引用本文： 李矛, 白玉龙, 李淼, 周建伟. 两种去抗原异种骨性能评价及修复大鼠颅骨缺损实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(10): 1303-1310. doi: 10.7507/1002-1892.202103177 复制
严重创伤、骨病造成的骨缺损需要使用植骨材料进行填充、修复和重建。自体骨移植一直被认为是骨缺损修复“金标准”，但可供移植的骨源有限，且存在术后供区疼痛、感染等问题[1]。同种异体骨来源于捐献者的骨组织，经过加工处理制备而成，其临床疗效仅次于自体骨[2]；但骨来源同样受限，且存在免疫排斥反应及传染易感病毒的风险[3]。人工合成材料如生物陶瓷和金属植骨材料，虽然来源不受限制，无免疫排斥反应和疾病传播风险，但其结构、成分、力学特性无法比拟天然骨组织，生物活性欠缺，临床治疗效果不甚理想[3]。因此，研制和开发可替代同种异体骨、生物惰性陶瓷和金属植骨材料实现骨再生的骨修复材料，仍是目前植骨材料研究的焦点和重点[4]。
动物源性骨修复材料的成分与结构和人骨相似度较高，具有较好的生物相容性和力学特性，并且来源充分，不受限制，被视为具有骨修复潜力的生物支架[5]。随着技术发展，异种骨支架的免疫原性问题也逐渐被解决[6-7]。常用的异种骨支架有脱钙骨基质（decalcified bone matrix，DBM）（去无机质支架）和煅烧骨（去有机质支架），分别保留了骨的有机成分和无机成分。因其保留了骨的天然空隙结构，因此常作为组织工程支架搭载生长因子、细胞等用于骨或软骨组织修复[8-11]。但上述两种不同组分材料的理化性能、抗原性及成骨性能差异尚未见报道。本研究采用超临界 CO2 脱脂技术结合脱钙和煅烧工艺制备了两种去抗原异种骨支架——DBM 和煅烧骨，并通过理化性能表征和体内/外实验对比研究了两种支架的理化性质差异以及对大鼠颅骨缺损的修复效果，以期为不同情况下选择恰当的异种骨支架提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物、材料及主要试剂、仪器
6 周龄雄性 SD 大鼠 24 只，体质量（200±10）g，由上海睿太莫斯生物科技有限公司提供，实验操作均在上海睿太莫斯生物科技有限公司动物实验室完成。成年猪股骨，购自上海明珠湖肉食品有限公司。小鼠成纤维细胞 L-929、小鼠胚胎成骨细胞 MC3T3-E1（中国科学院细胞库）。
高纯 CO2（上海隽顶气体销售有限公司）；无水乙醇、过氧化氢（上海波维化学试剂有限公司）；RPMI 1640 培养液（HyClone 公司，美国）；FBS（浙江天杭生物科技股份有限公司）；青霉素/链霉素双抗（GIBCO 公司，美国）；刀豆蛋白、刀豆球蛋白 A（Con-A）、人外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技术有限公司）；高密度聚乙烯（批号：1546707，美国药典委员会）。
HA220-50-10 型超临界萃取装置（江苏海安华阳超临界科技有限公司）；SX 系列箱式电阻炉（绍兴沪越科学实验仪器厂）；KQ250B 型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；CO2 培养箱（济南鑫贝生物技术有限公司）；酶标仪（Tecan 公司，瑞士）；EG1150 H 病理组织包埋机（Leica 公司，德国）；倒置显微镜（Nikon 公司，日本）；Sirion 200 场发射扫描电镜（FEL 公司，美国）；SL200C 全自动接触角测量仪（上海梭伦信息科技有限公司）；Skyscan1172 Micro-CT（Bruker 公司，比利时）。
1.2 DBM 和煅烧骨的制备
1.2.1 DBM
取成年猪股骨，剔除肌肉、韧带、骨膜等软组织。利用环形钻切取松质骨为直径 5 mm、高 9 mm 的圆柱状骨块，用高压水枪反复冲洗，冲去骨髓、血液等成分。将冲洗后的松质骨块用无水乙醇漂洗 3 次，每次 5 min。然后置于超临界 CO2 萃取设备进行脱脂处理，设置脱脂温度为 50℃，压强 35 MPa，CO2 流速 20～50 L/h，夹带剂为 3% 过氧化氢，脱脂时间 5 h。将脱脂后骨块放入锥形瓶，按照料液比 1 g∶30 mL 加入 0.5 mol/L 盐酸，于摇床上进行动态脱钙，设置转速为 130 r/min，温度为室温。之后用纯化水冲洗骨块 5 min，再放置于盛有纯化水的超声波清洗设备进行超声清洗，清洗功率 35 Hz，时间 30 min；重复清洗 1 遍。将骨块置于冷冻干燥设备进行干燥；干燥后骨块按照使用需要切割或研磨成更小颗粒（直径 0.25～1.00 mm），PA/PE 复合尼龙袋密封包装后，60Co 辐照灭菌（25 kGy），备用。
1.2.2 煅烧骨
取成年猪股骨，同 DBM 制备脱脂后骨块置于 80℃ 干燥箱，干燥 2 h，然后于箱式电阻炉煅烧，温度 350℃，时间 12 h。煅烧结束后取出骨块，放置于盛有纯化水的超声波清洗机进行超声清洗，清洗功率 35 Hz，时间 30 min。将骨块置于冷冻干燥设备进行干燥；干燥后骨块按照 DBM 制样方式粉碎，密封包装，60Co 辐照灭菌（25 kGy），备用。
1.3 材料理化性能表征
1.3.1 材料密度测量
随机选取 DBM 和煅烧骨（直径 5 mm、高 6 mm 圆柱）各 5 个样本，称取质量并计算密度。
1.3.2 pH 值检测
取 DBM 和煅烧骨各 2 g，加入 40 mL 新煮沸晾冷的蒸馏水，置于超声波清洗机超声清洗 10 min 后静止 10 min，用 pH 计测定溶液 pH 值，重复 3 次，取均值。
1.3.3 扫描电镜观察
随机选取 DBM 和煅烧骨各 3 个样本，用手术刀片将圆柱状骨块切成 3 等份，扫描电镜于 5 kV 电压下观察材料表面结构及形貌，并测量材料孔径大小。
1.3.4 表面接触角测量
随机选取 DBM 和煅烧骨各 3 个样本，用全自动接触角测量仪测量样品表面接触角。每个样品重复测量 3 次，取均值。
1.4 材料体外细胞实验
1.4.1 细胞毒性实验
无菌环境下称取一定量 DBM 和煅烧骨，按照 0.1 g/mL 浸提比例，加入无血清 RPMI 1640 培养液，于（37±1）℃ 恒温培养箱中浸提（72±2）h，获得两种材料浸提液。
