通路被激活，这可能是SCI大鼠脊髓组织中活化星形胶质细胞及胶质瘢痕较多而神经元减少的原因。在给予SCI大鼠bFGF干预后，脊髓组织Notch、p-STAT3/STAT3、BMP-2蛋白表达水平降低，提示bFGF可抑制Notch/STAT3信号通路活性及下游因子BMP-2蛋白表达。结合Shen等[24]的研究结果，我们分析bFGF降低Notch/STAT3信号通路活性可能是其治疗SCI大鼠的分子机制。
综上述，bFGF能改善SCI大鼠运动功能和脊髓组织病理损伤，提高神经元存活率，抑制脊髓组织星形胶质细胞过度活化及炎症反应，其分子机制可能与抑制Notch/STAT3信号通路的活性相关。本研究尚存在以下不足，一是未设置多个剂量的bFGF对SCI大鼠进行干预，以探究不同剂量bFGF的作用效果；二是未设置Notch/STAT3信号通路激活剂进行回复实验；以上均需在后续研究中进一步改善。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经重庆医科大学附属永川医院伦理委员会批准（基础LS-2023-01-04）；实验动物使用许可证号：SYXK（渝）2022-0016
作者贡献声明 曹春风、邵高海：实验设计、实施及文章撰写；张铭华、李波、徐海涛、张红军：部分实验数据收集及整理；屈一鸣：提供实验思路、文章审阅
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是临床常见神经系统疾病，可引起神经元损伤，并伴随星形胶质细胞活化及炎症反应[1-2]。SCI具有较高致死率和致残率，目前尚无有效治疗手段，探索安全有效治疗方法一直是临床研究热点[3]。星形胶质细胞活化及随之形成的胶质瘢痕是阻碍脊髓再生修复的主要原因[4]。研究表明，Notch基因在细胞分化、增殖和凋亡过程中起着重要作用，可调控神经元生长、分化及SCI后星形胶质细胞活化过程，与STAT3相互作用，在神经毒性A1星形胶质细胞分化过程中发挥重要作用，因此阻断Notch信号通路可抑制SCI后神经毒性A1星形胶质细胞的激活，是治疗SCI的重要靶点[5]。STAT3是神经元分化、调控和功能恢复的重要转录因子，研究显示抑制STAT3有利于大鼠SCI后的功能恢复，促进组织修复，改善损伤部位神经元分化[6]。另有研究证实，抑制Notch/STAT3信号通路可调控胶质母细胞增殖、凋亡及神经元生长、分化过程，并参与SCI后星形胶质细胞活化、神经元分化及轴突再生过程[7]。故探究Notch/STAT3信号通路在SCI中的调控作用，对阐明SCI神经再生修复机制具有一定意义。
bFGF是一种多功能细胞生长因子，广泛存在于神经元中，可促进神经元分化和成熟，诱导突触向神经纤维生长，维持神经元正常功能 [8-10]。近来研究发现bFGF可减少SCI神经元损伤并改善神经功能恢复，但具体分子生物学机制尚未明确[11]。我们分析bFGF可能通过调控Notch/STAT3信号通路促进脊髓再生修复，本研究通过建立大鼠SCI模型对此进行验证，以期阐明其分子生物学机制，为临床治疗SCI提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
10周龄清洁级雄性SD大鼠56只，体质量358～379 g，购自重庆腾鑫生物公司，于重庆医科大学实验动物中心常规饲养。
bFGF冻干粉（北京博尔西科技有限公司），实验前以生理盐水溶解制备成浓度为10 μg/mL的bFGF溶液；HE染色试剂盒、Nissl染色试剂盒、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色试剂盒、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）单克隆抗体、羊抗兔二抗、IL-1β、TNF-α、干扰素γ（interferon γ，IFN-γ）ELISA试剂盒、蛋白抽提试剂（重庆叶脉生物技术有限责任公司）；Notch、STAT3、磷酸化-STAT3（phosphoryl-STAT3，p-STAT3）、BMP-2、β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（苏州天隆生物科技有限公司）。
显微镜、酶标仪（福州康泰生物科技有限公司）；蛋白成像仪（湛江安度斯生物有限公司）；Image J 软件（美国国立卫生研究院）；Image Pro Plus 5.0 图像分析系统（Media Cybernetics公司，美国）。
1.2 实验方法
1.2.1 大鼠SCI模型建立及分组方法
