引用本文： 谢慧锋, 周伟, 白波, 张姝江. 软骨组织工程中种子细胞接种密度和比例的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2022, 36(4): 470-478. doi: 10.7507/1002-1892.202110091 复制
关节软骨缺少血管、神经，营养主要来源于关节液，损伤后难以自我修复，从而导致骨关节炎的发生[1]。自然条件下损伤软骨由纤维瘢痕组织修复[2]，不能达到天然软骨力学特性。目前，骨关节炎的治疗一般采用关节腔内注射、微骨折、软骨移植等方法，但均存在很大局限性，且效果不佳，患者最终仍不可避免需要接受关节置换手术[3-7]。
软骨组织工程技术是目前针对软骨缺损的一项有前景的治疗技术[8]，其核心包括支架、种子细胞、生长因子三要素。其中，支架需要具备一定机械力学特性、生物相容性和可降解性，以及一定的孔径和孔隙率，为细胞生长及营养物质运输提供足够空间[8-9]。关节软骨细胞（articular chondrocytes，ACHs）是软骨组织工程中应用最早与研究最多的种子细胞。1999年Brittberg等[10]就报道了运用局部注射自体ACHs的方法，成功修复了膝关节骨关节炎患者的软骨缺损。但ACHs面临着细胞来源少、获取时会造成供区软骨缺损[11-13]、在体外单层扩增后容易出现去分化的问题[14-17]。软骨组织工程中另一种常用的种子细胞是BMSCs。BMSCs具有来源广、扩增快，并且多次传代后仍具有多向分化能力的优点，在ACHs来源紧缺的情况下，上述优势更为突出[12，18]。
软骨组织工程中，确定种子细胞种类后还需选择适宜的细胞接种密度。如种子细胞接种密度过高，可能由于营养不足使单个细胞分泌基质的能力下降[19-21]，同时会延长细胞体外培养扩增周期，导致细胞发生去分化[14，19-21]；而细胞接种密度过低，则会减少细胞间联系，不利于细胞分化及软骨特异性细胞外基质的合成分泌[22-27]。此外，即使种子细胞的接种密度相同，种子细胞的比例不同或支架材料不同，最终细胞外基质的分泌情况也有差异[28]。本文将从种子细胞的接种密度和比例两方面对ACHs和BMSCs在三维支架中培养的研究作一综述，以期为构建组织工程软骨提供参考。
1 正常软骨的分层结构
宏观上看似质地均匀的软骨组织实际上呈分层结构，每层结构的细胞形态和纤维排列方向都不相同。ACHs是软骨中唯一存在的细胞，呈密度梯度分布，其密度为（7.1±2.1）×106～（24.0±7.5）×106个/cm3，越接近软骨表面细胞密度越大[29]。关节软骨表层ACHs占细胞总数的10%～20%，其呈扁平状，平行于关节面排列；细胞外基质含大量Ⅱ型胶原（collagen type Ⅱ，ColⅡ），其排列方向与ACHs相似，平行于关节面有利于抵抗摩擦力和剪切力。中间层占40%～60%，ACHs呈球形，Col Ⅱ无定向网状交织，纤维直径和蛋白多糖含量逐渐增加。深层占30%～40%，ACHs呈柱状，蛋白多糖含量最高而ColⅡ含量少，胶原纤维方向与关节面垂直，有利于抵抗机械压力。钙化层约占5%，分布稀疏的ACHs肥大化分泌Ⅹ型胶原（collagen type Ⅹ，ColⅩ）[1，30-32]。钙化层的胶原纤维把软骨固定于软骨下骨。
2 不同接种密度ACHs在三维结构中的研究
为了改进ACHs修复软骨缺损的方法，许多学者开始探究包括接种细胞密度、支架材料、培养条件等因素的影响（表1）。Mauck等[33]将ACHs以接近或大于天然软骨中细胞的密度接种于琼脂糖凝胶中培养9周，并加以动态力学刺激。结果表明相对于天然ACHs密度，更高的细胞接种密度可产生更多胶原和糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）。加以力学刺激后的新生软骨组织虽然更薄，但具有更强的机械特性。
表1
不同接种密度的ACHs在三维结构中的研究
Table1.
