引用本文： 梁至洁, 黄东琳, 张木子, 易晓林, 吴芳晓, 朱丹丹, 宁艳, 甘慧敏, 黎洪棉. 基质细胞衍生因子 1α 修饰促进大鼠脂肪干细胞迁移能力的体外实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(10): 1305-1312. doi: 10.7507/1002-1892.202004134 复制
近年来，再生医学应用研究的热点聚焦于脂肪干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs），这是一类由脂肪组织分离获得的 MSCs，具有较强的增殖能力、多向分化（成脂、成骨、成软骨、成神经等）潜能以及旁分泌、免疫调节等功能，其来源丰富且易于分离[1-2]，适用于伤口愈合[3]、血运重建、骨骼肌肉组织再生修复等临床疾病的治疗[4]，凸显了强大的再生功能。基质细胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）又名 CXCL12，属于 CXC 类趋化因子[5]，在胚胎发育、受伤组织、低氧条件下表达[6]，在体内的形式以 SDF-1α 为主，是一种具有多种生物学功能的趋化细胞因子，如 MSCs 动员、炎症细胞浸润和血管新生等[7]，可促进 MSCs、原始细胞或祖细胞等发生募集归巢[8]。ADSCs 应用于创伤修复与再生治疗主要有以下环节：ADSCs 的动员迁移、分化以及新生组织的成熟[9]，其中 ADSCs 在体内趋化至损伤部位是组织修复的基础。因此，探索有效的趋化条件或手段来进一步诱导 ADSCs 的迁移进而促进组织修复，是再生医学临床应用中需要解决的问题。本研究通过体外实验，拟使用腺病毒构建 SDF-1α 过表达的大鼠 ADSCs（rat ADSCs，rADSCs），探讨 SDF-1α 修饰 rADSCs 促进其迁移能力的可能性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6 周龄 SPF 级 SD 大鼠 3 只，雌雄不拘，体质量 180～200 g，由广西医科大学动物实验中心提供。
DMEM 培养基、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、无水乙醇、15% 水合氯醛、PBS、FBS（HyClone 公司，美国）；青链霉素双抗（上海生工生物工程有限公司）；山羊抗兔 IgG-FITC、CD90-FITC（eBioscienc 公司，美国）；CD49d、CD34、CD166-FITC、兔抗山羊 IgG-FITC（Invitrogen 公司，美国）；地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、甘油三酯检测试剂盒、β-甘油磷酸钠、维生素 C、茜素红 S 染色液、甲苯胺蓝染色液（北京索莱宝科技有限公司）；油红 O（上海伊卡生物技术有限公司）；BCA 蛋白定量试剂盒（合肥白鲨生物科技有限公司）；成软骨诱导液、0.1% 结晶紫染液（中国临床试验集团）；大鼠重组 SDF-1α 蛋白（艾博抗上海贸易有限公司）；携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体（recombinant adenovirus-mediated green fluorescent protein，Adv-GFP）、Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒载体（苏州吉玛科技有限公司）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技术有限公司）。
Transwell 小室、96 孔培养板（Costar Coring Incorporated 公司，美国）；酶标检测仪（北京长弓科技有限公司）；摇床（江苏其林贝尔仪器制造有限公司）；超净工作台（苏州安泰科技有限公司）；低温台式离心机（Eppendorf 公司，德国）；流式细胞仪（BD 公司，美国）；光学显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；细胞培养箱、紫外及可见光分光光度计（Thermo Fisher 公司，美国）；超声细胞破碎仪（上海之信仪器有限公司）。
1.2 rADSCs 分离培养及鉴定
1.2.1 rADSCs 分离培养
取 3 只 SD 大鼠腹腔注射 15% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后脱颈处死，乙醇浸泡 10 min，超净台中取腹股沟脂肪组织；移至离心管中剪成 1 mm×1 mm×1 mm 糊状，无菌 PBS 冲洗；加入 0.1%Ⅰ型胶原酶 37℃ 振荡消化 30～40 min，加等体积完全培养基（含 10%FBS、1% 青链霉素双抗的 DMEM 培养基）终止消化；将混合物倒至 200 目细胞滤网中吹打过筛，无菌培养皿收集滤过液，以离心半径 17 cm、800 r/min 离心 5 min，吸弃上层组织及上清液后加入 2 mL 完全培养基重悬细胞，以离心半径 17 cm、800 r/min 离心 5 min，弃上清；以 3 mL 完全培养基重悬细胞，接种于培养皿中并置于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱，隔天换液；培养至细胞覆盖瓶壁 90% 左右，消化后按 1∶（3～4）比例传代培养。倒置显微镜观察细胞生长状态。
1.2.2 体外成脂、成骨、成软骨诱导分化
