引用本文： 王翠, 李姣, 鲁凌云, 刘璐, 余希杰. 石胆酸对于BMSCs成骨-成脂分化平衡的影响. 中国修复重建外科杂志, 2024, 38(1): 82-90. doi: 10.7507/1002-1892.202308050 复制
骨质疏松以骨量降低、骨微结构破坏为特征，可增加骨质脆弱和骨折易感性的风险。预计到2050年，我国骨质疏松症和低骨量人群将达到4亿，对个人及社会造成严重健康负担[1]。胆汁酸是一类存在于肝肠循环中，并对脂类消化吸收、免疫功能、代谢状态发挥调控作用的脂类代谢物[2]。既往研究发现[3]，绝经后妇女血清胆汁酸水平与腰椎、股骨颈和全髋骨密度成正相关，与骨吸收的生物标志物β-骨胶原交联（β-isomerized C-terminal telopeptides，β-CTX）浓度成负相关。在慢性胆汁淤积患者中，骨质疏松患病率也高达30%～40%[4]。由此可知，胆汁酸代谢与骨代谢之间存在一定潜在关联，而调控胆汁酸代谢对于骨稳态的重塑是否具有意义也值得进一步探讨。
石胆酸（lithocholic acid，LCA）是由鹅去氧胆酸和熊脱氧胆酸经肠道细菌作用后产生的次级胆汁酸。作为生理洗涤剂，LCA可以调控脂质吸收，但对肝细胞却表现出毒性作用。而作为核受体法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）、孕烷受体、维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）及膜受体G蛋白偶联胆汁酸受体1（takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）的配体，LCA参与胆汁酸代谢反馈、能量代谢调节以及炎症反应的发生[5-7]。既往研究[8]认为LCA可通过抑制DNA修复酶和促进细胞增殖来促进肿瘤发展；但新近研究发现，LCA可能还具有抑制肝脏肠道炎症、抗衰老和抗肿瘤作用[9]。而在废用性及绝经后骨质疏松模型中，次级胆汁酸LCA水平的变化也被证明与骨量丢失密切相关[9-10]。
BMSCs是一类具有多向分化潜能的干细胞，可成骨、成肌、成软骨、成脂谱系等多向分化。BMSCs向成骨细胞或脂肪细胞的谱系特异性分化受许多旁分泌因子的调节，包括细胞因子、生长因子和激素，这些因子和激素诱导细胞间信号传导，随后激活关键转录因子，从而调节谱系分化方向。Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）以及Osterix是成骨分化的重要转录因子，两者通过作用于成骨细胞前体触发BMSCs成骨分化，并阶段性表达ALP、整合素结合唾液酸蛋白、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨γ-羧基谷氨酸蛋白、牙基质蛋白1和硬化素[11]。骨髓脂肪细胞约占全身脂肪量的10%，以调节型及结构型存在于骨髓腔。在转录因子Zfp521、Zfp423、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）和CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins，C/EBP）α/β的刺激下，脂肪祖细胞分化为骨髓脂肪细胞并表达较低水平的脂肪特异性标志物，包括脂肪酸结合蛋白4、瘦素和脂联素[12]。在绝经后骨质疏松研究中，雌激素撤退所诱发的炎症和氧化应激环境促进成骨细胞群与成脂细胞群之间的正常平衡向成脂分化倾斜，从而威胁骨骼的健康和完整性[12]。虽然目前研究有限，但已有研究证实运动、饮食调整以及雌激素补充等干预措施可通过减弱BMSCs成脂分化作用，从而产生骨骼获益[13]。因此，寻找调控BMSCs成骨分化与成脂分化的关键因子以干预成骨-成脂分化平衡，对于重建骨质结构和维持骨骼功能具有重要意义。目前尚无研究探讨LCA对BMSCs成骨-成脂分化平衡的影响。鉴于此，本研究拟探讨LCA对BMSCs成骨-成脂分化平衡是否存在调控作用，以期为阐明骨质疏松症的发生机制和寻找新的治疗靶点提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
10周龄SPF级C57BL/6J雌性小鼠16只，体质量约22 g，购自南京大学模型动物中心，饲养于四川大学华西科技园动物实验中心。饲养条件：温度（25±2）°C、湿度50%±5%，自由饮水和标准饮食，12 h光照/黑暗周期。经适应性饲养1周后用于实验。
LCA（上海麦克林生化科技股份有限公司）；FBS、青霉素/链霉素、α-MEM培养基（GIBCO公司，美国）；RNA提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Takara公司，日本）；油红O染液（北京索莱宝科技有限公司）；Ⅰ型前胶原氨基端原肽（procollagen Ⅰ N-terminal propeptide，PINP）及β-CTX检测试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司）；β甘油磷酸钠、抗坏血酸、胰岛素、地塞米松、罗格列酮、ALP染色试剂盒（Sigma公司，美国）。
Thermal Cycler PCR仪、LightCycler 96实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（Bio-Rad公司，美国）；正置荧光显微镜（Zeiss公司，美国）；vivaCT80高分辨率微CT（SCANCO Medical公司，瑞士）。
1.2 绝经后骨质疏松动物模型相关观测
1.2.1 模型构建及实验分组
将12只SPF级C57BL/6J雌性小鼠随机分为实验组和对照组，每组6只。实验组小鼠通过背部切口移除卵巢行双侧卵巢切除术，对照组仅移除卵巢周围相同体积脂肪组织。术后小鼠均于相同条件下饲养，每周检测体质量。术后4周注射过量2%戊巴比妥钠处死小鼠，收集小鼠股骨、胫骨、肝脏和血清进行相关分析，观察子宫萎缩情况。
1.2.2 骨量分析
将两组小鼠右侧股骨标本固定于4%多聚甲醛，通过micro-CT进行微结构扫描分析和三维重建。对于松质骨，将生长板下100层松质骨作为感兴趣区域；对于皮质骨，将股骨干中部的100层皮质骨作为感兴趣区域。主要分析参数：骨体积/组织体积（bone volume/tissue volume，BV/TV）、结构模型指数（structure model index，SMI）、骨小梁数目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁间隔（trabecular separation，Tb.Sp）、骨皮质厚度（cortical thickness，Ct.Th）和骨表面/骨体积（bone surface/bone volume，BS/BV）。
