引用本文： 焦海山, 宋悦宁, 黄健, 李东印, 胡毅. 改性壳聚糖基导电复合材料神经导管的体内降解及组织相容性观察. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(6): 769-775. doi: 10.7507/1002-1892.202101088 复制
神经缺损最佳治疗方法是自体神经移植修复，但存在供体来源有限、供区失神经功能障碍、神经瘤形成等问题。组织工程神经作为自体神经移植替代物，已成为神经再生的一个重要研究方向。组织工程神经构建需考虑支架、种子细胞和生长因子三要素，在众多组织工程神经支架材料中，甲壳素及壳聚糖在生物相容性和降解性等方面优势明显，两者各有优缺点。壳聚糖为甲壳素脱乙酰基所得，溶解性明显高于天然甲壳素，方便去除共存杂质，较易加工成形；而甲壳素在降解速度和机械性能方面有一定优势，但天然甲壳素溶解性差，不易加工处理，且与甲壳素共存的蛋白质难以清除[1-5]。
综合考虑神经组织的可兴奋性、神经细胞依靠动作电位传递信息、外界刺激会影响神经细胞黏附及生长等电生理特性因素，理想的组织工程神经支架材料除需具备独特的形貌特征、良好的降解性及组织相容性外，还需具备导电性能，从而使组织工程神经与体内神经组织形成良好的电生理整合；以及当联合应用电刺激时在神经缺损移植部位能建立局部电环境，充当神经组织间电信号传递的桥梁，通过增强神经分化增加内源性神经因子的表达，促进轴突早期萌发，提高神经再生率等，进而发挥促神经再生作用[6-9]。但是甲壳素、壳聚糖均不具备导电性能，为解决这一问题，本课题组前期研究[10]制备了纳米聚吡咯（polypyrrole，PPy），并对壳聚糖进行乙酰化改性，构建纳米 PPy/甲壳素复合材料，初步观察显示该复合材料具备导电性以及较好的体外生物相容性和降解性，但其体内组织相容性和降解情况尚不明确。在此基础上，本次研究制备了改性壳聚糖基导电复合材料神经导管（以下简称：新型复合材料导管），通过观察该导管体内降解及组织相容性，探讨其作为组织工程神经支架材料的可行性。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
健康雌性 SD 大鼠 30 只，体质量 160～180 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。壳聚糖（脱乙酰度 90%，南通兴成生物制品厂）；吡咯、小鼠抗巨噬细胞单抗（Sigma 公司，美国）、羊抗小鼠 IgG-TRITC（武汉博士德生物工程有限公司）。
VERTEX 70 傅里叶红外光谱仪（Bruker 公司，德国）；S4700 扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；M-3 四探针电导测试仪（苏州晶格电子有限公司）；冰冻切片机（Leica 公司，德国）；TI CFIS60 倒置荧光显微镜（Nikon 公司，日本）。
1.2 新型复合材料导管的制备及表征
1.2.1 制备方法
参照本课题组前期研究采用的微乳液聚合法[10-11]合成纳米 PPy。具体方法：① 以十二烷基苯磺酸水溶液为乳化剂、FeCl3 为氧化剂，按照 1∶3.75 比例混合制备微乳液，将一定量吡咯单体加入微乳液中；室温下聚合反应 24 h 后，丙酮终止反应；大量去离子水水洗，以离心半径 3.5 cm、6 500 r/min 离心 5 min，分离沉淀，真空干燥后即得纳米 PPy 粉末。取一定量纳米 PPy 粉末，加入 0.5% 醋酸溶液中超声震荡，制备 1.5%纳米 PPy 悬液。
② 采用 1% 醋酸溶解壳聚糖，制备 3% 壳聚糖溶液后，加入 1.5%纳米 PPy 悬液，配成 3%纳米 PPy/壳聚糖混合溶液，搅拌 4 h 后真空减压脱气；将混合溶液注入定制的成管模型，冷冻干燥，1.5%NaOH 脱酸中和 24 h，去离子水水洗至中性，冷冻干燥，获得改性纳米 PPy/壳聚糖复合材料导管（记作 CP 导管）。
③ 参照文献［12］方法对 CP 导管进行乙酰化处理。将 CP 导管置于 150 mL 5% 醋酐甲醇溶液中，室温下分别乙酰化反应 30、60、90 min 后，置于 4%NaOH 溶液处理，去离子水水洗至中性，冷冻干燥，获得不同乙酰度的 CP 导管（分别记作 CAP1、CAP2、CAP3 导管），即新型复合材料导管。将各导管行环氧乙烷消毒后用于体内实验。
1.2.2 表征方法
取 CP、CAP1、CAP2、CAP3 导管进行以下观测：① 采用傅里叶红外光谱仪测定红外光谱图，以董炎明等[13]报道的红外光谱法测定导管壳聚糖乙酰度；② 导管经干燥、喷金后，扫描电镜观察表面形态及结构；③ 游标卡尺测量导管内径、壁厚，采用四探针电导测试仪测定导管电导率。
