引用本文： 李晶莹, 朱斌, 张玉勤, 孟增东. 多孔氧化锌/羟基磷灰石复合材料的体内生物安全性研究. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(7): 847-854. doi: 10.7507/1002-1892.202101123 复制
由于创伤、感染、肿瘤等原因导致的骨缺损越来越多，目前主要采用自体骨、同种异体骨和异种骨移植修复。其中，自体骨骨源不足且存在供骨区并发症，同种异体骨和异种骨存在免疫排斥反应以及传播疾病风险[1-2]。因此，需要研发能促进受损骨组织修复或再生的人工骨修复材料。
羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是天然骨组织主要无机成分，具有优良的生物相容性及骨传导性，并且能直接与周围硬组织化学键合，增加骨骼附着力，是人工骨修复材料的理想基体材料之一[3]。但是，HA 作为骨修复材料仍然存在以下问题[4-7]：① 孔隙结构、活性成分与天然骨相比存在差异；② 植入体内后降解缓慢；③ 机械强度低。上述问题导致 HA 在临床应用中出现植骨延迟愈合或不愈合、降解与成骨速率不匹配、材料碎裂变形等现象，影响修复效果。采用新制备技术和添加具有促进成骨诱导的可降解活性元素是解决上述问题重要途径之一。
锌（Zn）作为天然骨中维持骨骼健康的重要元素之一，在促进骨形成和矿化方面起着重要作用。它通过促进成骨细胞和软骨细胞分化，同时抑制破骨细胞分化和吸收，从而促进骨生长[8]。氧化锌（ZnO）作为 Zn 的氧化物，不仅比 Zn 元素更稳定，而且具有良好的生物活性，少量 ZnO 即可促进细胞增殖和分化、组织再生、血管生成和骨整合[9]。本课题组在前期研究中将纳米 ZnO 作为活性添加相、HA 作为基体相、碳酸氢铵（NH4HCO3）作为造孔剂，利用放电等离子烧结技术制备了多孔 ZnO/HA 复合材料，经检测该复合材料以 HA 相和 ZnO 相为主，无其他杂质，抗压强度>148 MPa，弹性模量约 6.5 GPa，并且体外浸泡实验结果表明其具有良好的成骨矿化能力[10]。在此基础上，本次研究采用急性全身毒性实验和兔桡骨缺损模型，进一步观察多孔 ZnO/HA 复合材料的体内生物安全性和骨修复能力。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
5 周龄清洁级雄性昆明种小鼠 15 只，体质量 18～22 g；成年雄性新西兰大白兔 18 只，体质量约 3 kg；由昆明医科大学动物房提供。
纳米 HA，纯度≥99.7%，平均粒径≤100 nm；纳米 ZnO，纯度≥99.9%，粒径为（50±10）nm；医用级 NH4HCO3；均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。多聚甲醛（天津市光复科技发展有限公司）；红细胞裂解液（BD 公司，美国）。
电感耦合等离子体发射光谱仪（Perkin Elmer 公司，美国）；放电等离子烧结系统（SYNTEX 公司，日本）；万能试验机（济南中正试验机制造有限公司）；Quanta-200 型场发射扫描电镜（FEI 公司，美国）；石蜡包埋机、石蜡切片机（Leica 公司，德国）；流式细胞仪（杭州艾森生物有限公司）；全自动生化分析仪（Roche 公司，德国）；X 线机（Simens 公司，德国）。
1.2 材料制备及观测
1.2.1 材料制备
① 制备多孔 ZnO/HA 复合材料：按纳米 ZnO 质量分数为 1.3wt%、纳米 HA 质量分数为 98.7wt%，称取粉末[11]；经球磨、烘干后得到 ZnO/HA 复合粉末；将复合粉末与造孔剂 NH4HCO3 按照质量比 2∶1 混合后，均匀装入模具中，用万能试验机压制，退模后即可得到长方体状坯体；将坯体放入石墨模具中，在放电等离子烧结系统中进行快速烧结成型，抽真空至 2～10 Pa，不施加压力，先加热至 700℃（升温速率 100℃/min），再升温至 950℃（升温速率 50℃/min），保温 5 min 后随炉冷却至室温，获得多孔 ZnO/HA 复合材料。② 制备多孔 HA 材料：将纳米 HA 粉末与造孔剂 NH4HCO3 按照质量比 2∶1 混合，制备方法与多孔 ZnO/HA 复合材料一致，获得多孔 HA 材料。
1.2.2 材料表征
① 扫描电镜观察：将制备的两种材料用导电胶固定于载物台上，表面喷金，扫描电镜观察表面形貌和孔隙结构。
② 材料降解率测定：称取两种材料并记录原始质量；置于 37℃ 模拟人工体液（stimulated body fluid，SBF），每隔 7 d 取出 1 次，取出后用去离子水冲洗，干燥后称重，周期 49 d。按照以下公式计算各时间点材料降解率，降解率=（原始质量−各时间点质量）/原始质量×100%，根据各时间点降解率绘制材料降解曲线。实验重复 3 次。
③ 复合材料溶出 Zn2+ 浓度测定：37℃ 恒温下，将多孔 ZnO/HA 复合材料置于 50 mL SBF 浸泡 15 d，分别在 1、3、5、7、15 d 取 5 mL 浸泡液，利用电感耦合等离子体发射光谱仪测定浸泡液中 Zn2+ 浓度，根据各时间点 Zn2+ 浓度绘制多孔 ZnO/HA 复合材料的 Zn2+ 溶出曲线。每次取出浸泡液后均用新鲜 SBF 补充至 50 mL。实验重复 3 次。