取第 3 代 rADSCs 调整浓度为 1×104 个/mL，接种至 35 mm 细胞培养皿，采用含 10%FBS 的 DMEM 培养基培养；待细胞贴壁并生长至 90% 左右时，分别更换为成脂诱导培养基（含 10 μg/mL 胰岛素、1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、0.1 mmol/L 吲哚美辛的 DMEM 培养基）、成骨诱导培养基（含 5 μg/mL 胰岛素、100 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.2 mmol/L 维生素 C 的DMEM 培养基）、成软骨诱导液进行培养。培养期间倒置显微镜下观察细胞形态变化，分别于培养 14、14、21 d 后行油红 O、茜素红及甲苯胺蓝染色观察。
1.2.3 流式细胞仪鉴定
取第 3 代 rADSCs 调整浓度为 1×105 个/mL，以离心半径 17 cm、1 200 r/min 离心 10 min；弃上清液，加入 PBS 100 μL 及 0.5 μL 待检抗体（CD34、山羊抗兔 IgG-FITC、CD49d、CD90-FITC、CD166-FITC、兔抗山羊 IgG-FITC）；混匀，4℃ 避光孵育 60 min 后 PBS 洗涤 2 次，重悬于 500 μL PBS，流式细胞仪检测（其中 CD49d、CD34 组孵育一抗后继续避光孵育相应的 FITC 标记二抗 30 min，再进行检测）。
1.3 体外 SDF-1α 处理及修饰对 ADSCs 迁移的影响
1.3.1 rADSCs 迁移实验中 SDF-1α 最佳浓度筛选
实验分组：1 组，单纯 rADSCs；2 组，3.125 nmol/L SDF-1α+rADSCs；3 组，6.25 nmol/L SDF-1α+rADSCs；4 组，12.5 nmol/L SDF-1α+rADSCs；5 组，25 nmol/L SDF-1α+rADSCs；6 组，50 nmol/L SDF-1α+rADSCs；7 组，100 nmol/L SDF-1α+rADSCs。取第 3 代 rADSCs，待细胞长满 80% 后调整细胞浓度为 1×105 个/mL，于 Transwell 上室加入 300 μL 细胞悬液，48 h 后按照分组，在下室内加入 600 μL 含不同浓度 SDF-1α 的完全培养基，于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养 24 h；取出 Transwell 小室，吸弃上室液体，用棉签仔细擦净，37℃ 预温的 PBS 液漂洗 2 次，冰预冷的 4% 多聚甲醛固定 30 min，0.1% 结晶紫染色 10 min；将聚碳酯膜自上室基底切取下来，封片后光镜观察，于 200 倍下取 1 个视野，计数细胞迁移数量，实验重复 3 次，取均值。
1.3.2 腺病毒感染及最佳感染复数（optimal multiplicity of infection，MOI）筛选
取第 3 代 rADSCs 以 4 000 个/孔密度铺板于 96 孔板中，24 h 后分别以 Adv-GFP 腺病毒（MOI 50、100、200），Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒（MOI 100、200、400）感染，72 h 后荧光显微镜观察病毒感染效率，以镜下细胞状态较好和荧光表达细胞数量较多组 MOI 作为最佳 MOI。
1.3.3 CCK-8 法检测细胞增殖
取原代 rADSCs，待 80% 贴壁后调整细胞浓度为 1×104 个/mL，接种于 96 孔培养板，每孔 200 μL，于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养 24 h。将细胞分为 4 组，A 组为单纯 rADSCs；B 组于 rADSCs 中加入最佳浓度的 SDF-1α 共培养；C 组采用 Adv-GFP腺病毒以最佳 MOI 感染 rADSCs；D 组采用 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒以最佳 MOI 感染 rADSCs。分别于培养 12、24、48、72、96 h 每孔加入 20 μL CCK-8，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱避光孵育 3 h；酶标检测仪于 450 nm 波长处检测吸光度（A）值，绘制细胞生长曲线。
1.3.4 SDF-1α 蛋白或 SDF-1α 过表达腺病毒感染后细胞迁移能力检测
取第 3 代 rADSCs，同 1.3.3 方法进行分组培养后，同 1.3.1 方法检测各组细胞迁移数量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 rADSCs 分离培养及鉴定
2.1.1 rADSCs 的生长特性
原代培养 48 h 后可见细胞贴壁生长，细胞呈长梭形或多角形；培养 6 d 后细胞明显增加，呈集落状生长。传代后细胞形态以长梭状为主，生长速度较原代细胞明显增快。见图 1。
图1
原代 rADSCs 形态学观察（倒置显微镜×200）
a. 培养 48 h；b. 培养 6 d
Figure1. Morphological observation of primary rADSCs (Inverted microscope×200)a. Cultured for 48 hours; b. Cultured for 6 days
2.1.2 体外成脂、成骨、成软骨诱导分化
① 成脂诱导分化：诱导过程中细胞形态发生明显变化，细胞逐渐变圆，14 d 后细胞内充满大量脂滴，细胞核被挤向边缘；油红 O 染色示细胞内脂滴呈红色，符合脂肪细胞的特征。② 成骨诱导分化：诱导过程中细胞由梭形变为多角形、不规则形，呈多层生长，细胞表面钙盐沉积；14 d 茜素红染色示细胞密集处有橘红色钙沉积结节。③ 成软骨诱导分化：培养 21 d，细胞呈多边形或类圆形，局部形成多个结节样结构；甲苯胺蓝染色可见染成蓝色的软骨结节样结构。见图 2。