取小鼠 L-929 细胞加入含 10%FBS、1% 双抗的 α-MEM 培养基，于 37℃、5%CO2、恒温恒湿培养箱中培养，0.25% 胰蛋白酶传代。将 100 μL 小鼠 L-929 细胞悬液以 1.0×105 个/mL 密度接种于 96 孔板中，待细胞长满后弃去培养基，PBS 洗涤 2 次，然后分别加入 100 μL 两种材料浸提液（DBM 组、煅烧骨组），并设置阳性对照组（加入含 20%DMSO 的细胞培养液）、阴性对照组［加入高密度聚乙烯浸提液（按照 DBM 浸提条件制备）］、空白对照组（加入新鲜细胞培养液）。继续培养 24 h 后，通过 MTT 法检测各组细胞活力 ［以酶标仪测量波长 570 nm（参照波长为 650 nm）处吸光度（A）值计算］。同时，采用倒置显微镜观察细胞形态变化。
根据《GB/T16886.5-2017 医疗器械生物学评价 第 5 部分：体外细胞毒性试验》判定标准：细胞活性下降>30% 认为有细胞毒性（定量）；或超过 50% 的细胞呈圆缩状体、无细胞质内颗粒，大范围溶解，可观察到超过 50% 细胞生长抑制现象，认为有细胞毒性（定性）。
1.4.2 成骨细胞增殖实验
用纯化水和乙醇分别清洗两种材料 3 次，并进行冷冻干燥；之后将样品置于 24 孔培养板中，每个样品 3 个复孔；然后将 1.5 mL 含 1×104 个小鼠 MC3T3-E1 细胞的细胞悬液接种至样品上；将培养板轻轻转移至 37℃、5%CO2、恒温恒湿培养箱培养。培养 1、4、7 d 后，PBS 轻轻洗涤，用 MTT 法检测材料表面细胞数量，以酶标仪测量 492 nm 处的 A 值表示。另外，取培养 7 d 两种支架，PBS 洗涤 3 次，每次 1 min，0.3% 戊二醛固定 12 h，乙醇梯度脱水，干燥，喷金，扫描电镜观察小鼠 MC3T3-E1 细胞的形态和生长特征。
1.5 材料免疫原性评价
1.5.1 DNA 残留检测
采用徐丽明等[12]的方法检测 DBM 和煅烧骨材料中 DNA 残留量，以成年猪股骨作为对照。
1.5.2 人外周血淋巴细胞增殖实验
无菌环境下分别称取 0.3 g DBM 和煅烧骨，置于 10 mL 无菌离心管中，加入 3 mL 无血清 RPMI 1640 培养液，匀浆 5 min，静置 3 min 取上清液待测。
淋巴细胞提取与培养：取成年健康志愿者（无吸烟史）的外周血 10 mL，加至含 1 mL 250 U 肝素钠（PBS 配置）的离心管中，并加入 11 mL PBS，混匀。倾斜 45° 持离心管，加入 6.6 mL 人外周血淋巴细胞分离液，常温下以 900×g 离心 30 min。吸弃最上层分离液，并吸取下一层单个核细胞分离液移入新的离心管中，加入 3 倍体积 PBS 洗涤细胞。常温下以 400×g 离心 10 min，弃上清液。重复以上步骤洗涤细胞，以去除血小板。加入含 10%FBS、1% 双抗的 RPMI 1640 培养基重悬细胞，吸取至培养皿中，37℃、5%CO2、恒温恒湿培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞形态。
淋巴细胞增殖检测：实验分为阴性组（添加含 10%FBS 的 RPMI 1640 培养液）、阳性组（含 10%FBS、5 μg/mL ConA 的 RPMI 1640 培养液）、实验组 1（添加 DBM 浸提液）、实验组 2（添加煅烧骨浸提液）共 4 组，每组设 3 个复孔。每孔中加入 100 μL 密度为 1×106 个/mL 的淋巴细胞悬液，置于 37℃、5%CO2、恒温恒湿培养箱中培养 3 d；加入 10%CCK-8，继续孵育 2～4 h，再将培养液转移至 96 孔板中，每孔 100 μL，酶标仪 450 nm 下测量 A 值。
1.6 动物体内实验
取 SD 大鼠 24 只，以 3% 戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉后，俯身固定于手术台，颅顶备皮，消毒。沿颅骨顶中线作 2 cm 长纵切口，依次分离皮肤、皮下组织和骨膜。使用直径 5 mm 环形钻于中线左右两侧分别制备 1 个圆形全层骨缺损，注意勿损伤脑组织。取其中 12 只大鼠，左右侧骨缺损处分别随机植入粒径为 0.25～1.00 mm 的 DBM（DBM 组）或不植入任何材料（空白对照组）；剩余 12 只大鼠左右侧骨缺损处分别随机植入粒径 0.25～1.00 mm 煅烧骨（煅烧骨组）或不植入任何材料（空白对照组）。逐层缝合骨膜、肌肉和皮肤，待动物苏醒后送回动物实验室继续饲养。
1.6.1 大体观察
术后观察动物存活及活动情况以及切口愈合情况；术后 4、8 周处死大鼠（DBM 组和煅烧骨组 n=6，空白对照组 n=12），沿颅骨中线切开并简单剥离皮下组织，取出实验区颅骨观察大体形态。之后将样本置于 10% 甲醛固定 24 h 以上，进行以下观测。
1.6.2 Micro-CT 观察
取标本经流水冲洗 1 h 后，Micro-CT 观察颅骨缺损修复情况；扫描条件：电流 112 μA，电压 80 kV。利用 NRecon（1.7.3.0）图像分析软件定量分析新生骨体积百分比（bone volume/total volume，BV/TV）。
1.6.3 组织学观察
取标本经 50% 甲酸脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片（片厚 4 μm）后，行 HE 染色观察颅骨缺损修复情况。
1.7 统计学方法
采用 SPSS20 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间及组内多时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 材料理化性能表征
DBM 密度为（0.212 2±0.017 2）g/cm3，显著小于煅烧骨（0.575 7±0.039 2）g/cm3，差异有统计学意义（t=18.971，P=0.042）。DBM pH 值为 5.5，呈弱酸性；煅烧骨 pH 值略高，为 6.1。扫描电镜观察示，材料表面光滑且为多孔结构（图 1）；两种材料孔径均在 160～800 μm 之间。DBM 表面呈现疏水特性，液滴接触材料表面 1 s 时平均接触角为 110.85°，2 s 时为 108.21°，3 s 时为 102.36°；而煅烧骨表现为亲水性，液滴接触材料表面不到 1 s，接触角迅速变为 0°（图 2）。