1.3 新型复合材料导管体内降解及组织相容性观测
1.3.1 动物模型制备
取 30 只大鼠腹腔注射复合麻醉剂（0.3 mL/100 g）后俯卧固定，术区备皮、消毒、铺巾，在背部中线两侧旁开 0.5 cm 作纵切口，左、右侧各 4 个切口；钝性分离皮下筋膜，距切口约 1 cm 处制备隧道；两侧 4 个切口分别植入 1 个 CP、CAP1、CAP2、CAP3 导管，缝合关闭切口。术后 2、4、6、8、10、12 周各取 5 只动物，同法麻醉后按照原切口入路取材进行观测。
1.3.2 观测指标
① 大体观察：术后观察切口有无感染发生，4、8、12 周取材后大体观察导管形态及完整性。② 神经导管降解观测：植入前导管称重（W1）；取 2、4、6、8、10、12 周样本，剥离导管表面结缔组织，双蒸水清洗 3 遍，以胶原酶和胰蛋白酶依次处理，再以 1%Triton X-100 去垢剂冲洗，双蒸水清洗，冻干后称重（W2），按以下公式计算降解率：降解率=（W1−W2）/W1×100%。③ 扫描电镜观察：取 12 周样本干燥、喷金后，扫描电镜观察导管表面形态及微观结构。④ 组织学观察：取 4、8、12 周样本置于 4% 多聚甲醛溶液，经梯度蔗糖溶液处理后， 5% 蔗糖包埋并连续切片，片厚 10 μm，常规 HE 染色和抗巨噬细胞免疫荧光染色 ［一抗：小鼠抗巨噬细胞单抗（1∶150），二抗：羊抗小鼠 IgG-TRITC（1∶250）］ 观察。
1.4 统计学方法
采用 SPSS25.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 新型复合材料导管表征
2.1.1 傅里叶红外光谱仪测定
红外光谱图显示 CP、CAP1、CAP2 和 CAP3 导管均可见 1 310 cm−1左右的酰胺Ⅲ谱带（C-N）和 1 647 cm−1左右的酰胺Ⅰ谱带（C=O）；其中，CP 导管可见 1 590 cm−1左右的壳聚糖 NH2 弯曲振动特征峰，CAP1、CAP2 和 CAP3 导管由于 1 562 cm−1左右的酰胺Ⅱ谱带增强，掩盖了 NH2 弯曲振动特征峰（图 1）。乙酰度测量显示 CP 导管为 9.19%（与商品壳聚糖标示脱乙酰度 90% 相符），CAP1、CAP2、CAP3 导管分别为 33.8%、64.0%、82.2%。上述结果提示壳聚糖经乙酰化处理，获得不同程度乙酰化改性壳聚糖材料。
图1
各导管红外光谱图
a：CP导管 b：CAP1导管 c：CAP2导管 d：CAP3导管
Figure1. Fourier infrared absorption spectrum of conduitsa: CP conduit b: CAP1 conduit c: CAP2 conduit d: CAP3 conduit
2.1.2 扫描电镜观察
镜下见导管表面相对光滑，结构致密，各导管间无明显差异，提示乙酰化处理未显著改变材料微观结构和表面形态。见图 2。
图2
各导管扫描电镜观察（×5 000）
a. CP导管；b. CAP1导管；c. CAP2导管；d. CAP3导管
Figure2. SEM observation of conduits (×5 000)a. CP conduit; b. CAP1 conduit; c. CAP2 conduit; d. CAP3 conduit
2.1.3 导电性能测试
各导管内径 1.4 mm、壁厚 0.2 mm，管壁有较多孔隙。CP、CAP1、CAP2、CAP3 导管电导率分别为（1.263±0.021）×10−3、（1.270±0.011）×10−3、（1.256±0.012）×10−3、（1.259±0.012）×10−3 S/cm，组间差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2 材料体内降解及组织相容性观测
2.2.1 大体观察
各导管植入后，动物切口均无红肿等感染症状出现。术后 4 周，各导管周围有结缔组织包裹，均保持原外形，周围无明显炎症，血管丰富；8 周时，CAP3 导管形态开始变化，其余导管均保持相对完整；12 周时，各导管均出现一定塌陷，其中 CAP3 导管塌陷尤为明显。各时间点取材时均容易剥离。
2.2.2 神经导管降解观测
随植入时间延长，各导管均出现不同程度质量丢失，且乙酰化度越高，质量变化越大；各时间点降解率组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
各时间点各导管降解率
Figure3.