图2
rADSCs 多向诱导分化鉴定（倒置显微镜×100）
a. 成脂诱导 14 d 油红 O 染色观察；b. 成骨诱导 14 d 茜素红染色观察；c. 成软骨诱导 21 d 甲苯胺蓝染色观察
Figure2. Identification of multi-directional differentiations of rADSCs (Inverted microscope×100)a. Oil red O staining after adipogenic induction for 14 days; b. Alizarin red staining after osteogenic induction for 14 days; c. Toluidine blue staining after chondrogenic induction for 21 days
2.1.3 流式细胞仪鉴定
rADSCs 表面标志物特征为：CD49d、CD90、CD166 表达呈阳性，表达率高于 80%；而 CD34 表达呈阴性，表达率低于 10%。见图 3。
图3
rADSCs 表面标志物流式细胞仪鉴定
a. CD34；b. CD49d；c. CD90；d. CD166
Figure3. Identification of rADSCs surface markers by flow cytometrya. CD34; b. CD49d; c. CD90; d. CD166
2.2 SDF-1α 外源性刺激及内源性修饰对 rADSCs 迁移能力的影响
2.2.1 rADSCs 迁移实验中 SDF-1α 最佳浓度筛选
倒置显微镜观察及细胞迁移计数显示，随着下室内 SDF-1α 浓度提高，迁移的 rADSCs 逐渐增加。其中 3～7 组 rADSCs 迁移数量显著高于 1～2 组，4～7 组显著高于 3 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；4～7 组间差异无统计学意义（P>0.05）。因此，rADSCs 迁移实验中 SDF-1α 的最佳浓度为 4 组 12.5 nmol/L。见图 4、5。
图4
不同 SDF-1α 浓度下 rADSCs 迁移能力比较（倒置显微镜×200）
a. 1 组；b. 2 组；c. 3 组；d. 4 组；e. 5 组；f. 6 组；g. 7 组
Figure4. Comparison of rADSCs migration ability at different SDF-1α concentrations (Inverted microscope×200)a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4; e. Group 5; f. Group 6; g. Group 7
图5
不同 SDF-1α 浓度下 rADSCs 迁移数量比较
Figure5.
Comparison of the migration number of rADSCs at different SDF-1α concentrations
2.2.2 腺病毒感染最佳 MOI 筛选
rADSCs 经 Adv-GFP 腺病毒感染 72 h 后荧光显微镜下可见 rADSCs 有细胞轮廓突起于表面，荧光强度较强，表明多数细胞被转染并成功表达，且 MOI 为 200 时效果最明显。rADSCs 经 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒感染 72 h 后可见荧光表达，随着 MOI 升高，荧光强度越强，且 MOI 为 400 时效果最明显。见图 6、7。因此后续实验中用 MOI 为 200 的 Adv-GFP 腺病毒和 MOI 为 400 的 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒感染 rADSCs。
图6
rADSCs 经 Adv-GFP 腺病毒感染 72 h 后荧光显微镜观察（×100）
a. MOI 为 50；b. MOI 为 100；c. MOI 为 200
Figure6. rADSCs were infected by Adv-GFP adenovirus for 72 hours under fluorescence microscope (×100)a. MOI of 50; b. MOI of 100; c. MOI of 200
图7
rADSCs 经 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒感染 72 h 后荧光显微镜观察（×100）
a. MOI 为 100；b. MOI 为 200；c. MOI 为 400
Figure7. rADSCs were infected by Adv-GFP-SDF-1α overexpressed adenovirus for 72 h under fluorescence microscope (×100)a. MOI of 100; b. MOI of 200; c. MOI of 400
2.2.3 CCK-8 法检测细胞增殖
随培养时间延长，各组细胞 A 值均逐渐增加，自 48 h 开始 B、D 组 A 值均显著高于 A、C 组，且 96 h 时 D 组 A 值显著高于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。其余时间点组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 8。
图8
CCK-8 法检测各组 rADSCs 增殖情况
Figure8.