Researches of different seeding densities of ACHs in three-dimensional scaffolds
随后Saini等[34]研究发现，在左旋聚乳酸 ［poly（L-lactic acid），PLLA］ 支架上的GAG和胶原沉积量也受ACHs接种密度的影响；另外，随着受到的剪切应力增加，胶原合成增多而GAG沉积减少。对于更低密度的研究，Iwasa等[35]将兔ACHs以0.2×106、2×106、20×106个/mL密度接种于去端胶原蛋白凝胶中培养4周，结果显示低密度接种的ACHs虽然增殖能力强，但分泌的硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）总量较少，新生软骨结构的硬度也不如高密度接种组。Moretti等[36]探索了在三维结构中培养的ACHs在体内成软骨能力，将人ACHs于体外扩增后，以13×106个/mL和76×106个/mL密度接种于透明质酸支架上，最后植入小鼠背部皮下。结果显示，无论是体内或体外，高密度ACHs都能合成总量更多的GAG和ColⅡ及更少的ColⅠ，同时新生软骨结构具有更好的生物力学特性。Williams等[37]、Mahmoudifar等[38]分别将ACHs接种于海藻酸盐与聚乙醇酸支架中培养，得到了类似结论。另外有学者发现，即使是种子细胞接种密度在（30～60）×106个/mL之间，软骨的机械特性也有显著差异，高密度组总体表现出更好的机械特性[44，47]。然而，也有学者研究表明，ACHs的接种密度并非越高越好。Cui等[45]首次报道了ACHs加以TGF-β1和FGF-2刺激后，单个细胞成软骨能力的GAG/DNA比值与ColⅡ/DNA比值在低密度接种组更高。Mesallati等[19]的研究将ACHs接种密度从30×106个/mL增加至136×106个/mL后，单个细胞合成GAG和ColⅡ的能力反而下降，ACHs接种密度过高不利于单个细胞合成细胞外基质。因此推测ACHs的最佳接种密度可能在较低水平。
除了对细胞外基质的检测，不同接种密度ACHs的基因表达水平也逐渐成为学者们关注的焦点。Wang等[39]报道将ACHs以2×106个/mL与20×106个/mL两种密度接种于丝素蛋白支架上培养，3周后高密度组的聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、ColⅡ、Y染色体性别决定区相关高迁移率族框9 ［SRY（sex-determining region Y）-related high-mobility group box，SOX9］ 基因的转录水平及ColⅡ/ ColⅠ基因转录水平的比值均显著高于低密度组，且与ACHs肥大化相关的ColⅩ基因转录水平更低。组织染色与ColⅡ免疫组织化学染色结果与ColⅡ基因转录水平相一致，表明细胞高密度接种有利于软骨形成。Cao等[14]通过对比不同接种密度和不同代次的ACHs基因表达水平和在体内成软骨情况，发现高密度接种与三维结构培养均有利于软骨特异性基因的表达及软骨形成。
近年来，生物打印技术成为软骨组织工程热点。Ren等[46]利用生物打印技术构建了具有仿生细胞密度梯度的ColⅡ水凝胶复合结构，结果显示，细胞分布模式和总细胞密度会影响细胞外基质的合成；在第2～3周，中细胞密度组的GAG含量接近高密度组，但单个细胞合成GAG的效率更高。Lam等[48]发现了甲基丙烯酸化明胶（methacrylated gelatin，GelMA）与甲基丙烯酸化透明质酸（methacrylated hyaluronic acid，HAMA）构建的水凝胶在种子细胞密度为5×106 个/mL时几乎不分泌ColⅡ；但种子细胞密度提高至25×106个/mL时情况改善，同时Ⅱ型胶原α1链基因（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）和Aggrecan基因的表达水平也得到提高。此外，ACHs在GelMA中ColⅠ基因的表达水平始终较高，说明GelMA可能不是最适合软骨组织工程的支架材料。
3 不同接种密度BMSCs在三维结构中的研究