The degradation rate of each conduit at each time point
2.2.3 扫描电镜观察
术后 12 周导管材料出现较多孔隙，且随着乙酰化度增加，孔隙呈增大趋势。见图 4。
图4
术后12周各导管扫描电镜观察（×5 000）
a. CP导管；b. CAP1导管；c. CAP2导管；d. CAP3导管
Figure4. SEM observation of conduits at 12 weeks after implantation (×5 000)a. CP conduit; b. CAP1 conduit; c. CAP2 conduit; d. CAP3 conduit
2.2.4 HE 染色
镜下观察见各导管植入后早期均有较多淋巴细胞浸润，随植入时间延长，淋巴细胞减少、成纤维细胞增多、胶原纤维增生明显；8 周时 CP、CAP1、CAP2 导管仍可见导管轮廓，CAP3 导管塌陷明显、结缔组织长入；12 周时，各导管均出现不同程度塌陷、结缔组织长入、胶原纤维增生包裹，血管丰富。见图 5。
图5
植入后各导管HE染色观察（×640）
从左至右分别为CP、CAP1、CAP2、CAP3导管 a. 术后4周；b. 术后8周；c. 术后12周
Figure5. HE staining of each conduit after implantation (×640)From left to right for CP, CAP1, CAP2, and CAP3 couduits, respectively a. At 4 weeks after implantation; b. At 8 weeks after implantation; c. At 12 weeks after implantation
2.2.5 免疫荧光染色观察
各导管植入后在早期均有较多巨噬细胞、淋巴细胞浸润，随植入时间延长，淋巴细胞有所减少，成纤维细胞增多，胶原纤维增生明显。见图 6。
图6
植入后各导管免疫荧光染色观察（×200）
从左至右分别为CP、CAP1、CAP2、CAP3导管 a. 术后4周；b. 术后8周；c. 术后12周
Figure6. Immunofluorescence staining of each conduit after implantation (×200)From left to right for CP, CAP1, CAP2, and CAP3 couduits, respectively a. At 4 weeks after implantation; b. At 8 weeks after implantation; c. At 12 weeks after implantation
3 讨论
近年来，组织工程神经成为神经再生研究领域的热点，而理想的支架材料又是组织工程神经构建的关键[9, 14]。鉴于神经组织本身的电生理特性以及电刺激在神经再生中的重要作用[2, 6, 15-16]，学者们开始研究新型导电材料，并提出导电性是理想组织工程神经支架材料的特性之一[6-10]。目前研究使用较多的导电材料有 PPy、聚乙撑二氧噻吩、石墨烯等，其中对 PPy 的研究相对较多。常用于 PPy 的聚合方法包括电化学聚合、化学氧化、模板法、静电纺丝法等，本研究采用的是被誉为制备纳米粒子“万能方法”的微乳液聚合法。本课题组前期研究表明，该方法制备的 PPy 达到纳米级，经红外光谱仪鉴定符合 PPy 的红外光谱特点，且成功掺杂十二烷基苯磺酸[10]，为通过改变 PPy 尺寸实现导电高聚物降解创造了条件。
目前，壳聚糖的乙酰化改性方法已较成熟。一般认为在甲醇或乙醇体系中以乙酸酐作为酰化剂，对壳聚糖进行 N-乙酰化改性较简便。另外，由于氨基反应活性比羟基大，乙酰化反应首先在氨基上发生，得到 O-乙酰化的壳聚糖反而较困难[17]。本研究中改性后材料的红外光谱未观察到 O-酰基特征吸收峰，说明酸酐与壳聚糖的氨基发生了乙酰化反应，得到了研究需要的改性壳聚糖。因 PPy 在复合材料中占比低于 10%，难以明显影响红外光谱中吸收峰的特点。