Proliferation of rADSCs in each group detected by CCK-8 method
2.2.4 SDF-1α 蛋白或 SDF-1α 过表达腺病毒感染后细胞迁移能力检测
倒置显微镜观察示，rADSCs 经外源性添加 SDF-1α 蛋白或者感染 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒后，细胞迁移数量显著增加。见图 9。A、B、C、D 组细胞迁移数量分别为（20.7±1.2）、（48.0±2.6）、（19.0±1.0）、（37.77±2.1）个/视野，B、D 组显著高于 A、C 组，B 组显著高于 D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图9
SDF-1α 蛋白刺激或 SDF-1α 过表达腺病毒感染后细胞迁移能力检测（倒置显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
Figure9. Detection of cell migration ability after SDF-1α stimulation or SDF-1α overexpressed (Inverted microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 讨论
ADSCs 具有取材简便、易于分离培养获得、低免疫原性、多向分化潜能及旁分泌功能等特性[10]，经定向诱导后可分化成为具有脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经元及肝细胞等细胞谱系特征的成熟细胞[11-13]，是组织工程研究中重要的种子细胞。目前，ADSCs 已用于治疗多种疾病治疗以及组织再生创伤修复，如缺血性疾病、关节软骨缺损[14-15]、心肌损伤[16]、泌尿系统功能障碍修复治疗[17]等，并取得了理想效果。
在临床实践中，ADSCs 多作为成体组织种子细胞直接移植于体表部位或与支架复合体内移植，如面部凹陷填充修复[18]、骨组织缺损重建[19]等。ADSCs 促进组织修复再生的可能机制为：① 向再生组织的成熟细胞定向分化；② 通过旁分泌细胞因子促进局部新生血管形成，以及促周围的炎症细胞、成纤维细胞等发挥相关功能。对于深部损伤组织及部位实行修复再生治疗，需要将 MSCs 经静脉或动脉方式注入，如缺血性脑损伤修复[20-21]、心肌梗死修复[22]、肾脏缺血性损伤修复[23]、组织缺血再灌注损伤的修复[24]等。然而，经外周静脉注射修复深部组织的方式面临着 MSCs 注射后归巢率的问题，归巢率过低会使移植疗效受限[25]，但提高输注细胞数量会极大提高治疗成本。这使得提高 MSCs 向损伤区域迁移能力成为优化疗效的重要突破口之一，也是临床应用中需要面临的挑战。
SDF-1 被认为是最主要的 MSCs 归巢趋化因子之一，可以充当 MSCs 定向迁移的化学引诱物。有研究[26]证实，MSCs 的动员及归巢（无论是外源性移植或内源性细胞）多依赖于 SDF-1 调控。SDF-1 在体内损伤组织局部通常高表达，有助于诱导 MSCs 沿浓度梯度迁移至损伤部位实现归巢[27-28]，促进受损组织再生、修复以及炎症因子在损伤部位的浸润。外源性 SDF-1 也可以用于促进移植 MSCs 的动员与归巢[29]，通过与细胞中的特异性受体 CXCR4 结合形成偶联分子对，从而促进细胞的黏附、迁移、分泌和增殖能力，SDF-1/CXCR-4 通路的激活在 MSCs 迁移归巢过程中发挥了关键作用[30-31]。这些研究说明了优化 MSCs 迁移能力是有价值的研究方向，而 SDF-1 是促进 MSCs 迁移最为高效的因子之一。
MSCs 的迁移能力对其移植治疗效果的影响极大。Gleeson 等[32]的研究表明，经静脉、动脉及局部注射途径给予 MSCs 时，只有 2%～12% 细胞到达目标区域，且存活率很低。因此，要提高 MSCs 治疗疗效，就需要提高 MSCs 进入体内迁移至损伤区域的速度，但在有效提高 ADSCs 本身趋化性迁移能力的同时，还应优化细胞活性，使其在凋亡前及时到达损伤部位发挥作用。本研究体外实验表明了在适宜浓度范围内，外源性 SDF-1α 能促进 rADSCs 体外增殖及迁移能力增加。然而体内的相关归巢机制比体外的迁移机制更为复杂，体内环境中外源性 SDF-1α 的浓度控制及其对体内 ADSCs 的驱动效果存在不确定性，但内源性 SDF-1α 表达则可给予细胞较为稳定和持续的驱动力。