BMSCs具有很强的体外扩增能力和多向分化能力，且来源广泛，可多次反复从骨髓中获取而不造成供区组织缺损[12，18]。但目前还未能实现完全控制BMSCs在体内、外的分化，即分化后的BMSCs未完全具备成熟ACHs分泌基质的能力，导致形成的软骨结构力学性能不理想[18，49]。考虑到由BMSCs接种密度不同所造成的影响，20多年来学者们设计了BMSCs的不同细胞密度分组实验，以探究最终的成软骨效果（表2）。Ponticiello等[20]将BMSCs以（3～48）×106个/mL密度接种于明胶海绵支架上，并在添加有TGF-β3的培养基中培养21 d，结果显示，当细胞初始密度达12×106个/mL后，支架上GAG的含量不再随细胞密度增加而增加，GAG/DNA比值反而减小。表明在支架上过高的细胞密度会抑制细胞分泌基质的功能，这点与ACHs情况类似。然而，该实验并未对比不同细胞密度间的胶原成分，尚不能推断12×106个/mL就是BMSCs的最优接种密度。Kavalkovich等[21]发现在细胞接种密度为25×106 个/mL时GAG合成总量及GAG/DNA比值最大；即使增加培养基体积，更高接种密度的BMSCs也会出现合成GAG的能力下降。考虑到支架孔径影响细胞增殖及营养物质渗透，Bean等[56]对比了不同接种密度的BMSCs在不同直径大小聚己内酯 ［poly（ε-caprolactone），PCL］ 纤维支架上分泌合成的表现，发现纤维直径较大的支架具有更大孔径，更适合细胞增殖与分泌细胞外基质；第6周时最高细胞接种密度组（4×106个/mL）的ColⅠ基因表达水平较低，而ColⅡ基因表达水平最高，相应的ColⅡ分泌总量也最多；Aggrecan基因的表达量虽然稍低于中等细胞接种密度组，但仍能产生最多的GAG总量。除了营养限制以外，还有其他重要因素影响高密度BMSCs分泌基质的能力。Buxton等[53]认为导致高密度BMSCs出现单个细胞分泌基质减少，是营养不足和细胞旁分泌、自分泌反馈调节的结果。该研究结果与Kavalkovich等[21]的报道结论一致，当聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 ［poly（ethylene glycol）dimethacrylate，PEGDA］ 水凝胶中的细胞密度为25×106个/mL时，每个细胞和每个整体结构之间的基质产量达到最优平衡，这个密度也接近天然膝关节软骨中的细胞密度。相比ACHs，BMSCs的扩增能力强，而且不容易出现去分化。有学者认为BMSCs不需要较高的接种密度，也能得到较好的成软骨效果。Hui等[51]的研究结果显示，细胞接种密度达5×106 个/mL时，GAG的含量和GAG/DNA比值均与细胞接种密度成正相关。Pustlauk等[57]认为在H-DMEM和0.125%BSA培养条件下，接种密度为2.4×106个/mL的BMSCs在水母胶原支架中的成软骨标志物水平最高，细胞外基质沉积效果最好。此密度足以让BMSCs在支架中成软骨分化。
表2
不同接种密度BMSCs在三维结构中的研究
Table2.
Researches of different seeding densities of BMSCs in three-dimensional scaffolds
BMSCs的基因表达水平反映了自身分化情况，同样值得关注。Huang等[50]比较了接种密度为3×106、6×106、9×106个/mL的BMSCs在琼脂糖中培养3周后的结果，发现在存在TGF-β3的条件下，随着细胞接种密度增加，ColⅡ基因表达水平逐渐增高；只有达到9×106个/mL接种密度的细胞才表达Aggrecan基因；TGF-β3在上述基因的表达水平对相关基质的合成起促进作用。2009年Li等[52]发现ColⅠ微球中，细胞接种密度达1×106个/mL组的ColⅡ和Aggrecan基因表达水平最高，GAG含量最多，但此细胞密度组已经出现GAG/DNA值下降。