1.2.3 骨髓脂肪定量检测
将两组小鼠左侧胫骨标本固定于4%多聚甲醛，经脱钙、清洗、脱水、透明化和包埋，5 μm厚切片，行HE染色观察。采用Image J软件选定骨髓腔区域中骨髓脂肪空泡，并行计数及面积百分比分析。
1.2.4 骨代谢改变观测
取两组小鼠血清样本，采用ELISA法检测骨转换标志物P1NP及β-CTX表达。将标准品及小鼠血清样本50 μL加入50 μL检测液A，37°C孵育1 h后PBS洗板3次，每孔加100 μL检测溶液，相同条件孵育30 min，再次PBS洗板5次。每孔加入90 μL底物溶液，相同条件孵育15 min后加入50 μL终止液，立即于450 nm波长处测定吸光度（A）值，绘制标准曲线并根据logistic曲线拟合计算相应指标浓度。
1.2.5 胆汁酸代谢改变观测
取两组小鼠肝脏样本行RT-qPCR检测。Trizol 法提取肝脏RNA，逆转录获取cDNA后检测胆汁酸代谢关键酶相关基因cyp7a1、cyp7b1、cyp8b1及cyp27a1表达，收集PCR所得样本Ct 值，以β-actin为内参，采用 2–ΔΔCt 方法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of RT-qPCR (5′→3′)
1.3 LCA干预小鼠BMSCs成骨-成脂分化观测
1.3.1 BMSCs分离培养
分离2只10周龄C57BL/6J雌性小鼠股骨和胫骨，采用离心法提取BMSCs并加入完全培养基（含10%FBS和1%青霉素/链霉素的α-MEM培养基）培养，连续传代至第3代用于后续实验。
1.3.2 细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）法检测细胞毒性
将第3代BMSCs细胞悬液以2×104个/孔密度接种于96孔板，培养4 h待细胞贴壁后，分别加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培养基孵育24 h后，更换培养基为含10%CCK-8的完全培养基，分别于孵育1、2、3、4 h时用酶标仪测定450 nm波长处A值。
1.3.3 成骨诱导培养ALP染色观察
将第3代BMSCs接种于6孔板，分别加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培养基干预，待细胞达80%以上融合后行成骨诱导分化培养，成骨培养基为含50 µg/mL维生素C、10 mmol/L β甘油磷酸盐的α-MEM完全培养基，隔2天换液1次。诱导分化7 d，按照ALP染色试剂盒说明书操作行ALP染色观察。
1.3.4 成脂诱导培养油红O染色观察
将第3代BMSCs接种于6孔板，分别加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培养基干预，待细胞达80%以上融合后行成脂诱导分化培养。根据分化阶段不同，成脂培养基在加入了含10%FBS和1%青霉素/链霉素的H-DMEM培养基基础上，配方有所差异：第1天10 mg/mL胰岛素、1 μmol/L地塞米松、62.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 mmol/L罗格列酮；第4天10 mg/mL胰岛素、1 mmol/L罗格列酮；第7天10 mg/mL胰岛素。诱导分化7 d行油红O染色观察。
1.3.5 RT-qPCR检测成骨、成脂相关基因表达
取各浓度LCA干预组成骨或成脂诱导分化7 d的细胞，采用RNA提取试剂盒过柱法提取细胞RNA，逆转录获取cDNA后检测成骨细胞相关基因ALP、Runx2、骨钙素（osteocalcin，OCN）以及成脂细胞相关基因脂联素（adiponectin，Adipoq）、脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding protein 4，FABP4）、PPARγ表达，采用 2–ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。
1.4 统计学方法
采用Graphpad-prism统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；两组多个时间点比较采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser法进行校正，同一组别不同时间点比较采用Bonferroni法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 绝经后骨质疏松动物模型相关观测
2.1.1 体质量和子宫萎缩情况分析
术后各时间点两组小鼠体质量均较术前显著上升，且实验组小鼠体质量显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；术后4周实验组小鼠子宫质量为（0.06±0.01）g，较对照组（0.15±0.01）g明显萎缩，差异有统计学意义（t=17.800，P<0.001）。见图1。
图1
两组小鼠体质量和子宫萎缩情况
a. 各时间点体质量比较；b. 术后4周对照组（左）和实验组（右）子宫外观
Figure1. Body mass and uterine atrophy of mice in two groupsa. Comparison of body mass at different time points; b. Postoperative uterine appearance of control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks
2.1.2 骨量分析
micro-CT三维重建示，与对照组比较，术后实验组小鼠骨小梁数量减少且连接稀疏。见图2。其中实验组BV/TV、Tb.N较对照组显著减少，Tb.Sp、SMI显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）；两组Ct.Th和BS/BV比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
图2
术后4周对照组（左）和实验组（右）小鼠micro-CT三维重建
a. 松质骨；b. 皮质骨
Figure2. Micro-CT three-dimensional reconstruction of control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks after operationa. Trabecular bone; b. Cortical bone
表2
术后4周两组小鼠micro-CT三维重建各指标比较（n=6，
）
Table2.