故我们采用 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒感染 rADSCs，与空白对照的 rADSCs 相比，其增殖和迁移能力明显增强，虽然与最佳浓度外源性 SDF-1α 刺激的 rADSCs 相比其迁移能力仍有一定差距，但增殖能力明显高于外源性 SDF-1α 刺激的 rADSCs，提示感染 SDF-1α 也能使 rADSCs 迁移及增殖能力获得优化。但能否利用有效浓度的 SDF-1α 或转染 SDF-1α 增强 ADSCs 的趋化性迁移能力，促使 ADSCs 在体内迅速归巢优化组织修复再生，以及比较两种方法的优劣，均有待我们进一步的动物实验验证。
综上述，SDF-1α 作为趋化因子不仅能促进 rADSCs 增殖，还可提高 rADSCs 迁移能力，构建稳定表达 SDF-1α 的 rADSCs 也能获得这种优化效果。SDF-1α 对 ADSCs 应用于临床组织再生、创伤修复治疗有一定的优化作用，为优化 ADSCs 促进损伤组织修复提供了有力的实验数据支撑。
作者贡献：梁至洁、黄东琳负责数据分析及文章撰写；张木子、易晓林、吴芳晓负责数据收集整理；朱丹丹、宁艳、甘慧敏负责细胞实验；黎洪棉负责科研设计。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：涉及动物的研究方案获得广西医科大学实验动物伦理委员会批准（201905057）。实验动物使用许可证号：SYXK（桂）2014-0003。
近年来，再生医学应用研究的热点聚焦于脂肪干细胞（adipose derived stem cells，ADSCs），这是一类由脂肪组织分离获得的 MSCs，具有较强的增殖能力、多向分化（成脂、成骨、成软骨、成神经等）潜能以及旁分泌、免疫调节等功能，其来源丰富且易于分离[1-2]，适用于伤口愈合[3]、血运重建、骨骼肌肉组织再生修复等临床疾病的治疗[4]，凸显了强大的再生功能。基质细胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）又名 CXCL12，属于 CXC 类趋化因子[5]，在胚胎发育、受伤组织、低氧条件下表达[6]，在体内的形式以 SDF-1α 为主，是一种具有多种生物学功能的趋化细胞因子，如 MSCs 动员、炎症细胞浸润和血管新生等[7]，可促进 MSCs、原始细胞或祖细胞等发生募集归巢[8]。ADSCs 应用于创伤修复与再生治疗主要有以下环节：ADSCs 的动员迁移、分化以及新生组织的成熟[9]，其中 ADSCs 在体内趋化至损伤部位是组织修复的基础。因此，探索有效的趋化条件或手段来进一步诱导 ADSCs 的迁移进而促进组织修复，是再生医学临床应用中需要解决的问题。本研究通过体外实验，拟使用腺病毒构建 SDF-1α 过表达的大鼠 ADSCs（rat ADSCs，rADSCs），探讨 SDF-1α 修饰 rADSCs 促进其迁移能力的可能性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
6 周龄 SPF 级 SD 大鼠 3 只，雌雄不拘，体质量 180～200 g，由广西医科大学动物实验中心提供。
DMEM 培养基、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、无水乙醇、15% 水合氯醛、PBS、FBS（HyClone 公司，美国）；青链霉素双抗（上海生工生物工程有限公司）；山羊抗兔 IgG-FITC、CD90-FITC（eBioscienc 公司，美国）；CD49d、CD34、CD166-FITC、兔抗山羊 IgG-FITC（Invitrogen 公司，美国）；地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、甘油三酯检测试剂盒、β-甘油磷酸钠、维生素 C、茜素红 S 染色液、甲苯胺蓝染色液（北京索莱宝科技有限公司）；油红 O（上海伊卡生物技术有限公司）；BCA 蛋白定量试剂盒（合肥白鲨生物科技有限公司）；成软骨诱导液、0.1% 结晶紫染液（中国临床试验集团）；大鼠重组 SDF-1α 蛋白（艾博抗上海贸易有限公司）；携带绿色荧光蛋白的腺病毒载体（recombinant adenovirus-mediated green fluorescent protein，Adv-GFP）、Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒载体（苏州吉玛科技有限公司）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技术有限公司）。