由于BMSCs形成软骨需要向ACHs分化，大部分学者倾向于在培养基中添加外源性细胞因子，以促进这个过程。然而，Zhang等[54]发现即使不添加外源性细胞因子，ColⅠ支架也可诱导BMSCs向ACHs分化。提高细胞的接种密度可提高BMSCs的SOX9、ColⅡ与Aggrecan基因表达水平和成软骨能力。Li等[58]的研究结果与Zhang等[54]的报道一致，在支架中加入ColⅠ也可促进BMSCs成软骨分化。因此高密度接种的BMSCs具有更明显的软骨表型和成软骨能力。
已有文献报道，组织工程软骨的生物力学特性尚未能达到研究者预期的标准[61]，仍需继续探索改进方法。Sun等[59]的研究表明在聚D，L-乳酸/聚乙二醇/聚D，L-乳酸水凝胶中，20×106个/mL组和50×106个/mL组的新生软骨机械强度在培养第8周后比培养第4周时稍减弱，但总GAG和羟脯氨酸沉积量显著高于4×106个/mL组和8×106个/mL组，而20×106个/mL组单个细胞分泌基质的效率更高。Kim等[60]发现增加HAMA水凝胶中BMSCs的接种密度，会使新生软骨力学特性增强，软骨细胞外基质的含量增多，但会使水凝胶体积收缩，可能是细胞黏附并牵拉材料所致，最终构建的组织工程软骨大小与预期有一定差距。
4 BMSCs和ACHs在三维结构中共培养
BMSCs和ACHs共培养的目的在于减少所需ACHs的数量与探索两种细胞间是否有协同形成软骨的作用。既往学者们猜测ACHs可诱导BMSCs向ACHs分化。虽然成软骨培养基可诱导BMSCs表达软骨特异性基因，但Wu等[62-63]通过荧光蛋白标记的方法，证实了在共培养中BMSCs促进软骨形成的机制并非通过向ACHs分化，而是通过营养作用刺激ACHs增殖和分泌基质。其作用机制是BMSCs可合成多种细胞因子，通过旁分泌、形成细胞外囊泡与膜纳米管作用于周围细胞[64]。Levorson等[23]把牛ACHs与兔BMSCs以1∶0、1∶1、1∶3、1∶5与0∶1的比例混合，并调节成1.75×106个/mL和3.5×106个/mL两种密度接种于PCL支架上，共培养3周后，1∶1比例组共培养产生的胶原总量少于纯ACHs组（1∶0组），但显著多于其他比例组；此外，按照1∶1比例共培养，低接种密度与高接种密度结果无显著差异。但此研究中细胞密度分组少，事实上可能存在更优的细胞接种密度范围。遗憾的是，设计有多个细胞接种密度的ACHs和BMSCs三维共培养的研究寥寥无几，至今学者们探索更多的是这两种细胞按照不同比例共培养的成软骨作用（表3）。Mo等[24]将兔ACHs和人BMSCs以1∶0、2∶1、1∶1、1∶2和0∶1比例混合接种于海藻酸盐水凝胶中培养，结果发现随培养时间延长和BMSCs比例增大，合成GAG和ColⅡ的量相应增多；直至第28天，1∶2组合成GAG和ColⅡ的量显著多余其他比例组，且与纯ACHs组（1∶0组）相当，而纯BMSC组（0∶1组）最少。ColⅡ/ColⅠ基因表达水平比值与之类似，不同的是纯ACHs组（1∶0组）的ColⅡ基因表达水平显著高于其他各组。还值得注意的是，检测发现共培养中的人BMSCs不表达人特异性ColⅡ基因，因此推测共培养中的BMSCs未直接参与软骨形成。Meretoja等[25]的研究结果表明，原代ACHs的成软骨能力强于传代后的ACHs。此外相比纯ACHs组（1∶0），共培养组（ACHs∶BMSCs为1∶1和1∶3）能产生接近甚至更好的成软骨效果，从而减少原代ACHs的需求量。Ko等[26]发现ACHs与BMSCs比例为1∶4时，Aggrecan和ColⅡ基因表达水平更高。Sabatino等[27]将含有不同细胞比例的共培养结构进行了体内外实验，体外实验显示ACHs与BMSCs比例为25∶75组的成软骨能力强，且较接近纯ACHs组（1∶0 组）；而相对于直接植入裸鼠皮下培养8周，预先在体外培养2周后再植入体内培养6周的成软骨能力更强，其中以5∶95组最为显著。上述研究结果显示，目前在三维支架中BMSCs单独应用时重建软骨的能力尚不如ACHs，但将BMSCs与ACHs共培养可在一定程度上减少所需ACHs的需求量，同时达到接近甚至优于单独应用 ACHs 时的效果。此外BMSCs来源广，易获取，并随着对诱导和培养条件的探索和改进，BMSCs仍是一种很有前景的种子细胞。但两种细胞共培养的最优比例与接种密度仍需更进一步探索。
表3
BMSCs和ACHs在三维结构中共培养相关研究
Table3.