图1
扫描电镜观察 DBM 和煅烧骨结构及形貌（×100）
a. DBM；b. 煅烧骨
Figure1. Scanning electron microscope observation of the structure and morphology of DBM and calcined bone (×100)a. DBM; b. Calcined bone
图2
DBM 和煅烧骨表面接触角检测
a. DBM；b. 煅烧骨
Figure2. Surface contact angle detection of DBM and calcined bonea. DBM; b. Calcined bone
2.2 材料体外细胞实验
2.2.1 细胞毒性实验
定量检测示，DBM 组、煅烧骨组、空白对照组、阴性对照组细胞活性均超过 90%，分别为 95.7%±1.0%、94.4%±2.4%、100.0%、102.6%±1.5%，显著高于阳性对照组 12.3%±1.0%，差异有统计学意义（P<0.05）；其中 DBM 组和煅烧骨组细胞活性差异无统计学意义（P>0.05）。倒置显微镜观察示，两种支架材料浸提液培养的细胞形态较好，无细胞圆缩、大范围溶解等现象（图 3）。因此，两种支架材料均未表现出细胞毒性。
图3
两种材料浸提液与小鼠 L-292 细胞共培养形态观察（倒置显微镜×100）
a. DBM 组；b. 煅烧骨组
Figure3. Morphology observation of co-culture of material extract and mouse L-292 cells (Inverted microscope×100)a. DBM group; b. Calcined bone group
2.2.2 成骨细胞增殖实验
MTT 法检测示，培养 1、4、7 d 成骨细胞在两种材料表面正常附着生长，细胞数量随时间延长而增加。各时间点 DBM 组A 值均显著高于煅烧骨组，差异有统计学意义（P<0.05）；并且随时间延长，两组A 值差值也逐渐增大。见图 4a。
图4
两种材料成骨细胞增殖实验
a. MTT 法检测；b. 扫描电镜观察成骨细胞在 DBM（左）和煅烧骨（右）表面黏附生长情况（×500）
Figure4. Osteoblast proliferation experiment of two materialsa. Detection by MTT method; b. Scanning electron microscope observation of the adhesion and growth of osteoblasts on the surface of DBM (left) and calcined bone (right) (×500)
扫描电镜观察示，成骨细胞在两种材料表面形态均较好，可见细胞突起附着于材料表面，细胞呈正常梭形或多角形，有伪足状结构，细胞质丰富，细胞成片生长。见图 4b。
2.3 材料免疫原性评价
2.3.1 DNA 残留检测
骨原材料、DBM 和煅烧骨 DNA 残留量分别为（152.48±13.25）、（25.68±3.00）、（2.26±0.93）ng/mg 干重，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.3.2 人外周血淋巴细胞增殖实验
阴性组、阳性组、实验组 1 和实验组 2 的 A 值分别为 0.126 4±0.005 3、0.239 9±0.006 2、0.112 5±0.004 9、0.113 4±0.003 6，实验组 1 和实验组 2 与阴性组比较差异无统计学意义（P>0.05），但均显著低于阳性组，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4 动物体内实验
2.4.1 大体观察
术后动物活动良好，无死亡。手术切口均于术后 2 周愈合，皮肤未见红肿。术后 4、8 周取材观察示，手术部位已被毛发覆盖，组织形态良好，未见坏死。
2.4.2 Micro-CT 观察
术后 4、8 周，空白对照组缺损明显，未见新骨生成；煅烧骨组及 DBM 组修复效果明显优于空白对照组。见图 5。
图5
术后各组颅骨 Micro-CT 扫描观察
从左至右分别为空白对照组、DBM 组、煅烧骨组，黄色为支架材料，灰色为新生骨 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周
Figure5. Micro-CT scan observation of skulls in each group at 4 and 8 weeks after operationFrom left to right for blank control group, DBM group, and calcined bone group, respectively; yellow for the scaffold material and gray for the new bone a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
术后随时间延长，各组 BV/TV 均逐渐增加，术后 4、8 周间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。术后 4、8 周煅烧骨组和 DBM 组 BV/TV 均显著高于空白对照组，术后 4 周煅烧骨组显著高于 DBM 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；术后 8 周 DBM 组和煅烧骨组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
术后 4、8 周各组 BV/TV 比较（
）
Table1.