实验分为模型组、bFGF组、假手术组。首先，参照文献 ［12］ 方法构建SCI大鼠模型。取40只大鼠俯卧位固定于手术台，腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，作背部正中切口，钝性分离皮下和肌肉组织，暴露T10棘突、椎板及其对应的硬脊膜及脊髓，将25 g击打棍从35 cm高度自由落体撞击T10棘突及对应脊髓。以鼠尾痉挛卷曲、双后肢回缩且呈痉挛性摆动、撞击部位脊髓水肿出血呈紫红色、硬脊膜完整作为判断SCI造模成功标准[12]。其中32只大鼠SCI造模成功，随机分为模型组和bFGF组，每组16只。另取16只健康大鼠，参照上述方式麻醉后，作切口仅暴露T10棘突、硬脊膜和脊髓，作为假手术组。
造模后bFGF组大鼠按照100 μg/kg剂量腹腔注射bFGF[13]，模型组和假手术组腹腔注射生理盐水（100 μg/kg）；每天注射1次，连续给药28 d。术后3 d内，每天肌肉注射1次头孢噻肟钠注射剂（0.2 g/kg）预防感染。
1.2.2 观测指标
① 运动功能评估：造模后观察各组大鼠存活以及双后肢功能恢复情况。于造模前及造模后即刻（0 d）及14 、28 d，对各组大鼠行BBB评分[14]，由2名实验观察者进行盲检并评分。
② 组织学观察：造模后28 d BBB评分后，采用注射过量麻醉药物处死各组大鼠，经原切口入路暴露T10脊髓。每组取其中8只大鼠损伤部位脊髓组织置于−70℃冰箱保存；余8只大鼠脊髓组织置于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，冠状切片，片厚5 µm。取部分切片行HE、Nissl和PI染色，3种染色每只大鼠均使用3张连续切片，显微镜下观察损伤部位脊髓组织病理学变化、神经元存活和凋亡情况，随机取6个视野计数尼氏体和PI红染细胞，取均值。
③ 免疫组织化学染色观察： 取剩余切片（每只大鼠取3张连续冠状切片），脱蜡、水化、抗原修复，添加GFAP一抗（1∶830）孵育10 h，继续添加羊抗兔二抗（1∶2 460）孵育2.5 h，DAB显色，苏木精复染、透明、封片。光镜下观察呈棕色染色表示GFAP阳性表达，即活化星形胶质细胞。随机取5个视野，用Image Pro Plus 5.0图像分析系统对GFAP表达进行半定量分析，取均值。
④ ELISA检测：取–70℃保存脊髓组织，室温下解冻匀浆。取部分脊髓组织以3000×g离心10 min，取上清液，参照ELISA试剂盒说明书检测脊髓组织炎症因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平。
⑤ Western blot检测：取部分脊髓组织匀浆液，蛋白抽提试剂提取并测定蛋白浓度后，进行电泳、转膜和封闭操作，加入一抗 ［Notch（1∶1 380）、STAT3（1∶1 070）、p-STAT3（1∶1 070）、BMP-2（1∶1 450）、β-actin（1∶1 950）］ 孵育12 h，继续添加二抗（1∶2 530）孵育2.5 h，化学发光法显色并拍照，Image J软件分析各目的蛋白相对表达量，以与内参β-actin比值分别定量Notch和BMP-2相对表达，以p-STAT3/STAT3定量STAT3的磷酸化表达。
1.3 统计学方法
采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov检验行正态性检验，均符合正态分布，以均数±标准差表示。BBB评分组间比较采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser法进行校正，同一组别不同时间点间比较采用 Bonferroni 法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析。其余指标组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 运动功能评估
各组大鼠均存活至实验完成。组间比较：造模前，3组BBB评分差异均无统计学意义（P>0.05）。造模后即刻，模型组及bFGF组BBB评分均较假手术组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。造模后14、28 d，模型组BBB评分较假手术组降低，bFGF组较模型组升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。组内比较：假手术组各时间点间差异均无统计学意义（P>0.05）。模型组、bFGF组与造模前比较，造模后即刻BBB评分降低，14、28 d评分逐渐升高，各时间点间差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1。
图1
各组BBB评分变化趋势
Figure1.