Comparison of micro-CT three-dimensional reconstruction indexes between the two groups at 4 weeks after operation (n=6, 
)
2.1.3 骨髓脂肪定量检测
HE染色示，与对照组相比，实验组胫骨近端的骨髓脂肪细胞数量显著增加，几乎填满了整个骨髓空间（图3）。定量分析示实验组脂肪细胞数量为（170.17±36.24）个/视野、面积百分比为13.75%±3.98%，显著高于对照组 ［分别为（16.17±16.06）个/视野和0.56%±0.65%］，差异有统计学意义（t=9.517，P<0.001；t=8.018，P<0.001）。
图3
术后4周对照组（左）和实验组（右）小鼠胫骨标本HE染色观察
a. ×10；b. ×20
Figure3. HE staining observation of tibia specimens of mice in control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks after operationa. ×10; b. ×20
2.1.4 骨代谢及胆汁酸代谢改变观测
血清ELISA检测示实验组小鼠P1NP及β-CTX水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。RT-qPCR检测示，肝脏胆汁酸代谢关键酶基因cyp7a1、cyp8b1及cyp27a1 mRNA相对表达量显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），两组cyp7b1 mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
表3
术后4周两组小鼠骨代谢及胆汁酸代谢各指标比较（n=6，
）
Table3.
Comparison of indexes of bone metabolism and bile acid metabolism between the two groups at 4 weeks after operation (n=6, 
)
2.2 LCA干预小鼠BMSCs成骨-成脂分化观测
2.2.1 CCK-8法检测细胞毒性
培养4 h内各浓度（0、1、10、100 μmol/L）LCA干预组A值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图4。
图4
CCK-8法检测各浓度LCA干预组细胞毒性
Figure4.
CCK-8 method for detecting cytotoxicity of LCA intervention groups at different concentrations
2.2.2 LCA干预对BMSCs成骨诱导分化的作用
成骨诱导7 d ALP染色示，与LCA 0 μmol/L干预组比较，1 μmol/L干预组ALP阳性区域无显著变化，10 μmol/L干预组阳性区域稍有减少，而100 μmol/L干预组阳性区域显著减少。RT-qPCR检测示，与LCA 0 μmol/L干预组比较，10 μmol/L和100 μmol/L干预组成骨相关基因ALP、OCN mRNA相对表达量明显下调，100 μmol/L干预组Runx2 mRNA相对表达量明显下调，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图5。
图5
LCA干预对BMSCs成骨诱导分化的作用
a. 成骨诱导7 d ALP染色观察（×10） 从左至右依次为LCA 0、1、10、100 μmol/L 干预组；b. RT-qPCR检测各浓度LCA干预组成骨相关基因表达
Figure5. Effect of LCA intervention on osteogenic differentiation of BMSCsa. ALP staining observation on the 7th day of osteogenic induction (×10) From left to right for 0, 1, 10, and 100 μmol/L LCA intervention groups, respectively; b. The expressions of osteogenic-related genes detected by RT-qPCR
2.2.3 LCA干预对BMSCs成骨诱导分化的作用
成脂诱导7 d油红O染色示，与LCA 0 μmol/L干预组比较，1 μmol/L干预组油红O染色阳性区域无显著变化，10 μmol/L及100 μmol/L干预组阳性区域增加。RT-qPCR检测示10 μmol/L及100 μmol/L干预组成脂相关基因Adipoq、FABP4、PPARγ mRNA相对表达量显著高于0 μmol/L干预组，1 μmol/L干预组FABP4 mRNA相对表达量高于0 μmol/L干预组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图6。
图6
LCA干预对BMSCs成脂诱导分化的作用
a. 成脂诱导7 d油红O染色观察（×10） 从左至右依次为LCA 0、1、10、100 μmol/L 干预组；b. RT-qPCR检测各浓度LCA干预组成脂相关基因表达
Figure6. Effect of LCA intervention on adipogenic differentiation of BMSCsa. Oil red O staining observation on the 7th day of adipogenic induction (×10) From left to right for 0, 1, 10, and 100 μmol/L LCA intervention groups, respectively; b. The expression of adipogenic-related genes detected by RT-qPCR
3 讨论