Comparison of BV/TV in each group at 4 and 8 weeks after operation (
)
2.4.3 组织学观察
HE 染色示，术后 4 周，空白对照组缺损部位被纤维结缔组织填充，缺损明显，未见骨长入；DBM 组在缺损处可见植入的 DBM 基质，材料周围可见少量淋巴细胞浸润，同时可见成骨细胞及新生骨形成；煅烧骨组因组织脱钙处理后几乎观察不到材料，只留下不规则的圆形空隙，空隙周围可见淋巴细胞浸润，同时能观察到成骨细胞及新生骨形成。术后 8 周，空白对照组缺损处被大量纤维组织包裹，未见骨长入；DBM 组可见材料部分降解，新生骨呈“岛状”分布于缺损区域，同时可见新骨由缺损四周向中间生长，骨缺损体积逐渐缩小；煅烧骨组材料空隙分布均匀，材料未明显降解，在材料周围形成连续的互相连接的新生“骨桥”，同时可见新骨由缺损四周向中间生长，骨缺损体积逐渐缩小。见图 6。
图6
术后各时间点各组大鼠 HE 染色观察
右图（×5）为左图（×20）方框局部放大图，红箭头示宿主骨、蓝箭头示材料、绿箭头示新骨a、b. 术后 4、8 周空白对照组；c、d. 术后 4、8 周 DBM 组；e、f. 术后 4、8 周煅烧骨组
Figure6. HE staining observation of rats in each group at various time points after operationThe picture on the right (×5) was a partial enlarged view of the box on the left picture (×20). The red arrow indicated the host bone, the blue arrow indicated the material, and the green arrow indicated the new bone a, b. Blank control group at 4 and 8 weeks after operation, respectively; c, d. DBM group at 4 and 8 weeks after operation, respectively; e, f. Calcined bone group at 4 and 8 weeks after operation, respectively
3 讨论
骨科及口腔科对植骨材料需求较大。据报道，20 世纪末全球植骨材料的使用量已超过 200 万件，其中美国超过 50 万件[13]，如今预计使用量已翻了几倍，自体骨或同种异体骨远远无法满足临床需求。人工合成骨与动物来源的骨材料来源充分，可工业化大规模生产，然而国内已上市的产品却寥寥无几，大部分市场仍被进口产品占据。尤其在口腔领域，瑞士 Geistlich 公司的 Bio-Oss 骨粉（牛骨制备）在全球占据了较大的市场份额。
异种骨修复材料因具有类似于人骨的天然多孔结构，有利于细胞、血管、组织长入并促进新骨生成。但因早期加工制备技术限制，导致无法彻底清除抗原，免疫排斥反应发生率较高。研究发现，异种骨主要抗原成分是血液、骨髓、各种细胞成分及 α-半乳糖基抗原（广泛存在于猪、牛和其他低等动物体内的一种含有聚乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂）[14-15]。未处理彻底的血清、细胞、蛋白和多种靶抗原分子可与人体内的抗体结合，激活补体导致超急性排斥反应发生，也可能持续刺激和诱导宿主免疫系统的 T 细胞、B 细胞及相关免疫系统产生免疫应答[16]。因此，如何有效清洗骨组织去除抗原，一直是异种骨研究的重点。研究人员尝试了多种物理和化学方法去除抗原，如深低温冷冻法、反复冻融、煅烧法、化学试剂处理法（如 SDS、Triton X-100、过氧化氢等）以及生物酶处理法等[17-18]，其中煅烧法最为简单，去抗原也最为彻底，且能够彻底杀灭病原微生物。采用高温煅烧制备异种骨，应注意煅烧前的清洁和处理，同时控制好煅烧温度和时间。煅烧前清洁不彻底会导致残渣留在松质骨孔隙，不易清理；煅烧温度过低，有机物燃烧不充分，温度过高可能导致无机物结晶度升高，进而影响其降解性[19-20]。李龙飞等[21]采用不同烧结温度对猪骨进行煅烧，发现随着煅烧温度由 600℃ 升至 1 000℃，晶体的结晶度明显升高。Bio-Oss 即利用小牛骨经过强碱处理后，低温（约 300℃）煅烧制备[22]。煅烧后的骨支架保留了松质骨天然的多孔结构，具有很好的骨传导性能，但不具备骨诱导活性。
DBM 则是通过酸脱去骨中矿物质，使得内源性 BMP-2 得以暴露，从而发挥骨诱导作用。其主要成分为胶原蛋白，脱钙后仍保持着多孔骨架结构，为细胞、血管、组织的长入提供有利环境，因此 DBM 兼具了骨传导性和骨诱导性。研究表明，BMP-2 具有高度保守性，其氨基酸序列在哺乳动物中是相同的，在不同种属间 BMP-2 可以发挥相同作用[23]。因此，保留异种骨的 BMP-2 对于提高异种骨修复材料的成骨活性具有显著意义。
本研究采用高压水枪冲洗可有效去除血液、骨髓等可见污物，进而利用超临界 CO2 技术对异种骨进行深度清洁，进一步减少脂肪和其他抗原成分，通过脱钙和煅烧工艺制备异种骨来源的有机物支架和无机物支架。两种支架主要成分不同，煅烧骨主要成分为羟基磷灰石，支架密度较大；DBM 主要成分为胶原蛋白，支架密度较小。两种材料 pH 值均在 5.5～6.1 之间，符合骨植入材料的要求。二者均保留了骨的天然多孔结构，其孔径和孔隙率无显著差异。煅烧骨支架亲水性更好，DBM 支架由于主要成分为胶原，而胶原蛋白主要为疏水性分子，所以其亲水性较差。细胞体外实验结果显示，煅烧和脱钙制备的两种异种骨支架均未表现出细胞毒性，并且两种支架都能促进成骨细胞增殖，DBM 促增殖效果优于煅烧骨，这可能与 DBM 所含内源性 BMP-2 释放有关。对两种材料免疫原性评价结果显示，DBM 和煅烧骨经过软组织去除、清洗、超临界 CO2 萃取等工序处理，其主要抗原细胞已被大量去除，DNA 残留水平远低于文献报道的评价组织材料脱细胞程度的标准：50 ng/mg 干重[24]。同时，人外周血淋巴细胞实验表明，两种支架均不会刺激外周血淋巴细胞增殖和分化。大鼠颅骨缺损修复实验结果显示，两种支架材料的成骨方式略有差异。煅烧骨支架降解性较差，术后 8 周仍可见大量材料残留；其主要依靠骨传导作用成骨，组织学结果显示新生骨围绕支架爬行。DBM 支架降解性较好，术后 8 周仅有少量材料残留，组织学观察可见新生骨呈点状、片状分布，成骨作用明显。两种材料在 Micro-CT 下显影程度不同，DBM 弱显影，而煅烧骨显影较亮。术后 4 周时，煅烧骨 BV/TV 大于脱钙骨，但是从组织学结果看并无显著差异，这可能与煅烧骨支架缓慢降解释放 Ca2+，形成密度类似于新骨的高 Ca2+ 区域有关。