1.2.3 急性全身毒性实验
① 材料浸提液制备：按照 GB/T16886.12-2017 中第 12 部分方法[12]，按照0.2 g/mL 浸提比例，将制备的两种材料分别置于生理盐水，于（37±1）℃ 条件下浸提 72 h，获得浸提液。采用电感耦合等离子体发射光谱仪测量多孔 ZnO/HA 复合材料浸提液中 Zn2+ 及 Ca2+ 含量。
② 实验分组及方法：按照 GB/T16886.11-2011 中第 11 部分方法[12]，将 15 只小鼠随机分为 A、B、C 3 组（n=5），按照 50 mL/kg 剂量分别腹腔注射生理盐水（阴性对照）、多孔 HA 材料浸提液、多孔 ZnO/HA 复合材料浸提液。
③ 观测指标：记录注射前和注射后 24、48、72 h 各组小鼠体质量变化以及呼吸、运动、排泄等一般情况。注射后 72 h 脱颈处死各组小鼠，取肝、肾组织，置于多聚甲醛固定、脱水、包埋并连续切片（片厚 5 µm），常规 HE 染色后光镜下观察。
1.3 动物体内植入实验
1.3.1 实验分组及方法
取成年雄性新西兰大白兔 18 只，根据处理方法不同随机分为 HA 组及 ZnO/HA 组，每组 9 只。
两组兔以耳缘静脉注射 3% 戊巴比妥溶液（1 mL/kg）麻醉后，双侧前肢剃毛、消毒，桡骨背侧皮肤纵向切开，钝性分离筋膜和肌肉后切开骨膜，将暴露的桡骨中段用线锯切除 1 cm 长组织，然后于右前肢骨缺损区植入大小为 10 mm×5 mm×5 mm 的多孔 HA 材料或多孔 ZnO/HA 复合材料；逐层缝合骨膜、肌肉筋膜和皮肤，消毒后纱布包扎。两组左侧前肢仅制备骨缺损模型，作为空白对照。术后 7 d 内隔天肌肉注射青霉素预防感染。
1.3.2 观测指标
① 观察术后两组动物饮食、活动以及切口愈合情况。
② 血常规检查：术前 1 d 和术后 1 d、1 周、4 周、8 周两组耳缘静脉抽血。取 100 μL 血液至 2 mL 离心管，加入 2 mL 用蒸馏水稀释的红细胞裂解液（稀释比例 1∶10），涡旋震荡混匀；室温避光孵育 10 min，以 400×g 离心 5 min，弃上清；加入 2 mL PBS，混匀后同上法离心 5 min，弃上清；加入 2 mL PBS 重悬细胞沉淀；最后在流式细胞仪上检测中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞含量。各时间点以中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞总含量作为炎症细胞含量进行统计分析。
③ 血生化检测：取上述相同时间点获得的静脉血，以 500×g 离心 20 min，取血清用全自动生化分析仪检测肝功能指标丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、总蛋白（total protein，TP），以及肾功能指标肌酐（creatinine，Cr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。
④ X 线片观察：术后 4、8、12 周两组兔同上法麻醉后，双侧桡骨摄 X 线片，观察桡骨缺损修复情况。
1.4 统计学方法
采用 GraphPad Prism 8 软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用重复测量方差分析，两两比较采用 Tukey 法检验；组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 材料观测
2.1.1 材料表征
扫描电镜观察示多孔 HA 材料与多孔 ZnO/HA 复合材料表面均存在不同形状、大小的孔隙，具有相互连通的大、小孔结构，孔径均在 50～500 μm 之间。见图 1。
图1
两种材料扫描电镜观察（×200）
a. 多孔 HA 材料；b. 多孔 ZnO/HA 复合材料
Figure1. Scanning electron microscope observation of two materials (×200)a. Porous HA material; b. Porous ZnO/HA composite material
材料降解曲线示，多孔 HA 材料和多孔 ZnO/HA 复合材料在浸泡早期略增重，几乎不发生降解。7 d 后材料降解开始加快，且多孔 ZnO/HA复合材料降解快于多孔 HA 材料。见图 2。
图2
两种材料降解曲线
Figure2.
Degradation curves of two materials
Zn2+ 溶出曲线示随着浸泡时间增加，多孔 ZnO/HA 复合材料中的 Zn2+ 不断释放，前 3 d Zn2+ 溶出较快，之后变缓慢，15 d 时仍有 Zn2+ 溶出。见图 3。
图3
多孔 ZnO/HA 复合材料 Zn2+ 溶出曲线
Figure3.