绝经后骨质疏松是在雌激素撤退后，骨骼的骨形成与骨吸收之间动态平衡遭到破坏，且骨吸收占主导地位，从而引起骨质流失的代谢性疾病。骨髓中含有可分化为成骨细胞及脂肪细胞的BMSCs，以及能分化为破骨细胞的单核细胞/巨噬细胞系，这3种细胞的分化平衡共同参与维持骨稳态[14]。本研究中，雌激素撤退后引起的骨量变化表现为松质骨小梁明显破坏，而皮质骨并未受影响。这种骨量和骨微结构的破坏主要是由破骨能力增强以及其继发的成骨能力增强所造成的高骨转换状态引发，具体体现在骨形成标志物P1NP及骨吸收标志物β-CTX表达的共同上升。近年来，BMSCs在多种病理状态下倾向性分化为骨髓脂肪组织后，在骨微环境及骨重塑中的作用备受关注。本研究结果显示，绝经后骨质疏松小鼠的BMSCs倾向分化为脂肪细胞能力增强，骨髓腔内骨髓脂肪数量明显增加，面积显著扩张。既往研究已证实，骨髓脂肪组织通过分泌许多内分泌因子（即脂肪因子和促炎细胞因子）来抑制成骨细胞，促进破骨细胞功能，从而影响骨稳态[15]。因此，靶向干预BMSCs成骨-成脂分化从而干预骨重塑过程成为研究热点。
关于骨代谢与胆汁酸代谢之间的关联性，已在胆汁淤积性疾病以及骨质疏松疾病模型中得到验证。原发性胆汁性肝硬化患者骨质疏松患病率高达32.5%，而肝功能障碍分级、胆汁淤积严重程度及持续时间被认为是影响骨质流失程度的主要危险因素[16]。尽管具体机制不明，但该病理状态下骨形成降低和骨吸收增强均有报道，其发生机制与维生素D和钙缺乏、骨保护素与OCN不足、IGF-1减少、用药方案选择、遗传易感性，以及胆红素破坏成骨细胞活力和成骨分化、矿化能力相关[17]。
在本研究中，绝经后动物模型胆汁酸经典途径代谢关键酶cyp7a1以及替代途径代谢酶cyp27a1表达明显下调，表明绝经后雌激素撤退的病理模型下，胆汁酸合成代谢整体处于抑制状态。目前，多项基于骨质疏松患者的临床及动物模型实验印证了胆汁酸代谢的改变，因此靶向胆汁酸代谢对于骨代谢的影响成为研究热点[9，16]。刺五加苷与仙灵骨葆胶囊对骨量提升具有积极作用，而这种正向调节被证明是通过调控胆汁酸代谢实现的[17-18]。胆汁酸可以与成骨细胞表达的FXR、TGR5和VDR结合，从而调节成骨。米诺环素治疗后紊乱的肠道菌群改变了循环胆汁酸谱，进而通过破坏肠道/肝脏胆汁酸轴以衰减FXR依赖性信号的方式抑制成骨细胞分化[19]。FXR敲除鼠的成骨潜力遭到损害，破骨能力提升，并且可能伴随成脂分化能力增强；而鹅去氧胆酸作为FXR激动剂可上调成骨相关转录因子Runx2，并增强细胞外信号调节激酶以及β-连环蛋白信号传导以促进成骨分化，并同时抑制成脂分化和破骨分化发生[19-20]。敲除TGR5对于青年及成年小鼠的骨量无明显影响，而在老年及去卵巢小鼠中则呈现出明显骨量丢失，可能归因于Amp活化蛋白激酶信号通路表达增强而引起的破骨生成增加[21]。TGR5的激活还能促进Runx2的表达，增强ALP活性、细胞外基质矿化和成骨细胞基因（如ALP、OCN和Osterix）的表达，而FXR及TGR5的单向及双向激动剂均具有抑制破骨分化的效益[22-23]。牛磺熊去氧胆酸是一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的用于治疗慢性胆汁淤积性肝病的亲水胆汁酸，已被证明可以治疗去卵巢小鼠的骨量丢失。牛磺熊去氧胆酸给药后，股骨远端骨小梁结构保留增多，总骨体积、骨密度、骨体积百分比等指标较对照组有显著改善，因此牛磺熊去氧胆酸除治疗胆汁淤积外，可能对其并发的骨质流失具有重要意义[24]。由此可见，靶向胆汁酸代谢及其受体对于调控骨代谢具有重要意义。
异常的BMSCs谱系分化是绝经后骨质疏松发病机制之一，增加的骨髓脂肪组织积累以牺牲骨形成为代价，并损害成骨再生和造血功能[25]。鉴于既往研究报道绝经后骨质疏松模型中LCA水平呈显著变化[10]，本研究选用LCA进一步探讨其对BMSCs谱系分化是否具有干扰作用，结果显示LCA干预后成骨分化转录因子Runx2以及成骨特异性基质蛋白ALP、OCN的基因表达明显下调，提示LCA对于BMSCs的成骨分化有损害作用。这与既往有关LCA对于成骨细胞系（小鼠骨样细胞MLO-Y4和MLO-A5，人成骨肉瘤细胞Saos-2）的成骨分化负性作用结果一致。而这种作用可能主要是通过破坏抗凋亡基因B淋巴细胞瘤2基因（B-cell lymphoma 2，BCL-2）和促凋亡基因BCL-2相关X蛋白的表达平衡来直接损害成骨细胞系的成骨潜力，但具体机制不明[24-25]。在LCA干预Saos-2细胞系的实验中，成骨生成相关基因ALP和BMP的表达显著降低，伴随着破骨分化相关NF-κB配体受体激活剂和降钙素受体表达上调，代表着LCA对于成骨生成以及破骨生成的双重调节作用[26]。此外，上述研究发现熊去氧胆酸在一定程度上可以中和LCA对成骨细胞的毒性作用，表明熊去氧胆酸作为胆汁淤积性疾病的一线治疗药物可能对并发的骨质疏松产生额外骨骼获益[24-25]。作为VDR低亲和力配体，LCA还可以竞争性激活VDR，从而降低维生素D对于成骨细胞的OCN及NF-κB配体的表达刺激作用[27]。在维生素D缺乏情况下，LCA通过调节肠道吸收和骨骼动员来增加血清钙，但血清钙、磷的增加也可能进一步加重慢性肾脏病的血管钙化[26-27]。本研究首次表明LCA对BMSCs成脂分化具有促进作用，经过LCA干预后，成脂相关转录因子PPARγ以及脂肪相关内源性细胞因子FABP4和Adipoq表达显著增加，表明BMSCs倾向性分化为骨髓脂肪细胞的能力增强。虽然具体机制不明，但我们分析激活FXR-PPARγ信号通路促进脂肪细胞分化可能是其作用机制之一[28]。此外，作为TGR5的重要激动剂，既往研究发现LCA抑制破骨分化的功能可能通过TGR5及其下游腺苷酸活化蛋白激酶信号通路实现[21]。因此，LCA对于骨代谢的调节作用是多方面的，包括调控成骨分化、成脂分化、破骨分化及机体钙磷平衡，但具体机制尚不明确。
综上述，本研究结果提示LCA具有干扰BMSCs成骨-成脂分化的作用，从而对骨稳态产生潜在有害影响；未来靶向LCA代谢及其受体的深入研究将为骨质疏松的预防及治疗提供新思路。然而，本研究尚有一定局限性，亟待通过靶向胆汁酸代谢组的高通量测序和在体小鼠的LCA干预为实验假说提供有力证据，以及深入探讨LCA对于成骨-成脂分化平衡的具体作用机制也具有重要意义。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经四川大学华西医院伦理委员会批准（202303023001）；实验动物使用许可证号：SYXK（川）2021-0248
作者贡献声明 王翠：文章撰写、研究实施；李姣：研究实施；刘璐：数据分析及绘图；鲁凌云：研究设计；余希杰：审校文章，基金支持