一般认为，PPy 本身具有较好的生物安全性[18-19]，而壳聚糖经 N-乙酰化改性后，乙酰化本身也不会影响材料的生物安全性[12, 20]。本课题组前期研究提示纳米 PPy/壳聚糖及改性的纳米 PPy/壳聚糖材料均具有较好的体外生物相容性[10]。本研究将不同乙酰度的改性纳米 PPy/壳聚糖导管材料植入大鼠皮下，通过组织学方法观察植入材料体内组织相容性。结果显示各组导管在植入早期均有较多淋巴细胞、巨噬细胞浸润，随着时间延长，淋巴细胞和巨噬细胞均逐渐减少，而成纤维细胞逐渐增多，胶原纤维增生明显，血管顺利长入，表明材料未对周围组织产生明显异物刺激和不良反应，具有较好的组织相容性。另一方面，一定程度的巨噬细胞聚集对 N-乙酰化改性壳聚糖的降解可能有促进作用。因为 N-乙酰化改性壳聚糖的降解主要是通过溶菌酶水解其糖苷键实现解聚[12, 20]，而局部出现的巨噬细胞及其他炎症细胞可在局部微环境释放溶菌酶，对 N-乙酰化后的壳聚糖生物降解具有一定促进作用。
本研究制备的新型复合材料导管经检测具备导电性能，其电导率与文献报道的不同浓度 PPy 对应的电导率基本类似[11]，增加 PPy 在复合材料中的浓度固然可以获得更好导电性能，但考虑到 PPy 本身力学性能差、尚未发现可被体内某种酶降解、缺少活性基团等缺陷，目前研究常将纳米 PPy 与其他可降解材料制备成复合材料[7, 11, 18]，期望利用其小尺寸优势能被排泄器官排出体外，但纳米尺寸的粒子团聚问题尚无满意解决方案，因而本研究在文献报道基础上在导电和降解之间进行选择，采用 3%纳米 PPy 制备导管材料，以期使导管在具备导电能力同时解决 PPy 的降解问题。
一般认为壳聚糖及甲壳素均具备降解性，但在一定脱乙酰度范围内，其降解性能与脱乙酰度成负相关[20-21]，文献报道经过乙酰化改性的壳聚糖比壳聚糖本体具有更好的生物降解性，而且通过改变乙酰化程度可以控制壳聚糖的降解速率[12]。本研究结果与上述文献报道结论相符，随着乙酰度增加，导管降解有加快趋势，这将有助于解决壳聚糖降解速度慢导致其在体内留存较长时间的问题，但是也不能片面追求降解速度而忽视神经再生对完整导管的依赖。
综上述，本研究制备的新型复合材料导管具备较好的体内生物相容性、降解性，以及一定导电性能，初步具备作为组织工程神经支架材料的特性。下一步将通过桥接修复神经缺损实验筛选合适的改性壳聚糖材料，使其既具有理想组织工程支架材料的生物相容性、适合支持神经再生的降解速度、良好的可塑性及生物安全性，又具备良好的导电性，为后续在导电材料基础上引入低频电刺激，使组织工程支架材料与电刺激的联合应用成为可能，以提高周围神经再生能力。
作者贡献：焦海山负责实验设计及实施，起草文章；宋悦宁负责实验实施，数据分析，对文章的知识性内容作批评性审阅；黄健负责数据收集整理；胡毅负责实验实施；李东印负责动物实验。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经苏州卫生职业技术学院动物实验伦理委员会批准（SWAE201906）。实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2016-0049。
神经缺损最佳治疗方法是自体神经移植修复，但存在供体来源有限、供区失神经功能障碍、神经瘤形成等问题。组织工程神经作为自体神经移植替代物，已成为神经再生的一个重要研究方向。组织工程神经构建需考虑支架、种子细胞和生长因子三要素，在众多组织工程神经支架材料中，甲壳素及壳聚糖在生物相容性和降解性等方面优势明显，两者各有优缺点。壳聚糖为甲壳素脱乙酰基所得，溶解性明显高于天然甲壳素，方便去除共存杂质，较易加工成形；而甲壳素在降解速度和机械性能方面有一定优势，但天然甲壳素溶解性差，不易加工处理，且与甲壳素共存的蛋白质难以清除[1-5]。