Change trend of BBB score in each group
2.2 组织学观察
2.2.1 HE染色
假手术组脊髓组织结构正常；模型组脊髓组织出现较多坏死灶，囊腔样变化，可见较多胶质瘢痕及空洞；bFGF组可见脊髓组织坏死灶、胶质瘢痕及空洞较模型组明显减少。见图2a。
图2
各组脊髓组织组织学观察（×400）
从左至右分别为假手术组、模型组、bFGF组 a. HE染色；b. Nissl染色；c. PI染色
Figure2. Histological observation of spinal cord tissue in each group (×400)From left to right for the sham-operation group, model group, and bFGF group, respectively a. HE staining; b. Nissl staining; c. PI staining
2.2.2 Nissl染色
假手术组脊髓组织尼氏体较多且结构清晰；模型组脊髓组织尼氏体呈细小颗粒状，结构正常尼氏体较少；bFGF组脊髓组织尼氏体呈粗颗粒状，可见部分结构正常尼氏体。见图2b。模型组脊髓组织尼氏体数量较假手术组减少，bFGF组较模型组增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
表1
各组观测指标比较（n=8，）
Table1.
Comparison of indicators in the three groups (n=8, )
2.2.3 PI染色
3组均可见PI红染细胞（图2c）。模型组脊髓组织PI红染细胞数量较假手术组增加，bFGF组较模型组减少，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
2.3 免疫组织化学染色观察
镜下3组均可见活化星形胶质细胞（图3）。模型组脊髓组织GFAP表达水平较假手术组升高，bFGF组较模型组降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
图3
各组脊髓组织GFAP免疫组织化学染色观察（×400）
从左至右分别为假手术组、模型组、bFGF组
Figure3. GFAP immunohistochemical staining of spinal cord tissue in each group (×400)From left to right for the sham-operation group, model group, and bFGF group, respectively
2.4 ELISA检测
模型组脊髓组织IL-1β、TNF-α、IFN-γ水平均较假手术组升高，bFGF组上述指标均较模型组降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2。
2.5 Western blot检测
模型组脊髓组织p-STAT3/STAT3及Notch、BMP-2蛋白相对表达量较假手术组升高，bFGF组上述指标均较模型组降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1、2及图4。
图4
Western blot检测脊髓组织Notch、p-STAT3、STAT3、BMP-2蛋白表达
1：假手术组 2：模型组 3：bFGF组
Figure4. Notch, p-STAT3, STAT3, and BMP-2 protein expressions in spinal cord tissue detected by Western blot1: Sham-operation group 2: Model group 3: bFGF group