骨质疏松以骨量降低、骨微结构破坏为特征，可增加骨质脆弱和骨折易感性的风险。预计到2050年，我国骨质疏松症和低骨量人群将达到4亿，对个人及社会造成严重健康负担[1]。胆汁酸是一类存在于肝肠循环中，并对脂类消化吸收、免疫功能、代谢状态发挥调控作用的脂类代谢物[2]。既往研究发现[3]，绝经后妇女血清胆汁酸水平与腰椎、股骨颈和全髋骨密度成正相关，与骨吸收的生物标志物β-骨胶原交联（β-isomerized C-terminal telopeptides，β-CTX）浓度成负相关。在慢性胆汁淤积患者中，骨质疏松患病率也高达30%～40%[4]。由此可知，胆汁酸代谢与骨代谢之间存在一定潜在关联，而调控胆汁酸代谢对于骨稳态的重塑是否具有意义也值得进一步探讨。
石胆酸（lithocholic acid，LCA）是由鹅去氧胆酸和熊脱氧胆酸经肠道细菌作用后产生的次级胆汁酸。作为生理洗涤剂，LCA可以调控脂质吸收，但对肝细胞却表现出毒性作用。而作为核受体法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）、孕烷受体、维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）及膜受体G蛋白偶联胆汁酸受体1（takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）的配体，LCA参与胆汁酸代谢反馈、能量代谢调节以及炎症反应的发生[5-7]。既往研究[8]认为LCA可通过抑制DNA修复酶和促进细胞增殖来促进肿瘤发展；但新近研究发现，LCA可能还具有抑制肝脏肠道炎症、抗衰老和抗肿瘤作用[9]。而在废用性及绝经后骨质疏松模型中，次级胆汁酸LCA水平的变化也被证明与骨量丢失密切相关[9-10]。
BMSCs是一类具有多向分化潜能的干细胞，可成骨、成肌、成软骨、成脂谱系等多向分化。BMSCs向成骨细胞或脂肪细胞的谱系特异性分化受许多旁分泌因子的调节，包括细胞因子、生长因子和激素，这些因子和激素诱导细胞间信号传导，随后激活关键转录因子，从而调节谱系分化方向。Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）以及Osterix是成骨分化的重要转录因子，两者通过作用于成骨细胞前体触发BMSCs成骨分化，并阶段性表达ALP、整合素结合唾液酸蛋白、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨γ-羧基谷氨酸蛋白、牙基质蛋白1和硬化素[11]。骨髓脂肪细胞约占全身脂肪量的10%，以调节型及结构型存在于骨髓腔。在转录因子Zfp521、Zfp423、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）和CCAAT增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins，C/EBP）α/β的刺激下，脂肪祖细胞分化为骨髓脂肪细胞并表达较低水平的脂肪特异性标志物，包括脂肪酸结合蛋白4、瘦素和脂联素[12]。在绝经后骨质疏松研究中，雌激素撤退所诱发的炎症和氧化应激环境促进成骨细胞群与成脂细胞群之间的正常平衡向成脂分化倾斜，从而威胁骨骼的健康和完整性[12]。虽然目前研究有限，但已有研究证实运动、饮食调整以及雌激素补充等干预措施可通过减弱BMSCs成脂分化作用，从而产生骨骼获益[13]。因此，寻找调控BMSCs成骨分化与成脂分化的关键因子以干预成骨-成脂分化平衡，对于重建骨质结构和维持骨骼功能具有重要意义。目前尚无研究探讨LCA对BMSCs成骨-成脂分化平衡的影响。鉴于此，本研究拟探讨LCA对BMSCs成骨-成脂分化平衡是否存在调控作用，以期为阐明骨质疏松症的发生机制和寻找新的治疗靶点提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
10周龄SPF级C57BL/6J雌性小鼠16只，体质量约22 g，购自南京大学模型动物中心，饲养于四川大学华西科技园动物实验中心。饲养条件：温度（25±2）°C、湿度50%±5%，自由饮水和标准饮食，12 h光照/黑暗周期。经适应性饲养1周后用于实验。
LCA（上海麦克林生化科技股份有限公司）；FBS、青霉素/链霉素、α-MEM培养基（GIBCO公司，美国）；RNA提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Takara公司，日本）；油红O染液（北京索莱宝科技有限公司）；Ⅰ型前胶原氨基端原肽（procollagen Ⅰ N-terminal propeptide，PINP）及β-CTX检测试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司）；β甘油磷酸钠、抗坏血酸、胰岛素、地塞米松、罗格列酮、ALP染色试剂盒（Sigma公司，美国）。
Thermal Cycler PCR仪、LightCycler 96实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（Bio-Rad公司，美国）；正置荧光显微镜（Zeiss公司，美国）；vivaCT80高分辨率微CT（SCANCO Medical公司，瑞士）。
1.2 绝经后骨质疏松动物模型相关观测
1.2.1 模型构建及实验分组
将12只SPF级C57BL/6J雌性小鼠随机分为实验组和对照组，每组6只。实验组小鼠通过背部切口移除卵巢行双侧卵巢切除术，对照组仅移除卵巢周围相同体积脂肪组织。术后小鼠均于相同条件下饲养，每周检测体质量。术后4周注射过量2%戊巴比妥钠处死小鼠，收集小鼠股骨、胫骨、肝脏和血清进行相关分析，观察子宫萎缩情况。
1.2.2 骨量分析
将两组小鼠右侧股骨标本固定于4%多聚甲醛，通过micro-CT进行微结构扫描分析和三维重建。对于松质骨，将生长板下100层松质骨作为感兴趣区域；对于皮质骨，将股骨干中部的100层皮质骨作为感兴趣区域。主要分析参数：骨体积/组织体积（bone volume/tissue volume，BV/TV）、结构模型指数（structure model index，SMI）、骨小梁数目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁间隔（trabecular separation，Tb.Sp）、骨皮质厚度（cortical thickness，Ct.Th）和骨表面/骨体积（bone surface/bone volume，BS/BV）。
1.2.3 骨髓脂肪定量检测
将两组小鼠左侧胫骨标本固定于4%多聚甲醛，经脱钙、清洗、脱水、透明化和包埋，5 μm厚切片，行HE染色观察。采用Image J软件选定骨髓腔区域中骨髓脂肪空泡，并行计数及面积百分比分析。
1.2.4 骨代谢改变观测