Researches of co-culture of BMSC and ACHs in three-dimensional scaffolds
5 小结与展望
目前关于三维结构中构建组织工程软骨的实验研究中，所设计的细胞接种密度分组较少，密度范围窄，可能没有包含实际最合适的细胞接种密度。此外，构建组织工程软骨的最终效果还受到支架材料特性、种子细胞状态、生长因子等诸多因素的影响，目前很难得出一个普遍适用的细胞密度标准，但这并不代表我们可以不用关注种子细胞的接种密度，选择适宜的种子细胞接种密度对构建组织工程软骨仍具有重大意义。种子细胞接种密度过低会导致细胞外基质总量少，形成的软骨生物力学特性差，并且会减少细胞间的联系，不利于BMSCs的分化；密度过高会延长细胞体外扩增时间，对ACHs而言还会导致去分化、合成软骨特异性基质的能力减弱；因此需要考虑如何取得平衡。在共培养中选择适宜的种子细胞比例，可减少所需ACHs的数量及传代次数，从而保持ACHs表型，最终提高构建组织工程软骨的效率。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突
作者贡献声明 张姝江、白波：综述构思及设计、论文审校；谢慧锋：观点形成、资料收集及文章撰写；周伟：文献收集
关节软骨缺少血管、神经，营养主要来源于关节液，损伤后难以自我修复，从而导致骨关节炎的发生[1]。自然条件下损伤软骨由纤维瘢痕组织修复[2]，不能达到天然软骨力学特性。目前，骨关节炎的治疗一般采用关节腔内注射、微骨折、软骨移植等方法，但均存在很大局限性，且效果不佳，患者最终仍不可避免需要接受关节置换手术[3-7]。
软骨组织工程技术是目前针对软骨缺损的一项有前景的治疗技术[8]，其核心包括支架、种子细胞、生长因子三要素。其中，支架需要具备一定机械力学特性、生物相容性和可降解性，以及一定的孔径和孔隙率，为细胞生长及营养物质运输提供足够空间[8-9]。关节软骨细胞（articular chondrocytes，ACHs）是软骨组织工程中应用最早与研究最多的种子细胞。1999年Brittberg等[10]就报道了运用局部注射自体ACHs的方法，成功修复了膝关节骨关节炎患者的软骨缺损。但ACHs面临着细胞来源少、获取时会造成供区软骨缺损[11-13]、在体外单层扩增后容易出现去分化的问题[14-17]。软骨组织工程中另一种常用的种子细胞是BMSCs。BMSCs具有来源广、扩增快，并且多次传代后仍具有多向分化能力的优点，在ACHs来源紧缺的情况下，上述优势更为突出[12，18]。
软骨组织工程中，确定种子细胞种类后还需选择适宜的细胞接种密度。如种子细胞接种密度过高，可能由于营养不足使单个细胞分泌基质的能力下降[19-21]，同时会延长细胞体外培养扩增周期，导致细胞发生去分化[14，19-21]；而细胞接种密度过低，则会减少细胞间联系，不利于细胞分化及软骨特异性细胞外基质的合成分泌[22-27]。此外，即使种子细胞的接种密度相同，种子细胞的比例不同或支架材料不同，最终细胞外基质的分泌情况也有差异[28]。本文将从种子细胞的接种密度和比例两方面对ACHs和BMSCs在三维支架中培养的研究作一综述，以期为构建组织工程软骨提供参考。
1 正常软骨的分层结构
宏观上看似质地均匀的软骨组织实际上呈分层结构，每层结构的细胞形态和纤维排列方向都不相同。ACHs是软骨中唯一存在的细胞，呈密度梯度分布，其密度为（7.1±2.1）×106～（24.0±7.5）×106个/cm3，越接近软骨表面细胞密度越大[29]。关节软骨表层ACHs占细胞总数的10%～20%，其呈扁平状，平行于关节面排列；细胞外基质含大量Ⅱ型胶原（collagen type Ⅱ，ColⅡ），其排列方向与ACHs相似，平行于关节面有利于抵抗摩擦力和剪切力。中间层占40%～60%，ACHs呈球形，Col Ⅱ无定向网状交织，纤维直径和蛋白多糖含量逐渐增加。深层占30%～40%，ACHs呈柱状，蛋白多糖含量最高而ColⅡ含量少，胶原纤维方向与关节面垂直，有利于抵抗机械压力。钙化层约占5%，分布稀疏的ACHs肥大化分泌Ⅹ型胶原（collagen type Ⅹ，ColⅩ）[1，30-32]。钙化层的胶原纤维把软骨固定于软骨下骨。
2 不同接种密度ACHs在三维结构中的研究
为了改进ACHs修复软骨缺损的方法，许多学者开始探究包括接种细胞密度、支架材料、培养条件等因素的影响（表1）。Mauck等[33]将ACHs以接近或大于天然软骨中细胞的密度接种于琼脂糖凝胶中培养9周，并加以动态力学刺激。结果表明相对于天然ACHs密度，更高的细胞接种密度可产生更多胶原和糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）。加以力学刺激后的新生软骨组织虽然更薄，但具有更强的机械特性。
表1
不同接种密度的ACHs在三维结构中的研究
Table1.