Zn2+ dissolution curve of porous ZnO/HA composite material
2.1.2 急性全身毒性实验
电感耦合等离子体发射光谱仪测量多孔 ZnO/HA 复合材料浸提液中，Zn2+ 含量为 0.024 mg/L、Ca2+ 含量为 0.180 mg/L。
注射材料浸提液 72 h 内，所有小鼠活动、饮食等均正常，未发现任何异常表现。与注射前相比，注射后 3 组小鼠体质量均增加，且随时间延长体质量差异亦有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
给药前后各时间点小鼠体质量
Figure4.
Body mass of mice at each time point before and after administration
注射后 72 h 所有小鼠处死后，大体观察见脏器颜色鲜亮，未发现腹水、脏器损坏等情况。肝、肾组织 HE 染色观察示组织细胞形态及结构均未见异常，各组细胞未见明显水肿及空泡，肾组织可见完好肾小球结构，并且在组织间无颗粒物质沉积。见图 5。
图5
小鼠 HE 染色观察（×40）
从左至右依次为 A、B、C 组 a. 肝组织；b. 肾组织
Figure5. HE staining observation of mice (×40)From left to right for groups A, B and C, respectively a. Liver tissue; b. Kidney tissue
2.2 动物体内植入实验
2.2.1 一般情况
所有兔均存活至实验完成。术后 1 d 饮食及活动恢复正常，无骨折或感染发生，2 周后皮肤切口均愈合。
2.2.2 血常规检测
术后 1 d，两组中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞均较术前 1 d 增多；术后 1 周，HA 组中性粒细胞、淋巴细胞较前减少，单核细胞增多，ZnO/HA 组中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞均减少；术后 4 周，HA 组中性粒细胞增多，单核细胞与术前 1 d 接近，淋巴细胞减少，ZnO/HA 组中性粒细胞增多，单核细胞和淋巴细胞与术前 1 d 接近；术后 8 周，两组中性粒细胞减少，单核细胞和淋巴细胞与术前 1 d 接近。见图 6。
图6
流式细胞仪检测各组各时间点中性粒细胞（E1）、单核细胞（E2）及淋巴细胞（E3）含量
从左至右依次是术前 1 d 及术后 1 d、1 周、4 周、8 周 a. HA 组；b. ZnO/HA 组
Figure6. The number of neutrophils (E1), monocytes (E2), and lymphocytes (E3) detected by flow cytometry in each group at each time pointFrom left to right for 1 day before operation and 1 day, 1 week, 4 weeks, and 8 weeks after operation, respectively a. HA group; b. ZnO/HA group
与术前 1 d 相比，HA 组术后 1 d及 1、4 周炎症细胞含量差异均有统计学意义（P<0.05），8 周时差异无统计学意义（P>0.05）；ZnO/HA 组除术后 1 d 与术前 1 d 比较差异有统计学意义（P<0.05）外，其他时间点与术前 1 d 比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 7。
图7
手术前后各时间点炎症细胞含量变化
Figure7.
Changes in the content of inflammatory cells at each time point before and after operation
2.2.3 血生化检测
术前 1 d 和术后 1 d、1 周、4 周和 8 周，两组肝功能指标 ALT、AST、TBIL、TP 以及肾功能指标 Cr 和 BUN 均在正常参考范围[13]波动，组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 8。
图8
手术前后各时间点两组肝、肾功能检测指标（虚线部分表示正常参考范围）
a. ALT；b. AST；c. TBIL；d. TP；e. Cr；f. BUN
Figure8. The liver and kidney function-related indicators of two groups at each time point before and after operation (the dotted line indicated the normal reference range)a. ALT; b. AST; c. TBIL; d. TP; e. Cr; f. BUN
2.2.4 X 线片观察