取两组小鼠血清样本，采用ELISA法检测骨转换标志物P1NP及β-CTX表达。将标准品及小鼠血清样本50 μL加入50 μL检测液A，37°C孵育1 h后PBS洗板3次，每孔加100 μL检测溶液，相同条件孵育30 min，再次PBS洗板5次。每孔加入90 μL底物溶液，相同条件孵育15 min后加入50 μL终止液，立即于450 nm波长处测定吸光度（A）值，绘制标准曲线并根据logistic曲线拟合计算相应指标浓度。
1.2.5 胆汁酸代谢改变观测
取两组小鼠肝脏样本行RT-qPCR检测。Trizol 法提取肝脏RNA，逆转录获取cDNA后检测胆汁酸代谢关键酶相关基因cyp7a1、cyp7b1、cyp8b1及cyp27a1表达，收集PCR所得样本Ct 值，以β-actin为内参，采用 2–ΔΔCt 方法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of RT-qPCR (5′→3′)
1.3 LCA干预小鼠BMSCs成骨-成脂分化观测
1.3.1 BMSCs分离培养
分离2只10周龄C57BL/6J雌性小鼠股骨和胫骨，采用离心法提取BMSCs并加入完全培养基（含10%FBS和1%青霉素/链霉素的α-MEM培养基）培养，连续传代至第3代用于后续实验。
1.3.2 细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）法检测细胞毒性
将第3代BMSCs细胞悬液以2×104个/孔密度接种于96孔板，培养4 h待细胞贴壁后，分别加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培养基孵育24 h后，更换培养基为含10%CCK-8的完全培养基，分别于孵育1、2、3、4 h时用酶标仪测定450 nm波长处A值。
1.3.3 成骨诱导培养ALP染色观察
将第3代BMSCs接种于6孔板，分别加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培养基干预，待细胞达80%以上融合后行成骨诱导分化培养，成骨培养基为含50 µg/mL维生素C、10 mmol/L β甘油磷酸盐的α-MEM完全培养基，隔2天换液1次。诱导分化7 d，按照ALP染色试剂盒说明书操作行ALP染色观察。
1.3.4 成脂诱导培养油红O染色观察
将第3代BMSCs接种于6孔板，分别加入含0、1、10、100 μmol/L LCA的完全培养基干预，待细胞达80%以上融合后行成脂诱导分化培养。根据分化阶段不同，成脂培养基在加入了含10%FBS和1%青霉素/链霉素的H-DMEM培养基基础上，配方有所差异：第1天10 mg/mL胰岛素、1 μmol/L地塞米松、62.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 mmol/L罗格列酮；第4天10 mg/mL胰岛素、1 mmol/L罗格列酮；第7天10 mg/mL胰岛素。诱导分化7 d行油红O染色观察。
1.3.5 RT-qPCR检测成骨、成脂相关基因表达
取各浓度LCA干预组成骨或成脂诱导分化7 d的细胞，采用RNA提取试剂盒过柱法提取细胞RNA，逆转录获取cDNA后检测成骨细胞相关基因ALP、Runx2、骨钙素（osteocalcin，OCN）以及成脂细胞相关基因脂联素（adiponectin，Adipoq）、脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding protein 4，FABP4）、PPARγ表达，采用 2–ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。
1.4 统计学方法
采用Graphpad-prism统计软件进行分析。计量资料经Shapiro-Wilk正态性检验，均符合正态分布，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；两组多个时间点比较采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser法进行校正，同一组别不同时间点比较采用Bonferroni法，同一时间点不同组别间比较采用多因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 绝经后骨质疏松动物模型相关观测
2.1.1 体质量和子宫萎缩情况分析
术后各时间点两组小鼠体质量均较术前显著上升，且实验组小鼠体质量显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；术后4周实验组小鼠子宫质量为（0.06±0.01）g，较对照组（0.15±0.01）g明显萎缩，差异有统计学意义（t=17.800，P<0.001）。见图1。
图1
两组小鼠体质量和子宫萎缩情况
a. 各时间点体质量比较；b. 术后4周对照组（左）和实验组（右）子宫外观
Figure1. Body mass and uterine atrophy of mice in two groupsa. Comparison of body mass at different time points; b. Postoperative uterine appearance of control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks
2.1.2 骨量分析
micro-CT三维重建示，与对照组比较，术后实验组小鼠骨小梁数量减少且连接稀疏。见图2。其中实验组BV/TV、Tb.N较对照组显著减少，Tb.Sp、SMI显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）；两组Ct.Th和BS/BV比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
图2
术后4周对照组（左）和实验组（右）小鼠micro-CT三维重建
a. 松质骨；b. 皮质骨
Figure2. Micro-CT three-dimensional reconstruction of control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks after operationa. Trabecular bone; b. Cortical bone
表2
术后4周两组小鼠micro-CT三维重建各指标比较（n=6，）
Table2.