综合考虑神经组织的可兴奋性、神经细胞依靠动作电位传递信息、外界刺激会影响神经细胞黏附及生长等电生理特性因素，理想的组织工程神经支架材料除需具备独特的形貌特征、良好的降解性及组织相容性外，还需具备导电性能，从而使组织工程神经与体内神经组织形成良好的电生理整合；以及当联合应用电刺激时在神经缺损移植部位能建立局部电环境，充当神经组织间电信号传递的桥梁，通过增强神经分化增加内源性神经因子的表达，促进轴突早期萌发，提高神经再生率等，进而发挥促神经再生作用[6-9]。但是甲壳素、壳聚糖均不具备导电性能，为解决这一问题，本课题组前期研究[10]制备了纳米聚吡咯（polypyrrole，PPy），并对壳聚糖进行乙酰化改性，构建纳米 PPy/甲壳素复合材料，初步观察显示该复合材料具备导电性以及较好的体外生物相容性和降解性，但其体内组织相容性和降解情况尚不明确。在此基础上，本次研究制备了改性壳聚糖基导电复合材料神经导管（以下简称：新型复合材料导管），通过观察该导管体内降解及组织相容性，探讨其作为组织工程神经支架材料的可行性。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
健康雌性 SD 大鼠 30 只，体质量 160～180 g，由中国科学院上海实验动物中心提供。壳聚糖（脱乙酰度 90%，南通兴成生物制品厂）；吡咯、小鼠抗巨噬细胞单抗（Sigma 公司，美国）、羊抗小鼠 IgG-TRITC（武汉博士德生物工程有限公司）。
VERTEX 70 傅里叶红外光谱仪（Bruker 公司，德国）；S4700 扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；M-3 四探针电导测试仪（苏州晶格电子有限公司）；冰冻切片机（Leica 公司，德国）；TI CFIS60 倒置荧光显微镜（Nikon 公司，日本）。
1.2 新型复合材料导管的制备及表征
1.2.1 制备方法
参照本课题组前期研究采用的微乳液聚合法[10-11]合成纳米 PPy。具体方法：① 以十二烷基苯磺酸水溶液为乳化剂、FeCl3 为氧化剂，按照 1∶3.75 比例混合制备微乳液，将一定量吡咯单体加入微乳液中；室温下聚合反应 24 h 后，丙酮终止反应；大量去离子水水洗，以离心半径 3.5 cm、6 500 r/min 离心 5 min，分离沉淀，真空干燥后即得纳米 PPy 粉末。取一定量纳米 PPy 粉末，加入 0.5% 醋酸溶液中超声震荡，制备 1.5%纳米 PPy 悬液。
② 采用 1% 醋酸溶解壳聚糖，制备 3% 壳聚糖溶液后，加入 1.5%纳米 PPy 悬液，配成 3%纳米 PPy/壳聚糖混合溶液，搅拌 4 h 后真空减压脱气；将混合溶液注入定制的成管模型，冷冻干燥，1.5%NaOH 脱酸中和 24 h，去离子水水洗至中性，冷冻干燥，获得改性纳米 PPy/壳聚糖复合材料导管（记作 CP 导管）。
③ 参照文献［12］方法对 CP 导管进行乙酰化处理。将 CP 导管置于 150 mL 5% 醋酐甲醇溶液中，室温下分别乙酰化反应 30、60、90 min 后，置于 4%NaOH 溶液处理，去离子水水洗至中性，冷冻干燥，获得不同乙酰度的 CP 导管（分别记作 CAP1、CAP2、CAP3 导管），即新型复合材料导管。将各导管行环氧乙烷消毒后用于体内实验。
1.2.2 表征方法
取 CP、CAP1、CAP2、CAP3 导管进行以下观测：① 采用傅里叶红外光谱仪测定红外光谱图，以董炎明等[13]报道的红外光谱法测定导管壳聚糖乙酰度；② 导管经干燥、喷金后，扫描电镜观察表面形态及结构；③ 游标卡尺测量导管内径、壁厚，采用四探针电导测试仪测定导管电导率。
1.3 新型复合材料导管体内降解及组织相容性观测
1.3.1 动物模型制备
取 30 只大鼠腹腔注射复合麻醉剂（0.3 mL/100 g）后俯卧固定，术区备皮、消毒、铺巾，在背部中线两侧旁开 0.5 cm 作纵切口，左、右侧各 4 个切口；钝性分离皮下筋膜，距切口约 1 cm 处制备隧道；两侧 4 个切口分别植入 1 个 CP、CAP1、CAP2、CAP3 导管，缝合关闭切口。术后 2、4、6、8、10、12 周各取 5 只动物，同法麻醉后按照原切口入路取材进行观测。