术后 4 周，两组材料仍在植入部位，无移位、断裂等现象，缺损部位可见新骨形成；但 HA 组骨折线明显，ZnO/HA 组骨折线模糊，开始发生骨整合。8 周时，空白对照骨缺损处有少量新骨形成；HA 组骨折线较 4 周时更模糊，但仍能观察到 X 线可透间隙；ZnO/HA 组进一步与宿主骨发生骨整合。12 周时，空白对照骨缺损区域有丰富骨组织，但仍未完成骨重建；HA 组及 ZnO/HA 组材料与宿主骨均发生骨整合，且 ZnO/HA 组优于 HA 组。见图 9。
图9
术后 4、8、12 周各组 X 线片观察
从左至右依次为 4、8、12 周 a. 空白对照；b. HA 组；c. ZnO/HA 组
Figure9. X-ray films of each group at 4, 8, and 12 weeks after operationFrom left to right for 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Blank control group; b. HA group; c. ZnO/HA group
3 讨论
理想的骨修复材料对生物相容性、孔隙率、降解率、促成骨能力等都有要求。本研究中，扫描电镜示利用放电等离子烧结技术制备的多孔 ZnO/HA 复合材料和多孔 HA 材料均具有大小孔并存的孔隙结构，孔径在 50～500 μm 之间，且前期研究显示材料孔隙率>40%[10]。研究表明，骨修复材料其孔隙率需达 40% 以上并且大孔孔径至少>150 μm、小孔孔径>40 μm，才有利于新骨和血管向孔内生长，新长入的血管可以将氧气和营养物质传递给骨缺损区域，从而促进新骨生长[14-15]。因此，本研究制备的多孔材料能为血管和骨组织长入提供足够空间。材料降解曲线显示，两种多孔材料前 7 d 降解均较慢，随着浸泡时间延长，降解开始加快。分析原因为前 7 d 材料在 SBF 溶解过程中会产生 PO43– 和 Ca2+，这些离子会顺着浓度梯度方向不断扩散。当 SBF 中上述离子浓度过饱和后，材料表面会出现类骨磷灰石沉积现象，从而出现增重情况；7 d 后材料迅速溶解出 PO43– 和 Ca2+，其溶解速率会逐渐大于类骨磷灰石形成速率，降解开始加快。多孔 ZnO/HA 复合材料降解快于多孔 HA 材料，说明 ZnO 的加入提高了材料降解率。Zn2+ 溶出曲线显示多孔 ZnO/HA 复合材料呈一种可持续、缓慢的 Zn2+ 溶出特性，这可能是在制备复合材料过程中，纳米 ZnO 被 HA 包裹，在 SBF 中会随着 HA 的降解而释放出来，然后再溶解释放 Zn2+，这样可以有效控制 Zn2+ 的释放速度。
骨修复材料在植入体内后除了修复受损组织外，还应该保证其安全无毒，不会对机体产生负面影响，因此需评估材料体内生物安全性。多孔 ZnO/HA 复合材料作为可降解植入材料，当其降解成分被释放进入体内后，有可能引起全身毒性反应，因此本研究首先进行急性全身毒性实验。结果显示小鼠注射两种材料浸提液 72 h 时体质量仍增加，说明材料浸提液中的 Zn2+、Ca2+ 等成分在进入体内后会被正常代谢，不会使小鼠因中毒而导致体质量下降或者死亡，并且对肝、肾组织也无毒害作用，初步判断多孔 ZnO/HA 复合材料安全。
为了进一步验证多孔 ZnO/HA 复合材料体内安全性，本研究进行了动物体内植入实验。理想的骨修复材料应具备良好生物相容性，植入体内后不会引起机体免疫排斥反应，不会产生严重炎症反应。血液中的中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞是与炎症相关的 3 种细胞，其数量增减能反映机体是否发生炎症[16]。血常规检测结果显示，术后 1 d 各组均出现炎症反应，可能是机体对于手术创伤的应激反应，术后 1 周炎症好转，术后 8 周炎症基本消失，说明多孔 ZnO/HA 复合材料植入体内后不会引起严重炎症反应。血生化结果显示两组材料植入后兔肝、肾功能均正常，并且各项指标组间差异无统计学意义。上述检测结果提示多孔 ZnO/HA 复合材料具有良好体内生物安全性。
最后，本研究利用 X 线片对多孔 ZnO/HA 复合材料的骨修复能力进行了初步评估。X 线片显示，与 HA 组相比，ZnO/HA 组在 4 周就开始了骨整合，初步说明多孔 ZnO/HA 复合材料能更好地促进骨修复，其原因可能是：① 复合材料具有合适的孔径与孔隙率以及掺入了 ZnO。在体外降解实验和体内植入实验中，多孔 ZnO/HA 复合材料降解较多孔 HA 材料快，随着复合材料的降解，孔隙会更快地变大，为新的骨骼和血管向内生长提供更多空间，并且 HA 会释放 PO43– 和 Ca2+ 等离子促进新骨矿化。② Zn2+ 的释放。随着多孔 ZnO/HA 复合材料的降解，Zn2+ 释放到体内会使局部微环境呈碱性，增强成骨细胞活性，并且 Zn2+ 可以直接激活成骨细胞中的氨基酰 tRNA 合成酶，刺激细胞蛋白质合成，从而促进骨组织生长和矿化[17-19]。但是 X 线片提示 12 周时两组材料仍比较完整，未发现材料大量降解情况，这可能与植入时间较短有关系。因此，在下一步研究中会延长材料植入时间，并且利用 micro-CT、组织学分析等方法对多孔 ZnO/HA 复合材料的骨修复能力进行深入评估。另外，感染是植骨失败的原因之一，有研究表明 Zn2+ 能通过与细菌 DNA 结合和破坏细菌膜结构，使细菌死亡，从而起到杀菌作用[20-21]，提示多孔 ZnO/HA 复合材料可能具备良好抗菌性能，但有待后续研究证实。