综上述，不同类型的异种骨支架其理化性能、降解性和体内成骨作用可能存在差异。DBM 亲水性差，降解性较好，内源性 BMP-2 因脱钙处理得以充分暴露，具有很好的成骨活性；锻烧骨亲水性较好，降解性较差，因高温煅烧而失活，但天然多孔结构仍为成骨提供了良好条件。两种支架均无免疫原性且能够促进大鼠颅骨缺损修复，具有一定应用前景。
作者贡献：李矛直接参与材料制备、动物实验操作与结果评价，数据收集整理以及文章撰写；白玉龙参与材料制备与表征、动物实验、文章复核；李淼参与细胞实验和数据分析；周建伟提供实验设计思路并把控实验正确实施、文章审核修改，并对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：研究方案经首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会（TRECKY2021-060）及上海睿太莫斯生物科技有限公司动物福利伦理委员会批准（RM200214）。实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2016-0004。
严重创伤、骨病造成的骨缺损需要使用植骨材料进行填充、修复和重建。自体骨移植一直被认为是骨缺损修复“金标准”，但可供移植的骨源有限，且存在术后供区疼痛、感染等问题[1]。同种异体骨来源于捐献者的骨组织，经过加工处理制备而成，其临床疗效仅次于自体骨[2]；但骨来源同样受限，且存在免疫排斥反应及传染易感病毒的风险[3]。人工合成材料如生物陶瓷和金属植骨材料，虽然来源不受限制，无免疫排斥反应和疾病传播风险，但其结构、成分、力学特性无法比拟天然骨组织，生物活性欠缺，临床治疗效果不甚理想[3]。因此，研制和开发可替代同种异体骨、生物惰性陶瓷和金属植骨材料实现骨再生的骨修复材料，仍是目前植骨材料研究的焦点和重点[4]。
动物源性骨修复材料的成分与结构和人骨相似度较高，具有较好的生物相容性和力学特性，并且来源充分，不受限制，被视为具有骨修复潜力的生物支架[5]。随着技术发展，异种骨支架的免疫原性问题也逐渐被解决[6-7]。常用的异种骨支架有脱钙骨基质（decalcified bone matrix，DBM）（去无机质支架）和煅烧骨（去有机质支架），分别保留了骨的有机成分和无机成分。因其保留了骨的天然空隙结构，因此常作为组织工程支架搭载生长因子、细胞等用于骨或软骨组织修复[8-11]。但上述两种不同组分材料的理化性能、抗原性及成骨性能差异尚未见报道。本研究采用超临界 CO2 脱脂技术结合脱钙和煅烧工艺制备了两种去抗原异种骨支架——DBM 和煅烧骨，并通过理化性能表征和体内/外实验对比研究了两种支架的理化性质差异以及对大鼠颅骨缺损的修复效果，以期为不同情况下选择恰当的异种骨支架提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物、材料及主要试剂、仪器
6 周龄雄性 SD 大鼠 24 只，体质量（200±10）g，由上海睿太莫斯生物科技有限公司提供，实验操作均在上海睿太莫斯生物科技有限公司动物实验室完成。成年猪股骨，购自上海明珠湖肉食品有限公司。小鼠成纤维细胞 L-929、小鼠胚胎成骨细胞 MC3T3-E1（中国科学院细胞库）。
高纯 CO2（上海隽顶气体销售有限公司）；无水乙醇、过氧化氢（上海波维化学试剂有限公司）；RPMI 1640 培养液（HyClone 公司，美国）；FBS（浙江天杭生物科技股份有限公司）；青霉素/链霉素双抗（GIBCO 公司，美国）；刀豆蛋白、刀豆球蛋白 A（Con-A）、人外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技术有限公司）；高密度聚乙烯（批号：1546707，美国药典委员会）。
HA220-50-10 型超临界萃取装置（江苏海安华阳超临界科技有限公司）；SX 系列箱式电阻炉（绍兴沪越科学实验仪器厂）；KQ250B 型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；CO2 培养箱（济南鑫贝生物技术有限公司）；酶标仪（Tecan 公司，瑞士）；EG1150 H 病理组织包埋机（Leica 公司，德国）；倒置显微镜（Nikon 公司，日本）；Sirion 200 场发射扫描电镜（FEL 公司，美国）；SL200C 全自动接触角测量仪（上海梭伦信息科技有限公司）；Skyscan1172 Micro-CT（Bruker 公司，比利时）。
1.2 DBM 和煅烧骨的制备
1.2.1 DBM
取成年猪股骨，剔除肌肉、韧带、骨膜等软组织。利用环形钻切取松质骨为直径 5 mm、高 9 mm 的圆柱状骨块，用高压水枪反复冲洗，冲去骨髓、血液等成分。将冲洗后的松质骨块用无水乙醇漂洗 3 次，每次 5 min。然后置于超临界 CO2 萃取设备进行脱脂处理，设置脱脂温度为 50℃，压强 35 MPa，CO2 流速 20～50 L/h，夹带剂为 3% 过氧化氢，脱脂时间 5 h。将脱脂后骨块放入锥形瓶，按照料液比 1 g∶30 mL 加入 0.5 mol/L 盐酸，于摇床上进行动态脱钙，设置转速为 130 r/min，温度为室温。之后用纯化水冲洗骨块 5 min，再放置于盛有纯化水的超声波清洗设备进行超声清洗，清洗功率 35 Hz，时间 30 min；重复清洗 1 遍。将骨块置于冷冻干燥设备进行干燥；干燥后骨块按照使用需要切割或研磨成更小颗粒（直径 0.25～1.00 mm），PA/PE 复合尼龙袋密封包装后，60Co 辐照灭菌（25 kGy），备用。
1.2.2 煅烧骨
取成年猪股骨，同 DBM 制备脱脂后骨块置于 80℃ 干燥箱，干燥 2 h，然后于箱式电阻炉煅烧，温度 350℃，时间 12 h。煅烧结束后取出骨块，放置于盛有纯化水的超声波清洗机进行超声清洗，清洗功率 35 Hz，时间 30 min。将骨块置于冷冻干燥设备进行干燥；干燥后骨块按照 DBM 制样方式粉碎，密封包装，60Co 辐照灭菌（25 kGy），备用。
1.3 材料理化性能表征
1.3.1 材料密度测量
随机选取 DBM 和煅烧骨（直径 5 mm、高 6 mm 圆柱）各 5 个样本，称取质量并计算密度。
1.3.2 pH 值检测