Comparison of micro-CT three-dimensional reconstruction indexes between the two groups at 4 weeks after operation (n=6, )
2.1.3 骨髓脂肪定量检测
HE染色示，与对照组相比，实验组胫骨近端的骨髓脂肪细胞数量显著增加，几乎填满了整个骨髓空间（图3）。定量分析示实验组脂肪细胞数量为（170.17±36.24）个/视野、面积百分比为13.75%±3.98%，显著高于对照组 ［分别为（16.17±16.06）个/视野和0.56%±0.65%］，差异有统计学意义（t=9.517，P<0.001；t=8.018，P<0.001）。
图3
术后4周对照组（左）和实验组（右）小鼠胫骨标本HE染色观察
a. ×10；b. ×20
Figure3. HE staining observation of tibia specimens of mice in control group (left) and experimental group (right) at 4 weeks after operationa. ×10; b. ×20
2.1.4 骨代谢及胆汁酸代谢改变观测
血清ELISA检测示实验组小鼠P1NP及β-CTX水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。RT-qPCR检测示，肝脏胆汁酸代谢关键酶基因cyp7a1、cyp8b1及cyp27a1 mRNA相对表达量显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），两组cyp7b1 mRNA相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。
表3
术后4周两组小鼠骨代谢及胆汁酸代谢各指标比较（n=6，）
Table3.
Comparison of indexes of bone metabolism and bile acid metabolism between the two groups at 4 weeks after operation (n=6, )
2.2 LCA干预小鼠BMSCs成骨-成脂分化观测
2.2.1 CCK-8法检测细胞毒性
培养4 h内各浓度（0、1、10、100 μmol/L）LCA干预组A值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图4。
图4
CCK-8法检测各浓度LCA干预组细胞毒性
Figure4.
CCK-8 method for detecting cytotoxicity of LCA intervention groups at different concentrations
2.2.2 LCA干预对BMSCs成骨诱导分化的作用
成骨诱导7 d ALP染色示，与LCA 0 μmol/L干预组比较，1 μmol/L干预组ALP阳性区域无显著变化，10 μmol/L干预组阳性区域稍有减少，而100 μmol/L干预组阳性区域显著减少。RT-qPCR检测示，与LCA 0 μmol/L干预组比较，10 μmol/L和100 μmol/L干预组成骨相关基因ALP、OCN mRNA相对表达量明显下调，100 μmol/L干预组Runx2 mRNA相对表达量明显下调，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图5。
图5
LCA干预对BMSCs成骨诱导分化的作用
a. 成骨诱导7 d ALP染色观察（×10） 从左至右依次为LCA 0、1、10、100 μmol/L 干预组；b. RT-qPCR检测各浓度LCA干预组成骨相关基因表达
Figure5. Effect of LCA intervention on osteogenic differentiation of BMSCsa. ALP staining observation on the 7th day of osteogenic induction (×10) From left to right for 0, 1, 10, and 100 μmol/L LCA intervention groups, respectively; b. The expressions of osteogenic-related genes detected by RT-qPCR
2.2.3 LCA干预对BMSCs成骨诱导分化的作用
成脂诱导7 d油红O染色示，与LCA 0 μmol/L干预组比较，1 μmol/L干预组油红O染色阳性区域无显著变化，10 μmol/L及100 μmol/L干预组阳性区域增加。RT-qPCR检测示10 μmol/L及100 μmol/L干预组成脂相关基因Adipoq、FABP4、PPARγ mRNA相对表达量显著高于0 μmol/L干预组，1 μmol/L干预组FABP4 mRNA相对表达量高于0 μmol/L干预组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图6。
图6
LCA干预对BMSCs成脂诱导分化的作用
a. 成脂诱导7 d油红O染色观察（×10） 从左至右依次为LCA 0、1、10、100 μmol/L 干预组；b. RT-qPCR检测各浓度LCA干预组成脂相关基因表达
Figure6. Effect of LCA intervention on adipogenic differentiation of BMSCsa. Oil red O staining observation on the 7th day of adipogenic induction (×10) From left to right for 0, 1, 10, and 100 μmol/L LCA intervention groups, respectively; b. The expression of adipogenic-related genes detected by RT-qPCR
3 讨论