综上述，多孔 ZnO/HA 复合材料具有良好体内生物安全性，并初步表现良好的骨修复能力，是一种潜在骨修复材料。
作者贡献：李晶莹负责实验实施、数据收集整理及统计分析、文章撰写；朱斌修改文章；张玉勤提出修改意见；孟增东负责实验设计和经费支持。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经云南省第一人民医院医学伦理委员会批准（2018GJ077）。实验动物生产许可证号：SCXK（滇）K2020-0004，实验动物使用许可证号：SYXK（滇）K2020-0006。
由于创伤、感染、肿瘤等原因导致的骨缺损越来越多，目前主要采用自体骨、同种异体骨和异种骨移植修复。其中，自体骨骨源不足且存在供骨区并发症，同种异体骨和异种骨存在免疫排斥反应以及传播疾病风险[1-2]。因此，需要研发能促进受损骨组织修复或再生的人工骨修复材料。
羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是天然骨组织主要无机成分，具有优良的生物相容性及骨传导性，并且能直接与周围硬组织化学键合，增加骨骼附着力，是人工骨修复材料的理想基体材料之一[3]。但是，HA 作为骨修复材料仍然存在以下问题[4-7]：① 孔隙结构、活性成分与天然骨相比存在差异；② 植入体内后降解缓慢；③ 机械强度低。上述问题导致 HA 在临床应用中出现植骨延迟愈合或不愈合、降解与成骨速率不匹配、材料碎裂变形等现象，影响修复效果。采用新制备技术和添加具有促进成骨诱导的可降解活性元素是解决上述问题重要途径之一。
锌（Zn）作为天然骨中维持骨骼健康的重要元素之一，在促进骨形成和矿化方面起着重要作用。它通过促进成骨细胞和软骨细胞分化，同时抑制破骨细胞分化和吸收，从而促进骨生长[8]。氧化锌（ZnO）作为 Zn 的氧化物，不仅比 Zn 元素更稳定，而且具有良好的生物活性，少量 ZnO 即可促进细胞增殖和分化、组织再生、血管生成和骨整合[9]。本课题组在前期研究中将纳米 ZnO 作为活性添加相、HA 作为基体相、碳酸氢铵（NH4HCO3）作为造孔剂，利用放电等离子烧结技术制备了多孔 ZnO/HA 复合材料，经检测该复合材料以 HA 相和 ZnO 相为主，无其他杂质，抗压强度>148 MPa，弹性模量约 6.5 GPa，并且体外浸泡实验结果表明其具有良好的成骨矿化能力[10]。在此基础上，本次研究采用急性全身毒性实验和兔桡骨缺损模型，进一步观察多孔 ZnO/HA 复合材料的体内生物安全性和骨修复能力。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
5 周龄清洁级雄性昆明种小鼠 15 只，体质量 18～22 g；成年雄性新西兰大白兔 18 只，体质量约 3 kg；由昆明医科大学动物房提供。
纳米 HA，纯度≥99.7%，平均粒径≤100 nm；纳米 ZnO，纯度≥99.9%，粒径为（50±10）nm；医用级 NH4HCO3；均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。多聚甲醛（天津市光复科技发展有限公司）；红细胞裂解液（BD 公司，美国）。
电感耦合等离子体发射光谱仪（Perkin Elmer 公司，美国）；放电等离子烧结系统（SYNTEX 公司，日本）；万能试验机（济南中正试验机制造有限公司）；Quanta-200 型场发射扫描电镜（FEI 公司，美国）；石蜡包埋机、石蜡切片机（Leica 公司，德国）；流式细胞仪（杭州艾森生物有限公司）；全自动生化分析仪（Roche 公司，德国）；X 线机（Simens 公司，德国）。
1.2 材料制备及观测
1.2.1 材料制备
① 制备多孔 ZnO/HA 复合材料：按纳米 ZnO 质量分数为 1.3wt%、纳米 HA 质量分数为 98.7wt%，称取粉末[11]；经球磨、烘干后得到 ZnO/HA 复合粉末；将复合粉末与造孔剂 NH4HCO3 按照质量比 2∶1 混合后，均匀装入模具中，用万能试验机压制，退模后即可得到长方体状坯体；将坯体放入石墨模具中，在放电等离子烧结系统中进行快速烧结成型，抽真空至 2～10 Pa，不施加压力，先加热至 700℃（升温速率 100℃/min），再升温至 950℃（升温速率 50℃/min），保温 5 min 后随炉冷却至室温，获得多孔 ZnO/HA 复合材料。② 制备多孔 HA 材料：将纳米 HA 粉末与造孔剂 NH4HCO3 按照质量比 2∶1 混合，制备方法与多孔 ZnO/HA 复合材料一致，获得多孔 HA 材料。
1.2.2 材料表征
① 扫描电镜观察：将制备的两种材料用导电胶固定于载物台上，表面喷金，扫描电镜观察表面形貌和孔隙结构。
② 材料降解率测定：称取两种材料并记录原始质量；置于 37℃ 模拟人工体液（stimulated body fluid，SBF），每隔 7 d 取出 1 次，取出后用去离子水冲洗，干燥后称重，周期 49 d。按照以下公式计算各时间点材料降解率，降解率=（原始质量−各时间点质量）/原始质量×100%，根据各时间点降解率绘制材料降解曲线。实验重复 3 次。