Researches of different seeding densities of ACHs in three-dimensional scaffolds
随后Saini等[34]研究发现，在左旋聚乳酸 ［poly（L-lactic acid），PLLA］ 支架上的GAG和胶原沉积量也受ACHs接种密度的影响；另外，随着受到的剪切应力增加，胶原合成增多而GAG沉积减少。对于更低密度的研究，Iwasa等[35]将兔ACHs以0.2×106、2×106、20×106个/mL密度接种于去端胶原蛋白凝胶中培养4周，结果显示低密度接种的ACHs虽然增殖能力强，但分泌的硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）总量较少，新生软骨结构的硬度也不如高密度接种组。Moretti等[36]探索了在三维结构中培养的ACHs在体内成软骨能力，将人ACHs于体外扩增后，以13×106个/mL和76×106个/mL密度接种于透明质酸支架上，最后植入小鼠背部皮下。结果显示，无论是体内或体外，高密度ACHs都能合成总量更多的GAG和ColⅡ及更少的ColⅠ，同时新生软骨结构具有更好的生物力学特性。Williams等[37]、Mahmoudifar等[38]分别将ACHs接种于海藻酸盐与聚乙醇酸支架中培养，得到了类似结论。另外有学者发现，即使是种子细胞接种密度在（30～60）×106个/mL之间，软骨的机械特性也有显著差异，高密度组总体表现出更好的机械特性[44，47]。然而，也有学者研究表明，ACHs的接种密度并非越高越好。Cui等[45]首次报道了ACHs加以TGF-β1和FGF-2刺激后，单个细胞成软骨能力的GAG/DNA比值与ColⅡ/DNA比值在低密度接种组更高。Mesallati等[19]的研究将ACHs接种密度从30×106个/mL增加至136×106个/mL后，单个细胞合成GAG和ColⅡ的能力反而下降，ACHs接种密度过高不利于单个细胞合成细胞外基质。因此推测ACHs的最佳接种密度可能在较低水平。
除了对细胞外基质的检测，不同接种密度ACHs的基因表达水平也逐渐成为学者们关注的焦点。Wang等[39]报道将ACHs以2×106个/mL与20×106个/mL两种密度接种于丝素蛋白支架上培养，3周后高密度组的聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、ColⅡ、Y染色体性别决定区相关高迁移率族框9 ［SRY（sex-determining region Y）-related high-mobility group box，SOX9］ 基因的转录水平及ColⅡ/ ColⅠ基因转录水平的比值均显著高于低密度组，且与ACHs肥大化相关的ColⅩ基因转录水平更低。组织染色与ColⅡ免疫组织化学染色结果与ColⅡ基因转录水平相一致，表明细胞高密度接种有利于软骨形成。Cao等[14]通过对比不同接种密度和不同代次的ACHs基因表达水平和在体内成软骨情况，发现高密度接种与三维结构培养均有利于软骨特异性基因的表达及软骨形成。
近年来，生物打印技术成为软骨组织工程热点。Ren等[46]利用生物打印技术构建了具有仿生细胞密度梯度的ColⅡ水凝胶复合结构，结果显示，细胞分布模式和总细胞密度会影响细胞外基质的合成；在第2～3周，中细胞密度组的GAG含量接近高密度组，但单个细胞合成GAG的效率更高。Lam等[48]发现了甲基丙烯酸化明胶（methacrylated gelatin，GelMA）与甲基丙烯酸化透明质酸（methacrylated hyaluronic acid，HAMA）构建的水凝胶在种子细胞密度为5×106 个/mL时几乎不分泌ColⅡ；但种子细胞密度提高至25×106个/mL时情况改善，同时Ⅱ型胶原α1链基因（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）和Aggrecan基因的表达水平也得到提高。此外，ACHs在GelMA中ColⅠ基因的表达水平始终较高，说明GelMA可能不是最适合软骨组织工程的支架材料。
3 不同接种密度BMSCs在三维结构中的研究