1.3.2 观测指标
① 大体观察：术后观察切口有无感染发生，4、8、12 周取材后大体观察导管形态及完整性。② 神经导管降解观测：植入前导管称重（W1）；取 2、4、6、8、10、12 周样本，剥离导管表面结缔组织，双蒸水清洗 3 遍，以胶原酶和胰蛋白酶依次处理，再以 1%Triton X-100 去垢剂冲洗，双蒸水清洗，冻干后称重（W2），按以下公式计算降解率：降解率=（W1−W2）/W1×100%。③ 扫描电镜观察：取 12 周样本干燥、喷金后，扫描电镜观察导管表面形态及微观结构。④ 组织学观察：取 4、8、12 周样本置于 4% 多聚甲醛溶液，经梯度蔗糖溶液处理后， 5% 蔗糖包埋并连续切片，片厚 10 μm，常规 HE 染色和抗巨噬细胞免疫荧光染色 ［一抗：小鼠抗巨噬细胞单抗（1∶150），二抗：羊抗小鼠 IgG-TRITC（1∶250）］ 观察。
1.4 统计学方法
采用 SPSS25.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 新型复合材料导管表征
2.1.1 傅里叶红外光谱仪测定
红外光谱图显示 CP、CAP1、CAP2 和 CAP3 导管均可见 1 310 cm−1左右的酰胺Ⅲ谱带（C-N）和 1 647 cm−1左右的酰胺Ⅰ谱带（C=O）；其中，CP 导管可见 1 590 cm−1左右的壳聚糖 NH2 弯曲振动特征峰，CAP1、CAP2 和 CAP3 导管由于 1 562 cm−1左右的酰胺Ⅱ谱带增强，掩盖了 NH2 弯曲振动特征峰（图 1）。乙酰度测量显示 CP 导管为 9.19%（与商品壳聚糖标示脱乙酰度 90% 相符），CAP1、CAP2、CAP3 导管分别为 33.8%、64.0%、82.2%。上述结果提示壳聚糖经乙酰化处理，获得不同程度乙酰化改性壳聚糖材料。
图1
各导管红外光谱图
a：CP导管 b：CAP1导管 c：CAP2导管 d：CAP3导管
Figure1. Fourier infrared absorption spectrum of conduitsa: CP conduit b: CAP1 conduit c: CAP2 conduit d: CAP3 conduit
2.1.2 扫描电镜观察
镜下见导管表面相对光滑，结构致密，各导管间无明显差异，提示乙酰化处理未显著改变材料微观结构和表面形态。见图 2。
图2
各导管扫描电镜观察（×5 000）
a. CP导管；b. CAP1导管；c. CAP2导管；d. CAP3导管
Figure2. SEM observation of conduits (×5 000)a. CP conduit; b. CAP1 conduit; c. CAP2 conduit; d. CAP3 conduit
2.1.3 导电性能测试
各导管内径 1.4 mm、壁厚 0.2 mm，管壁有较多孔隙。CP、CAP1、CAP2、CAP3 导管电导率分别为（1.263±0.021）×10−3、（1.270±0.011）×10−3、（1.256±0.012）×10−3、（1.259±0.012）×10−3 S/cm，组间差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2 材料体内降解及组织相容性观测
2.2.1 大体观察
各导管植入后，动物切口均无红肿等感染症状出现。术后 4 周，各导管周围有结缔组织包裹，均保持原外形，周围无明显炎症，血管丰富；8 周时，CAP3 导管形态开始变化，其余导管均保持相对完整；12 周时，各导管均出现一定塌陷，其中 CAP3 导管塌陷尤为明显。各时间点取材时均容易剥离。
2.2.2 神经导管降解观测
随植入时间延长，各导管均出现不同程度质量丢失，且乙酰化度越高，质量变化越大；各时间点降解率组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
各时间点各导管降解率
Figure3.