③ 复合材料溶出 Zn2+ 浓度测定：37℃ 恒温下，将多孔 ZnO/HA 复合材料置于 50 mL SBF 浸泡 15 d，分别在 1、3、5、7、15 d 取 5 mL 浸泡液，利用电感耦合等离子体发射光谱仪测定浸泡液中 Zn2+ 浓度，根据各时间点 Zn2+ 浓度绘制多孔 ZnO/HA 复合材料的 Zn2+ 溶出曲线。每次取出浸泡液后均用新鲜 SBF 补充至 50 mL。实验重复 3 次。
1.2.3 急性全身毒性实验
① 材料浸提液制备：按照 GB/T16886.12-2017 中第 12 部分方法[12]，按照0.2 g/mL 浸提比例，将制备的两种材料分别置于生理盐水，于（37±1）℃ 条件下浸提 72 h，获得浸提液。采用电感耦合等离子体发射光谱仪测量多孔 ZnO/HA 复合材料浸提液中 Zn2+ 及 Ca2+ 含量。
② 实验分组及方法：按照 GB/T16886.11-2011 中第 11 部分方法[12]，将 15 只小鼠随机分为 A、B、C 3 组（n=5），按照 50 mL/kg 剂量分别腹腔注射生理盐水（阴性对照）、多孔 HA 材料浸提液、多孔 ZnO/HA 复合材料浸提液。
③ 观测指标：记录注射前和注射后 24、48、72 h 各组小鼠体质量变化以及呼吸、运动、排泄等一般情况。注射后 72 h 脱颈处死各组小鼠，取肝、肾组织，置于多聚甲醛固定、脱水、包埋并连续切片（片厚 5 µm），常规 HE 染色后光镜下观察。
1.3 动物体内植入实验
1.3.1 实验分组及方法
取成年雄性新西兰大白兔 18 只，根据处理方法不同随机分为 HA 组及 ZnO/HA 组，每组 9 只。
两组兔以耳缘静脉注射 3% 戊巴比妥溶液（1 mL/kg）麻醉后，双侧前肢剃毛、消毒，桡骨背侧皮肤纵向切开，钝性分离筋膜和肌肉后切开骨膜，将暴露的桡骨中段用线锯切除 1 cm 长组织，然后于右前肢骨缺损区植入大小为 10 mm×5 mm×5 mm 的多孔 HA 材料或多孔 ZnO/HA 复合材料；逐层缝合骨膜、肌肉筋膜和皮肤，消毒后纱布包扎。两组左侧前肢仅制备骨缺损模型，作为空白对照。术后 7 d 内隔天肌肉注射青霉素预防感染。
1.3.2 观测指标
① 观察术后两组动物饮食、活动以及切口愈合情况。
② 血常规检查：术前 1 d 和术后 1 d、1 周、4 周、8 周两组耳缘静脉抽血。取 100 μL 血液至 2 mL 离心管，加入 2 mL 用蒸馏水稀释的红细胞裂解液（稀释比例 1∶10），涡旋震荡混匀；室温避光孵育 10 min，以 400×g 离心 5 min，弃上清；加入 2 mL PBS，混匀后同上法离心 5 min，弃上清；加入 2 mL PBS 重悬细胞沉淀；最后在流式细胞仪上检测中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞含量。各时间点以中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞总含量作为炎症细胞含量进行统计分析。
③ 血生化检测：取上述相同时间点获得的静脉血，以 500×g 离心 20 min，取血清用全自动生化分析仪检测肝功能指标丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、总蛋白（total protein，TP），以及肾功能指标肌酐（creatinine，Cr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。
④ X 线片观察：术后 4、8、12 周两组兔同上法麻醉后，双侧桡骨摄 X 线片，观察桡骨缺损修复情况。
1.4 统计学方法
采用 GraphPad Prism 8 软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示，组内各时间点间比较采用重复测量方差分析，两两比较采用 Tukey 法检验；组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 材料观测
2.1.1 材料表征
扫描电镜观察示多孔 HA 材料与多孔 ZnO/HA 复合材料表面均存在不同形状、大小的孔隙，具有相互连通的大、小孔结构，孔径均在 50～500 μm 之间。见图 1。
图1
两种材料扫描电镜观察（×200）
a. 多孔 HA 材料；b. 多孔 ZnO/HA 复合材料
Figure1. Scanning electron microscope observation of two materials (×200)a. Porous HA material; b. Porous ZnO/HA composite material
材料降解曲线示，多孔 HA 材料和多孔 ZnO/HA 复合材料在浸泡早期略增重，几乎不发生降解。7 d 后材料降解开始加快，且多孔 ZnO/HA复合材料降解快于多孔 HA 材料。见图 2。
图2
两种材料降解曲线
Figure2.
Degradation curves of two materials
Zn2+ 溶出曲线示随着浸泡时间增加，多孔 ZnO/HA 复合材料中的 Zn2+ 不断释放，前 3 d Zn2+ 溶出较快，之后变缓慢，15 d 时仍有 Zn2+ 溶出。见图 3。
图3
多孔 ZnO/HA 复合材料 Zn2+ 溶出曲线
Figure3.