取 DBM 和煅烧骨各 2 g，加入 40 mL 新煮沸晾冷的蒸馏水，置于超声波清洗机超声清洗 10 min 后静止 10 min，用 pH 计测定溶液 pH 值，重复 3 次，取均值。
1.3.3 扫描电镜观察
随机选取 DBM 和煅烧骨各 3 个样本，用手术刀片将圆柱状骨块切成 3 等份，扫描电镜于 5 kV 电压下观察材料表面结构及形貌，并测量材料孔径大小。
1.3.4 表面接触角测量
随机选取 DBM 和煅烧骨各 3 个样本，用全自动接触角测量仪测量样品表面接触角。每个样品重复测量 3 次，取均值。
1.4 材料体外细胞实验
1.4.1 细胞毒性实验
无菌环境下称取一定量 DBM 和煅烧骨，按照 0.1 g/mL 浸提比例，加入无血清 RPMI 1640 培养液，于（37±1）℃ 恒温培养箱中浸提（72±2）h，获得两种材料浸提液。
取小鼠 L-929 细胞加入含 10%FBS、1% 双抗的 α-MEM 培养基，于 37℃、5%CO2、恒温恒湿培养箱中培养，0.25% 胰蛋白酶传代。将 100 μL 小鼠 L-929 细胞悬液以 1.0×105 个/mL 密度接种于 96 孔板中，待细胞长满后弃去培养基，PBS 洗涤 2 次，然后分别加入 100 μL 两种材料浸提液（DBM 组、煅烧骨组），并设置阳性对照组（加入含 20%DMSO 的细胞培养液）、阴性对照组［加入高密度聚乙烯浸提液（按照 DBM 浸提条件制备）］、空白对照组（加入新鲜细胞培养液）。继续培养 24 h 后，通过 MTT 法检测各组细胞活力 ［以酶标仪测量波长 570 nm（参照波长为 650 nm）处吸光度（A）值计算］。同时，采用倒置显微镜观察细胞形态变化。
根据《GB/T16886.5-2017 医疗器械生物学评价 第 5 部分：体外细胞毒性试验》判定标准：细胞活性下降>30% 认为有细胞毒性（定量）；或超过 50% 的细胞呈圆缩状体、无细胞质内颗粒，大范围溶解，可观察到超过 50% 细胞生长抑制现象，认为有细胞毒性（定性）。
1.4.2 成骨细胞增殖实验
用纯化水和乙醇分别清洗两种材料 3 次，并进行冷冻干燥；之后将样品置于 24 孔培养板中，每个样品 3 个复孔；然后将 1.5 mL 含 1×104 个小鼠 MC3T3-E1 细胞的细胞悬液接种至样品上；将培养板轻轻转移至 37℃、5%CO2、恒温恒湿培养箱培养。培养 1、4、7 d 后，PBS 轻轻洗涤，用 MTT 法检测材料表面细胞数量，以酶标仪测量 492 nm 处的 A 值表示。另外，取培养 7 d 两种支架，PBS 洗涤 3 次，每次 1 min，0.3% 戊二醛固定 12 h，乙醇梯度脱水，干燥，喷金，扫描电镜观察小鼠 MC3T3-E1 细胞的形态和生长特征。
1.5 材料免疫原性评价
1.5.1 DNA 残留检测
采用徐丽明等[12]的方法检测 DBM 和煅烧骨材料中 DNA 残留量，以成年猪股骨作为对照。
1.5.2 人外周血淋巴细胞增殖实验
无菌环境下分别称取 0.3 g DBM 和煅烧骨，置于 10 mL 无菌离心管中，加入 3 mL 无血清 RPMI 1640 培养液，匀浆 5 min，静置 3 min 取上清液待测。
淋巴细胞提取与培养：取成年健康志愿者（无吸烟史）的外周血 10 mL，加至含 1 mL 250 U 肝素钠（PBS 配置）的离心管中，并加入 11 mL PBS，混匀。倾斜 45° 持离心管，加入 6.6 mL 人外周血淋巴细胞分离液，常温下以 900×g 离心 30 min。吸弃最上层分离液，并吸取下一层单个核细胞分离液移入新的离心管中，加入 3 倍体积 PBS 洗涤细胞。常温下以 400×g 离心 10 min，弃上清液。重复以上步骤洗涤细胞，以去除血小板。加入含 10%FBS、1% 双抗的 RPMI 1640 培养基重悬细胞，吸取至培养皿中，37℃、5%CO2、恒温恒湿培养箱中培养，倒置显微镜观察细胞形态。
淋巴细胞增殖检测：实验分为阴性组（添加含 10%FBS 的 RPMI 1640 培养液）、阳性组（含 10%FBS、5 μg/mL ConA 的 RPMI 1640 培养液）、实验组 1（添加 DBM 浸提液）、实验组 2（添加煅烧骨浸提液）共 4 组，每组设 3 个复孔。每孔中加入 100 μL 密度为 1×106 个/mL 的淋巴细胞悬液，置于 37℃、5%CO2、恒温恒湿培养箱中培养 3 d；加入 10%CCK-8，继续孵育 2～4 h，再将培养液转移至 96 孔板中，每孔 100 μL，酶标仪 450 nm 下测量 A 值。
1.6 动物体内实验
取 SD 大鼠 24 只，以 3% 戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉后，俯身固定于手术台，颅顶备皮，消毒。沿颅骨顶中线作 2 cm 长纵切口，依次分离皮肤、皮下组织和骨膜。使用直径 5 mm 环形钻于中线左右两侧分别制备 1 个圆形全层骨缺损，注意勿损伤脑组织。取其中 12 只大鼠，左右侧骨缺损处分别随机植入粒径为 0.25～1.00 mm 的 DBM（DBM 组）或不植入任何材料（空白对照组）；剩余 12 只大鼠左右侧骨缺损处分别随机植入粒径 0.25～1.00 mm 煅烧骨（煅烧骨组）或不植入任何材料（空白对照组）。逐层缝合骨膜、肌肉和皮肤，待动物苏醒后送回动物实验室继续饲养。
1.6.1 大体观察
术后观察动物存活及活动情况以及切口愈合情况；术后 4、8 周处死大鼠（DBM 组和煅烧骨组 n=6，空白对照组 n=12），沿颅骨中线切开并简单剥离皮下组织，取出实验区颅骨观察大体形态。之后将样本置于 10% 甲醛固定 24 h 以上，进行以下观测。
1.6.2 Micro-CT 观察
取标本经流水冲洗 1 h 后，Micro-CT 观察颅骨缺损修复情况；扫描条件：电流 112 μA，电压 80 kV。利用 NRecon（1.7.3.0）图像分析软件定量分析新生骨体积百分比（bone volume/total volume，BV/TV）。
1.6.3 组织学观察
取标本经 50% 甲酸脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片（片厚 4 μm）后，行 HE 染色观察颅骨缺损修复情况。
1.7 统计学方法
采用 SPSS20 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间及组内多时间点间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 材料理化性能表征