3 讨论
SCI是一种致残率高、恢复欠佳的中枢神经系统疾病，可造成不同程度四肢瘫痪或截瘫[15-16]。研究证实SCI受损部位的星形胶质细胞胞体肥大、突起增多增大，活化星形胶质细胞增加并分泌神经抑制因子、胞外基质分子等，导致神经元凋亡和轴突再生障碍[17]。本研究发现，模型组大鼠脊髓组织出现较多坏死灶，结构正常尼氏体较少，运动功能BBB评分、脊髓组织尼氏体数量降低，脊髓组织PI红染细胞数、GFAP表达及炎症因子水平升高；表明SCI大鼠运动功能存在障碍，SCI处星形胶质细胞过度活化且伴随炎症反应，脊髓组织病理损伤严重，神经元存活状况较差且凋亡严重。
bFGF可促进神经元分化和成熟，保护神经元并维持其正常功能[18]。Wu等[19]研究发现bFGF可促进SCI大鼠脐静脉内皮细胞形成和血管新生，改善SCI部位炎症微环境，抑制神经元凋亡和轴突萎缩。Huang等[20]报道过表达bFGF可减少SCI小鼠脊髓胶质瘢痕形成，使得神经再生和内源性神经干细胞增殖能力增强，恢复SCI小鼠运动功能。本研究采用腹腔注射bFGF，bFGF进入动物体内后会随着血液循环被运输到各个组织和器官，包括脊髓，并在脊髓中发挥作用[21]。研究结果显示，在给予SCI大鼠bFGF干预后，脊髓组织坏死灶、胶质瘢痕及空洞较模型组明显减少，尼氏体呈粗颗粒状，可见部分结构正常尼氏体，BBB评分、脊髓组织尼氏体数量升高，PI红染细胞数量、GFAP表达水平及炎症因子水平降低，与Wu等[19]和Huang等[20]研究结果一致。提示bFGF可抑制神经元凋亡、星形胶质细胞活化、胶质瘢痕生成及炎症反应，改善SCI大鼠脊髓组织病理损伤、神经元存活及运动功能，然而其作用机制并不明确。
Notch/STAT3信号通路参与SCI进程，SCI后会导致Notch信号被激活，进而促进下游因子STAT3通过活化p-STAT3使神经干细胞向星形胶质细胞分化，阻滞神经干细胞向神经元分化及神经再生[5, 22]。BMP-2是STAT3下游靶分子之一，SCI后活化的星形胶质细胞分泌BMP-2，促进脊髓胶质瘢痕形成[23]。研究表明，抑制Notch/STAT3信号通路可促进SCI大鼠脊髓神经元存活，增强神经元抗凋亡能力，抑制星形胶质细胞活性，从而发挥SCI治疗作用[24]。本研究发现，模型组脊髓组织Notch、p-STAT3/STAT3、BMP-2蛋白表达水平较假手术组升高，表明SCI大鼠脊髓组织中Notch/STAT3信号通路被激活，这可能是SCI大鼠脊髓组织中活化星形胶质细胞及胶质瘢痕较多而神经元减少的原因。在给予SCI大鼠bFGF干预后，脊髓组织Notch、p-STAT3/STAT3、BMP-2蛋白表达水平降低，提示bFGF可抑制Notch/STAT3信号通路活性及下游因子BMP-2蛋白表达。结合Shen等[24]的研究结果，我们分析bFGF降低Notch/STAT3信号通路活性可能是其治疗SCI大鼠的分子机制。
综上述，bFGF能改善SCI大鼠运动功能和脊髓组织病理损伤，提高神经元存活率，抑制脊髓组织星形胶质细胞过度活化及炎症反应，其分子机制可能与抑制Notch/STAT3信号通路的活性相关。本研究尚存在以下不足，一是未设置多个剂量的bFGF对SCI大鼠进行干预，以探究不同剂量bFGF的作用效果；二是未设置Notch/STAT3信号通路激活剂进行回复实验；以上均需在后续研究中进一步改善。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经重庆医科大学附属永川医院伦理委员会批准（基础LS-2023-01-04）；实验动物使用许可证号：SYXK（渝）2022-0016
作者贡献声明 曹春风、邵高海：实验设计、实施及文章撰写；张铭华、李波、徐海涛、张红军：部分实验数据收集及整理；屈一鸣：提供实验思路、文章审阅