Zn2+ dissolution curve of porous ZnO/HA composite material
2.1.2 急性全身毒性实验
电感耦合等离子体发射光谱仪测量多孔 ZnO/HA 复合材料浸提液中，Zn2+ 含量为 0.024 mg/L、Ca2+ 含量为 0.180 mg/L。
注射材料浸提液 72 h 内，所有小鼠活动、饮食等均正常，未发现任何异常表现。与注射前相比，注射后 3 组小鼠体质量均增加，且随时间延长体质量差异亦有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
给药前后各时间点小鼠体质量
Figure4.
Body mass of mice at each time point before and after administration
注射后 72 h 所有小鼠处死后，大体观察见脏器颜色鲜亮，未发现腹水、脏器损坏等情况。肝、肾组织 HE 染色观察示组织细胞形态及结构均未见异常，各组细胞未见明显水肿及空泡，肾组织可见完好肾小球结构，并且在组织间无颗粒物质沉积。见图 5。
图5
小鼠 HE 染色观察（×40）
从左至右依次为 A、B、C 组 a. 肝组织；b. 肾组织
Figure5. HE staining observation of mice (×40)From left to right for groups A, B and C, respectively a. Liver tissue; b. Kidney tissue
2.2 动物体内植入实验
2.2.1 一般情况
所有兔均存活至实验完成。术后 1 d 饮食及活动恢复正常，无骨折或感染发生，2 周后皮肤切口均愈合。
2.2.2 血常规检测
术后 1 d，两组中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞均较术前 1 d 增多；术后 1 周，HA 组中性粒细胞、淋巴细胞较前减少，单核细胞增多，ZnO/HA 组中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞均减少；术后 4 周，HA 组中性粒细胞增多，单核细胞与术前 1 d 接近，淋巴细胞减少，ZnO/HA 组中性粒细胞增多，单核细胞和淋巴细胞与术前 1 d 接近；术后 8 周，两组中性粒细胞减少，单核细胞和淋巴细胞与术前 1 d 接近。见图 6。
图6
流式细胞仪检测各组各时间点中性粒细胞（E1）、单核细胞（E2）及淋巴细胞（E3）含量
从左至右依次是术前 1 d 及术后 1 d、1 周、4 周、8 周 a. HA 组；b. ZnO/HA 组
Figure6. The number of neutrophils (E1), monocytes (E2), and lymphocytes (E3) detected by flow cytometry in each group at each time pointFrom left to right for 1 day before operation and 1 day, 1 week, 4 weeks, and 8 weeks after operation, respectively a. HA group; b. ZnO/HA group
与术前 1 d 相比，HA 组术后 1 d及 1、4 周炎症细胞含量差异均有统计学意义（P<0.05），8 周时差异无统计学意义（P>0.05）；ZnO/HA 组除术后 1 d 与术前 1 d 比较差异有统计学意义（P<0.05）外，其他时间点与术前 1 d 比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 7。
图7
手术前后各时间点炎症细胞含量变化
Figure7.
Changes in the content of inflammatory cells at each time point before and after operation
2.2.3 血生化检测
术前 1 d 和术后 1 d、1 周、4 周和 8 周，两组肝功能指标 ALT、AST、TBIL、TP 以及肾功能指标 Cr 和 BUN 均在正常参考范围[13]波动，组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 8。
图8
手术前后各时间点两组肝、肾功能检测指标（虚线部分表示正常参考范围）
a. ALT；b. AST；c. TBIL；d. TP；e. Cr；f. BUN
Figure8. The liver and kidney function-related indicators of two groups at each time point before and after operation (the dotted line indicated the normal reference range)a. ALT; b. AST; c. TBIL; d. TP; e. Cr; f. BUN
2.2.4 X 线片观察
术后 4 周，两组材料仍在植入部位，无移位、断裂等现象，缺损部位可见新骨形成；但 HA 组骨折线明显，ZnO/HA 组骨折线模糊，开始发生骨整合。8 周时，空白对照骨缺损处有少量新骨形成；HA 组骨折线较 4 周时更模糊，但仍能观察到 X 线可透间隙；ZnO/HA 组进一步与宿主骨发生骨整合。12 周时，空白对照骨缺损区域有丰富骨组织，但仍未完成骨重建；HA 组及 ZnO/HA 组材料与宿主骨均发生骨整合，且 ZnO/HA 组优于 HA 组。见图 9。