BMSCs具有很强的体外扩增能力和多向分化能力，且来源广泛，可多次反复从骨髓中获取而不造成供区组织缺损[12，18]。但目前还未能实现完全控制BMSCs在体内、外的分化，即分化后的BMSCs未完全具备成熟ACHs分泌基质的能力，导致形成的软骨结构力学性能不理想[18，49]。考虑到由BMSCs接种密度不同所造成的影响，20多年来学者们设计了BMSCs的不同细胞密度分组实验，以探究最终的成软骨效果（表2）。Ponticiello等[20]将BMSCs以（3～48）×106个/mL密度接种于明胶海绵支架上，并在添加有TGF-β3的培养基中培养21 d，结果显示，当细胞初始密度达12×106个/mL后，支架上GAG的含量不再随细胞密度增加而增加，GAG/DNA比值反而减小。表明在支架上过高的细胞密度会抑制细胞分泌基质的功能，这点与ACHs情况类似。然而，该实验并未对比不同细胞密度间的胶原成分，尚不能推断12×106个/mL就是BMSCs的最优接种密度。Kavalkovich等[21]发现在细胞接种密度为25×106 个/mL时GAG合成总量及GAG/DNA比值最大；即使增加培养基体积，更高接种密度的BMSCs也会出现合成GAG的能力下降。考虑到支架孔径影响细胞增殖及营养物质渗透，Bean等[56]对比了不同接种密度的BMSCs在不同直径大小聚己内酯 ［poly（ε-caprolactone），PCL］ 纤维支架上分泌合成的表现，发现纤维直径较大的支架具有更大孔径，更适合细胞增殖与分泌细胞外基质；第6周时最高细胞接种密度组（4×106个/mL）的ColⅠ基因表达水平较低，而ColⅡ基因表达水平最高，相应的ColⅡ分泌总量也最多；Aggrecan基因的表达量虽然稍低于中等细胞接种密度组，但仍能产生最多的GAG总量。除了营养限制以外，还有其他重要因素影响高密度BMSCs分泌基质的能力。Buxton等[53]认为导致高密度BMSCs出现单个细胞分泌基质减少，是营养不足和细胞旁分泌、自分泌反馈调节的结果。该研究结果与Kavalkovich等[21]的报道结论一致，当聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 ［poly（ethylene glycol）dimethacrylate，PEGDA］ 水凝胶中的细胞密度为25×106个/mL时，每个细胞和每个整体结构之间的基质产量达到最优平衡，这个密度也接近天然膝关节软骨中的细胞密度。相比ACHs，BMSCs的扩增能力强，而且不容易出现去分化。有学者认为BMSCs不需要较高的接种密度，也能得到较好的成软骨效果。Hui等[51]的研究结果显示，细胞接种密度达5×106 个/mL时，GAG的含量和GAG/DNA比值均与细胞接种密度成正相关。Pustlauk等[57]认为在H-DMEM和0.125%BSA培养条件下，接种密度为2.4×106个/mL的BMSCs在水母胶原支架中的成软骨标志物水平最高，细胞外基质沉积效果最好。此密度足以让BMSCs在支架中成软骨分化。
表2
不同接种密度BMSCs在三维结构中的研究
Table2.
Researches of different seeding densities of BMSCs in three-dimensional scaffolds
BMSCs的基因表达水平反映了自身分化情况，同样值得关注。Huang等[50]比较了接种密度为3×106、6×106、9×106个/mL的BMSCs在琼脂糖中培养3周后的结果，发现在存在TGF-β3的条件下，随着细胞接种密度增加，ColⅡ基因表达水平逐渐增高；只有达到9×106个/mL接种密度的细胞才表达Aggrecan基因；TGF-β3在上述基因的表达水平对相关基质的合成起促进作用。2009年Li等[52]发现ColⅠ微球中，细胞接种密度达1×106个/mL组的ColⅡ和Aggrecan基因表达水平最高，GAG含量最多，但此细胞密度组已经出现GAG/DNA值下降。
由于BMSCs形成软骨需要向ACHs分化，大部分学者倾向于在培养基中添加外源性细胞因子，以促进这个过程。然而，Zhang等[54]发现即使不添加外源性细胞因子，ColⅠ支架也可诱导BMSCs向ACHs分化。提高细胞的接种密度可提高BMSCs的SOX9、ColⅡ与Aggrecan基因表达水平和成软骨能力。Li等[58]的研究结果与Zhang等[54]的报道一致，在支架中加入ColⅠ也可促进BMSCs成软骨分化。因此高密度接种的BMSCs具有更明显的软骨表型和成软骨能力。
已有文献报道，组织工程软骨的生物力学特性尚未能达到研究者预期的标准[61]，仍需继续探索改进方法。Sun等[59]的研究表明在聚D，L-乳酸/聚乙二醇/聚D，L-乳酸水凝胶中，20×106个/mL组和50×106个/mL组的新生软骨机械强度在培养第8周后比培养第4周时稍减弱，但总GAG和羟脯氨酸沉积量显著高于4×106个/mL组和8×106个/mL组，而20×106个/mL组单个细胞分泌基质的效率更高。Kim等[60]发现增加HAMA水凝胶中BMSCs的接种密度，会使新生软骨力学特性增强，软骨细胞外基质的含量增多，但会使水凝胶体积收缩，可能是细胞黏附并牵拉材料所致，最终构建的组织工程软骨大小与预期有一定差距。