绝经后骨质疏松是在雌激素撤退后，骨骼的骨形成与骨吸收之间动态平衡遭到破坏，且骨吸收占主导地位，从而引起骨质流失的代谢性疾病。骨髓中含有可分化为成骨细胞及脂肪细胞的BMSCs，以及能分化为破骨细胞的单核细胞/巨噬细胞系，这3种细胞的分化平衡共同参与维持骨稳态[14]。本研究中，雌激素撤退后引起的骨量变化表现为松质骨小梁明显破坏，而皮质骨并未受影响。这种骨量和骨微结构的破坏主要是由破骨能力增强以及其继发的成骨能力增强所造成的高骨转换状态引发，具体体现在骨形成标志物P1NP及骨吸收标志物β-CTX表达的共同上升。近年来，BMSCs在多种病理状态下倾向性分化为骨髓脂肪组织后，在骨微环境及骨重塑中的作用备受关注。本研究结果显示，绝经后骨质疏松小鼠的BMSCs倾向分化为脂肪细胞能力增强，骨髓腔内骨髓脂肪数量明显增加，面积显著扩张。既往研究已证实，骨髓脂肪组织通过分泌许多内分泌因子（即脂肪因子和促炎细胞因子）来抑制成骨细胞，促进破骨细胞功能，从而影响骨稳态[15]。因此，靶向干预BMSCs成骨-成脂分化从而干预骨重塑过程成为研究热点。
关于骨代谢与胆汁酸代谢之间的关联性，已在胆汁淤积性疾病以及骨质疏松疾病模型中得到验证。原发性胆汁性肝硬化患者骨质疏松患病率高达32.5%，而肝功能障碍分级、胆汁淤积严重程度及持续时间被认为是影响骨质流失程度的主要危险因素[16]。尽管具体机制不明，但该病理状态下骨形成降低和骨吸收增强均有报道，其发生机制与维生素D和钙缺乏、骨保护素与OCN不足、IGF-1减少、用药方案选择、遗传易感性，以及胆红素破坏成骨细胞活力和成骨分化、矿化能力相关[17]。
在本研究中，绝经后动物模型胆汁酸经典途径代谢关键酶cyp7a1以及替代途径代谢酶cyp27a1表达明显下调，表明绝经后雌激素撤退的病理模型下，胆汁酸合成代谢整体处于抑制状态。目前，多项基于骨质疏松患者的临床及动物模型实验印证了胆汁酸代谢的改变，因此靶向胆汁酸代谢对于骨代谢的影响成为研究热点[9，16]。刺五加苷与仙灵骨葆胶囊对骨量提升具有积极作用，而这种正向调节被证明是通过调控胆汁酸代谢实现的[17-18]。胆汁酸可以与成骨细胞表达的FXR、TGR5和VDR结合，从而调节成骨。米诺环素治疗后紊乱的肠道菌群改变了循环胆汁酸谱，进而通过破坏肠道/肝脏胆汁酸轴以衰减FXR依赖性信号的方式抑制成骨细胞分化[19]。FXR敲除鼠的成骨潜力遭到损害，破骨能力提升，并且可能伴随成脂分化能力增强；而鹅去氧胆酸作为FXR激动剂可上调成骨相关转录因子Runx2，并增强细胞外信号调节激酶以及β-连环蛋白信号传导以促进成骨分化，并同时抑制成脂分化和破骨分化发生[19-20]。敲除TGR5对于青年及成年小鼠的骨量无明显影响，而在老年及去卵巢小鼠中则呈现出明显骨量丢失，可能归因于Amp活化蛋白激酶信号通路表达增强而引起的破骨生成增加[21]。TGR5的激活还能促进Runx2的表达，增强ALP活性、细胞外基质矿化和成骨细胞基因（如ALP、OCN和Osterix）的表达，而FXR及TGR5的单向及双向激动剂均具有抑制破骨分化的效益[22-23]。牛磺熊去氧胆酸是一种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的用于治疗慢性胆汁淤积性肝病的亲水胆汁酸，已被证明可以治疗去卵巢小鼠的骨量丢失。牛磺熊去氧胆酸给药后，股骨远端骨小梁结构保留增多，总骨体积、骨密度、骨体积百分比等指标较对照组有显著改善，因此牛磺熊去氧胆酸除治疗胆汁淤积外，可能对其并发的骨质流失具有重要意义[24]。由此可见，靶向胆汁酸代谢及其受体对于调控骨代谢具有重要意义。
异常的BMSCs谱系分化是绝经后骨质疏松发病机制之一，增加的骨髓脂肪组织积累以牺牲骨形成为代价，并损害成骨再生和造血功能[25]。鉴于既往研究报道绝经后骨质疏松模型中LCA水平呈显著变化[10]，本研究选用LCA进一步探讨其对BMSCs谱系分化是否具有干扰作用，结果显示LCA干预后成骨分化转录因子Runx2以及成骨特异性基质蛋白ALP、OCN的基因表达明显下调，提示LCA对于BMSCs的成骨分化有损害作用。这与既往有关LCA对于成骨细胞系（小鼠骨样细胞MLO-Y4和MLO-A5，人成骨肉瘤细胞Saos-2）的成骨分化负性作用结果一致。而这种作用可能主要是通过破坏抗凋亡基因B淋巴细胞瘤2基因（B-cell lymphoma 2，BCL-2）和促凋亡基因BCL-2相关X蛋白的表达平衡来直接损害成骨细胞系的成骨潜力，但具体机制不明[24-25]。在LCA干预Saos-2细胞系的实验中，成骨生成相关基因ALP和BMP的表达显著降低，伴随着破骨分化相关NF-κB配体受体激活剂和降钙素受体表达上调，代表着LCA对于成骨生成以及破骨生成的双重调节作用[26]。此外，上述研究发现熊去氧胆酸在一定程度上可以中和LCA对成骨细胞的毒性作用，表明熊去氧胆酸作为胆汁淤积性疾病的一线治疗药物可能对并发的骨质疏松产生额外骨骼获益[24-25]。作为VDR低亲和力配体，LCA还可以竞争性激活VDR，从而降低维生素D对于成骨细胞的OCN及NF-κB配体的表达刺激作用[27]。在维生素D缺乏情况下，LCA通过调节肠道吸收和骨骼动员来增加血清钙，但血清钙、磷的增加也可能进一步加重慢性肾脏病的血管钙化[26-27]。本研究首次表明LCA对BMSCs成脂分化具有促进作用，经过LCA干预后，成脂相关转录因子PPARγ以及脂肪相关内源性细胞因子FABP4和Adipoq表达显著增加，表明BMSCs倾向性分化为骨髓脂肪细胞的能力增强。虽然具体机制不明，但我们分析激活FXR-PPARγ信号通路促进脂肪细胞分化可能是其作用机制之一[28]。此外，作为TGR5的重要激动剂，既往研究发现LCA抑制破骨分化的功能可能通过TGR5及其下游腺苷酸活化蛋白激酶信号通路实现[21]。因此，LCA对于骨代谢的调节作用是多方面的，包括调控成骨分化、成脂分化、破骨分化及机体钙磷平衡，但具体机制尚不明确。
综上述，本研究结果提示LCA具有干扰BMSCs成骨-成脂分化的作用，从而对骨稳态产生潜在有害影响；未来靶向LCA代谢及其受体的深入研究将为骨质疏松的预防及治疗提供新思路。然而，本研究尚有一定局限性，亟待通过靶向胆汁酸代谢组的高通量测序和在体小鼠的LCA干预为实验假说提供有力证据，以及深入探讨LCA对于成骨-成脂分化平衡的具体作用机制也具有重要意义。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突；基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道
伦理声明 研究方案经四川大学华西医院伦理委员会批准（202303023001）；实验动物使用许可证号：SYXK（川）2021-0248
作者贡献声明 王翠：文章撰写、研究实施；李姣：研究实施；刘璐：数据分析及绘图；鲁凌云：研究设计；余希杰：审校文章，基金支持