图9
术后 4、8、12 周各组 X 线片观察
从左至右依次为 4、8、12 周 a. 空白对照；b. HA 组；c. ZnO/HA 组
Figure9. X-ray films of each group at 4, 8, and 12 weeks after operationFrom left to right for 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Blank control group; b. HA group; c. ZnO/HA group
3 讨论
理想的骨修复材料对生物相容性、孔隙率、降解率、促成骨能力等都有要求。本研究中，扫描电镜示利用放电等离子烧结技术制备的多孔 ZnO/HA 复合材料和多孔 HA 材料均具有大小孔并存的孔隙结构，孔径在 50～500 μm 之间，且前期研究显示材料孔隙率>40%[10]。研究表明，骨修复材料其孔隙率需达 40% 以上并且大孔孔径至少>150 μm、小孔孔径>40 μm，才有利于新骨和血管向孔内生长，新长入的血管可以将氧气和营养物质传递给骨缺损区域，从而促进新骨生长[14-15]。因此，本研究制备的多孔材料能为血管和骨组织长入提供足够空间。材料降解曲线显示，两种多孔材料前 7 d 降解均较慢，随着浸泡时间延长，降解开始加快。分析原因为前 7 d 材料在 SBF 溶解过程中会产生 PO43– 和 Ca2+，这些离子会顺着浓度梯度方向不断扩散。当 SBF 中上述离子浓度过饱和后，材料表面会出现类骨磷灰石沉积现象，从而出现增重情况；7 d 后材料迅速溶解出 PO43– 和 Ca2+，其溶解速率会逐渐大于类骨磷灰石形成速率，降解开始加快。多孔 ZnO/HA 复合材料降解快于多孔 HA 材料，说明 ZnO 的加入提高了材料降解率。Zn2+ 溶出曲线显示多孔 ZnO/HA 复合材料呈一种可持续、缓慢的 Zn2+ 溶出特性，这可能是在制备复合材料过程中，纳米 ZnO 被 HA 包裹，在 SBF 中会随着 HA 的降解而释放出来，然后再溶解释放 Zn2+，这样可以有效控制 Zn2+ 的释放速度。
骨修复材料在植入体内后除了修复受损组织外，还应该保证其安全无毒，不会对机体产生负面影响，因此需评估材料体内生物安全性。多孔 ZnO/HA 复合材料作为可降解植入材料，当其降解成分被释放进入体内后，有可能引起全身毒性反应，因此本研究首先进行急性全身毒性实验。结果显示小鼠注射两种材料浸提液 72 h 时体质量仍增加，说明材料浸提液中的 Zn2+、Ca2+ 等成分在进入体内后会被正常代谢，不会使小鼠因中毒而导致体质量下降或者死亡，并且对肝、肾组织也无毒害作用，初步判断多孔 ZnO/HA 复合材料安全。
为了进一步验证多孔 ZnO/HA 复合材料体内安全性，本研究进行了动物体内植入实验。理想的骨修复材料应具备良好生物相容性，植入体内后不会引起机体免疫排斥反应，不会产生严重炎症反应。血液中的中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞是与炎症相关的 3 种细胞，其数量增减能反映机体是否发生炎症[16]。血常规检测结果显示，术后 1 d 各组均出现炎症反应，可能是机体对于手术创伤的应激反应，术后 1 周炎症好转，术后 8 周炎症基本消失，说明多孔 ZnO/HA 复合材料植入体内后不会引起严重炎症反应。血生化结果显示两组材料植入后兔肝、肾功能均正常，并且各项指标组间差异无统计学意义。上述检测结果提示多孔 ZnO/HA 复合材料具有良好体内生物安全性。
最后，本研究利用 X 线片对多孔 ZnO/HA 复合材料的骨修复能力进行了初步评估。X 线片显示，与 HA 组相比，ZnO/HA 组在 4 周就开始了骨整合，初步说明多孔 ZnO/HA 复合材料能更好地促进骨修复，其原因可能是：① 复合材料具有合适的孔径与孔隙率以及掺入了 ZnO。在体外降解实验和体内植入实验中，多孔 ZnO/HA 复合材料降解较多孔 HA 材料快，随着复合材料的降解，孔隙会更快地变大，为新的骨骼和血管向内生长提供更多空间，并且 HA 会释放 PO43– 和 Ca2+ 等离子促进新骨矿化。② Zn2+ 的释放。随着多孔 ZnO/HA 复合材料的降解，Zn2+ 释放到体内会使局部微环境呈碱性，增强成骨细胞活性，并且 Zn2+ 可以直接激活成骨细胞中的氨基酰 tRNA 合成酶，刺激细胞蛋白质合成，从而促进骨组织生长和矿化[17-19]。但是 X 线片提示 12 周时两组材料仍比较完整，未发现材料大量降解情况，这可能与植入时间较短有关系。因此，在下一步研究中会延长材料植入时间，并且利用 micro-CT、组织学分析等方法对多孔 ZnO/HA 复合材料的骨修复能力进行深入评估。另外，感染是植骨失败的原因之一，有研究表明 Zn2+ 能通过与细菌 DNA 结合和破坏细菌膜结构，使细菌死亡，从而起到杀菌作用[20-21]，提示多孔 ZnO/HA 复合材料可能具备良好抗菌性能，但有待后续研究证实。
综上述，多孔 ZnO/HA 复合材料具有良好体内生物安全性，并初步表现良好的骨修复能力，是一种潜在骨修复材料。
作者贡献：李晶莹负责实验实施、数据收集整理及统计分析、文章撰写；朱斌修改文章；张玉勤提出修改意见；孟增东负责实验设计和经费支持。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经云南省第一人民医院医学伦理委员会批准（2018GJ077）。实验动物生产许可证号：SCXK（滇）K2020-0004，实验动物使用许可证号：SYXK（滇）K2020-0006。