4 BMSCs和ACHs在三维结构中共培养
BMSCs和ACHs共培养的目的在于减少所需ACHs的数量与探索两种细胞间是否有协同形成软骨的作用。既往学者们猜测ACHs可诱导BMSCs向ACHs分化。虽然成软骨培养基可诱导BMSCs表达软骨特异性基因，但Wu等[62-63]通过荧光蛋白标记的方法，证实了在共培养中BMSCs促进软骨形成的机制并非通过向ACHs分化，而是通过营养作用刺激ACHs增殖和分泌基质。其作用机制是BMSCs可合成多种细胞因子，通过旁分泌、形成细胞外囊泡与膜纳米管作用于周围细胞[64]。Levorson等[23]把牛ACHs与兔BMSCs以1∶0、1∶1、1∶3、1∶5与0∶1的比例混合，并调节成1.75×106个/mL和3.5×106个/mL两种密度接种于PCL支架上，共培养3周后，1∶1比例组共培养产生的胶原总量少于纯ACHs组（1∶0组），但显著多于其他比例组；此外，按照1∶1比例共培养，低接种密度与高接种密度结果无显著差异。但此研究中细胞密度分组少，事实上可能存在更优的细胞接种密度范围。遗憾的是，设计有多个细胞接种密度的ACHs和BMSCs三维共培养的研究寥寥无几，至今学者们探索更多的是这两种细胞按照不同比例共培养的成软骨作用（表3）。Mo等[24]将兔ACHs和人BMSCs以1∶0、2∶1、1∶1、1∶2和0∶1比例混合接种于海藻酸盐水凝胶中培养，结果发现随培养时间延长和BMSCs比例增大，合成GAG和ColⅡ的量相应增多；直至第28天，1∶2组合成GAG和ColⅡ的量显著多余其他比例组，且与纯ACHs组（1∶0组）相当，而纯BMSC组（0∶1组）最少。ColⅡ/ColⅠ基因表达水平比值与之类似，不同的是纯ACHs组（1∶0组）的ColⅡ基因表达水平显著高于其他各组。还值得注意的是，检测发现共培养中的人BMSCs不表达人特异性ColⅡ基因，因此推测共培养中的BMSCs未直接参与软骨形成。Meretoja等[25]的研究结果表明，原代ACHs的成软骨能力强于传代后的ACHs。此外相比纯ACHs组（1∶0），共培养组（ACHs∶BMSCs为1∶1和1∶3）能产生接近甚至更好的成软骨效果，从而减少原代ACHs的需求量。Ko等[26]发现ACHs与BMSCs比例为1∶4时，Aggrecan和ColⅡ基因表达水平更高。Sabatino等[27]将含有不同细胞比例的共培养结构进行了体内外实验，体外实验显示ACHs与BMSCs比例为25∶75组的成软骨能力强，且较接近纯ACHs组（1∶0 组）；而相对于直接植入裸鼠皮下培养8周，预先在体外培养2周后再植入体内培养6周的成软骨能力更强，其中以5∶95组最为显著。上述研究结果显示，目前在三维支架中BMSCs单独应用时重建软骨的能力尚不如ACHs，但将BMSCs与ACHs共培养可在一定程度上减少所需ACHs的需求量，同时达到接近甚至优于单独应用 ACHs 时的效果。此外BMSCs来源广，易获取，并随着对诱导和培养条件的探索和改进，BMSCs仍是一种很有前景的种子细胞。但两种细胞共培养的最优比例与接种密度仍需更进一步探索。
表3
BMSCs和ACHs在三维结构中共培养相关研究
Table3.
Researches of co-culture of BMSC and ACHs in three-dimensional scaffolds
5 小结与展望
目前关于三维结构中构建组织工程软骨的实验研究中，所设计的细胞接种密度分组较少，密度范围窄，可能没有包含实际最合适的细胞接种密度。此外，构建组织工程软骨的最终效果还受到支架材料特性、种子细胞状态、生长因子等诸多因素的影响，目前很难得出一个普遍适用的细胞密度标准，但这并不代表我们可以不用关注种子细胞的接种密度，选择适宜的种子细胞接种密度对构建组织工程软骨仍具有重大意义。种子细胞接种密度过低会导致细胞外基质总量少，形成的软骨生物力学特性差，并且会减少细胞间的联系，不利于BMSCs的分化；密度过高会延长细胞体外扩增时间，对ACHs而言还会导致去分化、合成软骨特异性基质的能力减弱；因此需要考虑如何取得平衡。在共培养中选择适宜的种子细胞比例，可减少所需ACHs的数量及传代次数，从而保持ACHs表型，最终提高构建组织工程软骨的效率。
利益冲突 在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突
作者贡献声明 张姝江、白波：综述构思及设计、论文审校；谢慧锋：观点形成、资料收集及文章撰写；周伟：文献收集