The degradation rate of each conduit at each time point
2.2.3 扫描电镜观察
术后 12 周导管材料出现较多孔隙，且随着乙酰化度增加，孔隙呈增大趋势。见图 4。
图4
术后12周各导管扫描电镜观察（×5 000）
a. CP导管；b. CAP1导管；c. CAP2导管；d. CAP3导管
Figure4. SEM observation of conduits at 12 weeks after implantation (×5 000)a. CP conduit; b. CAP1 conduit; c. CAP2 conduit; d. CAP3 conduit
2.2.4 HE 染色
镜下观察见各导管植入后早期均有较多淋巴细胞浸润，随植入时间延长，淋巴细胞减少、成纤维细胞增多、胶原纤维增生明显；8 周时 CP、CAP1、CAP2 导管仍可见导管轮廓，CAP3 导管塌陷明显、结缔组织长入；12 周时，各导管均出现不同程度塌陷、结缔组织长入、胶原纤维增生包裹，血管丰富。见图 5。
图5
植入后各导管HE染色观察（×640）
从左至右分别为CP、CAP1、CAP2、CAP3导管 a. 术后4周；b. 术后8周；c. 术后12周
Figure5. HE staining of each conduit after implantation (×640)From left to right for CP, CAP1, CAP2, and CAP3 couduits, respectively a. At 4 weeks after implantation; b. At 8 weeks after implantation; c. At 12 weeks after implantation
2.2.5 免疫荧光染色观察
各导管植入后在早期均有较多巨噬细胞、淋巴细胞浸润，随植入时间延长，淋巴细胞有所减少，成纤维细胞增多，胶原纤维增生明显。见图 6。
图6
植入后各导管免疫荧光染色观察（×200）
从左至右分别为CP、CAP1、CAP2、CAP3导管 a. 术后4周；b. 术后8周；c. 术后12周
Figure6. Immunofluorescence staining of each conduit after implantation (×200)From left to right for CP, CAP1, CAP2, and CAP3 couduits, respectively a. At 4 weeks after implantation; b. At 8 weeks after implantation; c. At 12 weeks after implantation
3 讨论
近年来，组织工程神经成为神经再生研究领域的热点，而理想的支架材料又是组织工程神经构建的关键[9, 14]。鉴于神经组织本身的电生理特性以及电刺激在神经再生中的重要作用[2, 6, 15-16]，学者们开始研究新型导电材料，并提出导电性是理想组织工程神经支架材料的特性之一[6-10]。目前研究使用较多的导电材料有 PPy、聚乙撑二氧噻吩、石墨烯等，其中对 PPy 的研究相对较多。常用于 PPy 的聚合方法包括电化学聚合、化学氧化、模板法、静电纺丝法等，本研究采用的是被誉为制备纳米粒子“万能方法”的微乳液聚合法。本课题组前期研究表明，该方法制备的 PPy 达到纳米级，经红外光谱仪鉴定符合 PPy 的红外光谱特点，且成功掺杂十二烷基苯磺酸[10]，为通过改变 PPy 尺寸实现导电高聚物降解创造了条件。