DBM 密度为（0.212 2±0.017 2）g/cm3，显著小于煅烧骨（0.575 7±0.039 2）g/cm3，差异有统计学意义（t=18.971，P=0.042）。DBM pH 值为 5.5，呈弱酸性；煅烧骨 pH 值略高，为 6.1。扫描电镜观察示，材料表面光滑且为多孔结构（图 1）；两种材料孔径均在 160～800 μm 之间。DBM 表面呈现疏水特性，液滴接触材料表面 1 s 时平均接触角为 110.85°，2 s 时为 108.21°，3 s 时为 102.36°；而煅烧骨表现为亲水性，液滴接触材料表面不到 1 s，接触角迅速变为 0°（图 2）。
图1
扫描电镜观察 DBM 和煅烧骨结构及形貌（×100）
a. DBM；b. 煅烧骨
Figure1. Scanning electron microscope observation of the structure and morphology of DBM and calcined bone (×100)a. DBM; b. Calcined bone
图2
DBM 和煅烧骨表面接触角检测
a. DBM；b. 煅烧骨
Figure2. Surface contact angle detection of DBM and calcined bonea. DBM; b. Calcined bone
2.2 材料体外细胞实验
2.2.1 细胞毒性实验
定量检测示，DBM 组、煅烧骨组、空白对照组、阴性对照组细胞活性均超过 90%，分别为 95.7%±1.0%、94.4%±2.4%、100.0%、102.6%±1.5%，显著高于阳性对照组 12.3%±1.0%，差异有统计学意义（P<0.05）；其中 DBM 组和煅烧骨组细胞活性差异无统计学意义（P>0.05）。倒置显微镜观察示，两种支架材料浸提液培养的细胞形态较好，无细胞圆缩、大范围溶解等现象（图 3）。因此，两种支架材料均未表现出细胞毒性。
图3
两种材料浸提液与小鼠 L-292 细胞共培养形态观察（倒置显微镜×100）
a. DBM 组；b. 煅烧骨组
Figure3. Morphology observation of co-culture of material extract and mouse L-292 cells (Inverted microscope×100)a. DBM group; b. Calcined bone group
2.2.2 成骨细胞增殖实验
MTT 法检测示，培养 1、4、7 d 成骨细胞在两种材料表面正常附着生长，细胞数量随时间延长而增加。各时间点 DBM 组A 值均显著高于煅烧骨组，差异有统计学意义（P<0.05）；并且随时间延长，两组A 值差值也逐渐增大。见图 4a。
图4
两种材料成骨细胞增殖实验
a. MTT 法检测；b. 扫描电镜观察成骨细胞在 DBM（左）和煅烧骨（右）表面黏附生长情况（×500）
Figure4. Osteoblast proliferation experiment of two materialsa. Detection by MTT method; b. Scanning electron microscope observation of the adhesion and growth of osteoblasts on the surface of DBM (left) and calcined bone (right) (×500)
扫描电镜观察示，成骨细胞在两种材料表面形态均较好，可见细胞突起附着于材料表面，细胞呈正常梭形或多角形，有伪足状结构，细胞质丰富，细胞成片生长。见图 4b。
2.3 材料免疫原性评价
2.3.1 DNA 残留检测
骨原材料、DBM 和煅烧骨 DNA 残留量分别为（152.48±13.25）、（25.68±3.00）、（2.26±0.93）ng/mg 干重，组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.3.2 人外周血淋巴细胞增殖实验
阴性组、阳性组、实验组 1 和实验组 2 的 A 值分别为 0.126 4±0.005 3、0.239 9±0.006 2、0.112 5±0.004 9、0.113 4±0.003 6，实验组 1 和实验组 2 与阴性组比较差异无统计学意义（P>0.05），但均显著低于阳性组，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4 动物体内实验
2.4.1 大体观察
术后动物活动良好，无死亡。手术切口均于术后 2 周愈合，皮肤未见红肿。术后 4、8 周取材观察示，手术部位已被毛发覆盖，组织形态良好，未见坏死。
2.4.2 Micro-CT 观察
术后 4、8 周，空白对照组缺损明显，未见新骨生成；煅烧骨组及 DBM 组修复效果明显优于空白对照组。见图 5。
图5
术后各组颅骨 Micro-CT 扫描观察
从左至右分别为空白对照组、DBM 组、煅烧骨组，黄色为支架材料，灰色为新生骨 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周
Figure5. Micro-CT scan observation of skulls in each group at 4 and 8 weeks after operationFrom left to right for blank control group, DBM group, and calcined bone group, respectively; yellow for the scaffold material and gray for the new bone a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation
术后随时间延长，各组 BV/TV 均逐渐增加，术后 4、8 周间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。术后 4、8 周煅烧骨组和 DBM 组 BV/TV 均显著高于空白对照组，术后 4 周煅烧骨组显著高于 DBM 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；术后 8 周 DBM 组和煅烧骨组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
术后 4、8 周各组 BV/TV 比较（）
Table1.