目前，壳聚糖的乙酰化改性方法已较成熟。一般认为在甲醇或乙醇体系中以乙酸酐作为酰化剂，对壳聚糖进行 N-乙酰化改性较简便。另外，由于氨基反应活性比羟基大，乙酰化反应首先在氨基上发生，得到 O-乙酰化的壳聚糖反而较困难[17]。本研究中改性后材料的红外光谱未观察到 O-酰基特征吸收峰，说明酸酐与壳聚糖的氨基发生了乙酰化反应，得到了研究需要的改性壳聚糖。因 PPy 在复合材料中占比低于 10%，难以明显影响红外光谱中吸收峰的特点。
一般认为，PPy 本身具有较好的生物安全性[18-19]，而壳聚糖经 N-乙酰化改性后，乙酰化本身也不会影响材料的生物安全性[12, 20]。本课题组前期研究提示纳米 PPy/壳聚糖及改性的纳米 PPy/壳聚糖材料均具有较好的体外生物相容性[10]。本研究将不同乙酰度的改性纳米 PPy/壳聚糖导管材料植入大鼠皮下，通过组织学方法观察植入材料体内组织相容性。结果显示各组导管在植入早期均有较多淋巴细胞、巨噬细胞浸润，随着时间延长，淋巴细胞和巨噬细胞均逐渐减少，而成纤维细胞逐渐增多，胶原纤维增生明显，血管顺利长入，表明材料未对周围组织产生明显异物刺激和不良反应，具有较好的组织相容性。另一方面，一定程度的巨噬细胞聚集对 N-乙酰化改性壳聚糖的降解可能有促进作用。因为 N-乙酰化改性壳聚糖的降解主要是通过溶菌酶水解其糖苷键实现解聚[12, 20]，而局部出现的巨噬细胞及其他炎症细胞可在局部微环境释放溶菌酶，对 N-乙酰化后的壳聚糖生物降解具有一定促进作用。
本研究制备的新型复合材料导管经检测具备导电性能，其电导率与文献报道的不同浓度 PPy 对应的电导率基本类似[11]，增加 PPy 在复合材料中的浓度固然可以获得更好导电性能，但考虑到 PPy 本身力学性能差、尚未发现可被体内某种酶降解、缺少活性基团等缺陷，目前研究常将纳米 PPy 与其他可降解材料制备成复合材料[7, 11, 18]，期望利用其小尺寸优势能被排泄器官排出体外，但纳米尺寸的粒子团聚问题尚无满意解决方案，因而本研究在文献报道基础上在导电和降解之间进行选择，采用 3%纳米 PPy 制备导管材料，以期使导管在具备导电能力同时解决 PPy 的降解问题。
一般认为壳聚糖及甲壳素均具备降解性，但在一定脱乙酰度范围内，其降解性能与脱乙酰度成负相关[20-21]，文献报道经过乙酰化改性的壳聚糖比壳聚糖本体具有更好的生物降解性，而且通过改变乙酰化程度可以控制壳聚糖的降解速率[12]。本研究结果与上述文献报道结论相符，随着乙酰度增加，导管降解有加快趋势，这将有助于解决壳聚糖降解速度慢导致其在体内留存较长时间的问题，但是也不能片面追求降解速度而忽视神经再生对完整导管的依赖。
综上述，本研究制备的新型复合材料导管具备较好的体内生物相容性、降解性，以及一定导电性能，初步具备作为组织工程神经支架材料的特性。下一步将通过桥接修复神经缺损实验筛选合适的改性壳聚糖材料，使其既具有理想组织工程支架材料的生物相容性、适合支持神经再生的降解速度、良好的可塑性及生物安全性，又具备良好的导电性，为后续在导电材料基础上引入低频电刺激，使组织工程支架材料与电刺激的联合应用成为可能，以提高周围神经再生能力。
作者贡献：焦海山负责实验设计及实施，起草文章；宋悦宁负责实验实施，数据分析，对文章的知识性内容作批评性审阅；黄健负责数据收集整理；胡毅负责实验实施；李东印负责动物实验。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经苏州卫生职业技术学院动物实验伦理委员会批准（SWAE201906）。实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2016-0049。