Comparison of BV/TV in each group at 4 and 8 weeks after operation ()
2.4.3 组织学观察
HE 染色示，术后 4 周，空白对照组缺损部位被纤维结缔组织填充，缺损明显，未见骨长入；DBM 组在缺损处可见植入的 DBM 基质，材料周围可见少量淋巴细胞浸润，同时可见成骨细胞及新生骨形成；煅烧骨组因组织脱钙处理后几乎观察不到材料，只留下不规则的圆形空隙，空隙周围可见淋巴细胞浸润，同时能观察到成骨细胞及新生骨形成。术后 8 周，空白对照组缺损处被大量纤维组织包裹，未见骨长入；DBM 组可见材料部分降解，新生骨呈“岛状”分布于缺损区域，同时可见新骨由缺损四周向中间生长，骨缺损体积逐渐缩小；煅烧骨组材料空隙分布均匀，材料未明显降解，在材料周围形成连续的互相连接的新生“骨桥”，同时可见新骨由缺损四周向中间生长，骨缺损体积逐渐缩小。见图 6。
图6
术后各时间点各组大鼠 HE 染色观察
右图（×5）为左图（×20）方框局部放大图，红箭头示宿主骨、蓝箭头示材料、绿箭头示新骨a、b. 术后 4、8 周空白对照组；c、d. 术后 4、8 周 DBM 组；e、f. 术后 4、8 周煅烧骨组
Figure6. HE staining observation of rats in each group at various time points after operationThe picture on the right (×5) was a partial enlarged view of the box on the left picture (×20). The red arrow indicated the host bone, the blue arrow indicated the material, and the green arrow indicated the new bone a, b. Blank control group at 4 and 8 weeks after operation, respectively; c, d. DBM group at 4 and 8 weeks after operation, respectively; e, f. Calcined bone group at 4 and 8 weeks after operation, respectively
3 讨论
骨科及口腔科对植骨材料需求较大。据报道，20 世纪末全球植骨材料的使用量已超过 200 万件，其中美国超过 50 万件[13]，如今预计使用量已翻了几倍，自体骨或同种异体骨远远无法满足临床需求。人工合成骨与动物来源的骨材料来源充分，可工业化大规模生产，然而国内已上市的产品却寥寥无几，大部分市场仍被进口产品占据。尤其在口腔领域，瑞士 Geistlich 公司的 Bio-Oss 骨粉（牛骨制备）在全球占据了较大的市场份额。
异种骨修复材料因具有类似于人骨的天然多孔结构，有利于细胞、血管、组织长入并促进新骨生成。但因早期加工制备技术限制，导致无法彻底清除抗原，免疫排斥反应发生率较高。研究发现，异种骨主要抗原成分是血液、骨髓、各种细胞成分及 α-半乳糖基抗原（广泛存在于猪、牛和其他低等动物体内的一种含有聚乳糖胺核心末端残基的细胞表面分泌型糖蛋白或糖脂）[14-15]。未处理彻底的血清、细胞、蛋白和多种靶抗原分子可与人体内的抗体结合，激活补体导致超急性排斥反应发生，也可能持续刺激和诱导宿主免疫系统的 T 细胞、B 细胞及相关免疫系统产生免疫应答[16]。因此，如何有效清洗骨组织去除抗原，一直是异种骨研究的重点。研究人员尝试了多种物理和化学方法去除抗原，如深低温冷冻法、反复冻融、煅烧法、化学试剂处理法（如 SDS、Triton X-100、过氧化氢等）以及生物酶处理法等[17-18]，其中煅烧法最为简单，去抗原也最为彻底，且能够彻底杀灭病原微生物。采用高温煅烧制备异种骨，应注意煅烧前的清洁和处理，同时控制好煅烧温度和时间。煅烧前清洁不彻底会导致残渣留在松质骨孔隙，不易清理；煅烧温度过低，有机物燃烧不充分，温度过高可能导致无机物结晶度升高，进而影响其降解性[19-20]。李龙飞等[21]采用不同烧结温度对猪骨进行煅烧，发现随着煅烧温度由 600℃ 升至 1 000℃，晶体的结晶度明显升高。Bio-Oss 即利用小牛骨经过强碱处理后，低温（约 300℃）煅烧制备[22]。煅烧后的骨支架保留了松质骨天然的多孔结构，具有很好的骨传导性能，但不具备骨诱导活性。
DBM 则是通过酸脱去骨中矿物质，使得内源性 BMP-2 得以暴露，从而发挥骨诱导作用。其主要成分为胶原蛋白，脱钙后仍保持着多孔骨架结构，为细胞、血管、组织的长入提供有利环境，因此 DBM 兼具了骨传导性和骨诱导性。研究表明，BMP-2 具有高度保守性，其氨基酸序列在哺乳动物中是相同的，在不同种属间 BMP-2 可以发挥相同作用[23]。因此，保留异种骨的 BMP-2 对于提高异种骨修复材料的成骨活性具有显著意义。
本研究采用高压水枪冲洗可有效去除血液、骨髓等可见污物，进而利用超临界 CO2 技术对异种骨进行深度清洁，进一步减少脂肪和其他抗原成分，通过脱钙和煅烧工艺制备异种骨来源的有机物支架和无机物支架。两种支架主要成分不同，煅烧骨主要成分为羟基磷灰石，支架密度较大；DBM 主要成分为胶原蛋白，支架密度较小。两种材料 pH 值均在 5.5～6.1 之间，符合骨植入材料的要求。二者均保留了骨的天然多孔结构，其孔径和孔隙率无显著差异。煅烧骨支架亲水性更好，DBM 支架由于主要成分为胶原，而胶原蛋白主要为疏水性分子，所以其亲水性较差。细胞体外实验结果显示，煅烧和脱钙制备的两种异种骨支架均未表现出细胞毒性，并且两种支架都能促进成骨细胞增殖，DBM 促增殖效果优于煅烧骨，这可能与 DBM 所含内源性 BMP-2 释放有关。对两种材料免疫原性评价结果显示，DBM 和煅烧骨经过软组织去除、清洗、超临界 CO2 萃取等工序处理，其主要抗原细胞已被大量去除，DNA 残留水平远低于文献报道的评价组织材料脱细胞程度的标准：50 ng/mg 干重[24]。同时，人外周血淋巴细胞实验表明，两种支架均不会刺激外周血淋巴细胞增殖和分化。大鼠颅骨缺损修复实验结果显示，两种支架材料的成骨方式略有差异。煅烧骨支架降解性较差，术后 8 周仍可见大量材料残留；其主要依靠骨传导作用成骨，组织学结果显示新生骨围绕支架爬行。DBM 支架降解性较好，术后 8 周仅有少量材料残留，组织学观察可见新生骨呈点状、片状分布，成骨作用明显。两种材料在 Micro-CT 下显影程度不同，DBM 弱显影，而煅烧骨显影较亮。术后 4 周时，煅烧骨 BV/TV 大于脱钙骨，但是从组织学结果看并无显著差异，这可能与煅烧骨支架缓慢降解释放 Ca2+，形成密度类似于新骨的高 Ca2+ 区域有关。
综上述，不同类型的异种骨支架其理化性能、降解性和体内成骨作用可能存在差异。DBM 亲水性差，降解性较好，内源性 BMP-2 因脱钙处理得以充分暴露，具有很好的成骨活性；锻烧骨亲水性较好，降解性较差，因高温煅烧而失活，但天然多孔结构仍为成骨提供了良好条件。两种支架均无免疫原性且能够促进大鼠颅骨缺损修复，具有一定应用前景。
作者贡献：李矛直接参与材料制备、动物实验操作与结果评价，数据收集整理以及文章撰写；白玉龙参与材料制备与表征、动物实验、文章复核；李淼参与细胞实验和数据分析；周建伟提供实验设计思路并把控实验正确实施、文章审核修改，并对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：研究方案经首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会（TRECKY2021-060）及上海睿太莫斯生物科技有限公司动物福利伦理委员会批准（RM200214）。实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2016-0004。