Transwell 小室、96 孔培养板（Costar Coring Incorporated 公司，美国）；酶标检测仪（北京长弓科技有限公司）；摇床（江苏其林贝尔仪器制造有限公司）；超净工作台（苏州安泰科技有限公司）；低温台式离心机（Eppendorf 公司，德国）；流式细胞仪（BD 公司，美国）；光学显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；细胞培养箱、紫外及可见光分光光度计（Thermo Fisher 公司，美国）；超声细胞破碎仪（上海之信仪器有限公司）。
1.2 rADSCs 分离培养及鉴定
1.2.1 rADSCs 分离培养
取 3 只 SD 大鼠腹腔注射 15% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后脱颈处死，乙醇浸泡 10 min，超净台中取腹股沟脂肪组织；移至离心管中剪成 1 mm×1 mm×1 mm 糊状，无菌 PBS 冲洗；加入 0.1%Ⅰ型胶原酶 37℃ 振荡消化 30～40 min，加等体积完全培养基（含 10%FBS、1% 青链霉素双抗的 DMEM 培养基）终止消化；将混合物倒至 200 目细胞滤网中吹打过筛，无菌培养皿收集滤过液，以离心半径 17 cm、800 r/min 离心 5 min，吸弃上层组织及上清液后加入 2 mL 完全培养基重悬细胞，以离心半径 17 cm、800 r/min 离心 5 min，弃上清；以 3 mL 完全培养基重悬细胞，接种于培养皿中并置于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱，隔天换液；培养至细胞覆盖瓶壁 90% 左右，消化后按 1∶（3～4）比例传代培养。倒置显微镜观察细胞生长状态。
1.2.2 体外成脂、成骨、成软骨诱导分化
取第 3 代 rADSCs 调整浓度为 1×104 个/mL，接种至 35 mm 细胞培养皿，采用含 10%FBS 的 DMEM 培养基培养；待细胞贴壁并生长至 90% 左右时，分别更换为成脂诱导培养基（含 10 μg/mL 胰岛素、1 μmol/L 地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、0.1 mmol/L 吲哚美辛的 DMEM 培养基）、成骨诱导培养基（含 5 μg/mL 胰岛素、100 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.2 mmol/L 维生素 C 的DMEM 培养基）、成软骨诱导液进行培养。培养期间倒置显微镜下观察细胞形态变化，分别于培养 14、14、21 d 后行油红 O、茜素红及甲苯胺蓝染色观察。
1.2.3 流式细胞仪鉴定
取第 3 代 rADSCs 调整浓度为 1×105 个/mL，以离心半径 17 cm、1 200 r/min 离心 10 min；弃上清液，加入 PBS 100 μL 及 0.5 μL 待检抗体（CD34、山羊抗兔 IgG-FITC、CD49d、CD90-FITC、CD166-FITC、兔抗山羊 IgG-FITC）；混匀，4℃ 避光孵育 60 min 后 PBS 洗涤 2 次，重悬于 500 μL PBS，流式细胞仪检测（其中 CD49d、CD34 组孵育一抗后继续避光孵育相应的 FITC 标记二抗 30 min，再进行检测）。
1.3 体外 SDF-1α 处理及修饰对 ADSCs 迁移的影响
1.3.1 rADSCs 迁移实验中 SDF-1α 最佳浓度筛选
实验分组：1 组，单纯 rADSCs；2 组，3.125 nmol/L SDF-1α+rADSCs；3 组，6.25 nmol/L SDF-1α+rADSCs；4 组，12.5 nmol/L SDF-1α+rADSCs；5 组，25 nmol/L SDF-1α+rADSCs；6 组，50 nmol/L SDF-1α+rADSCs；7 组，100 nmol/L SDF-1α+rADSCs。取第 3 代 rADSCs，待细胞长满 80% 后调整细胞浓度为 1×105 个/mL，于 Transwell 上室加入 300 μL 细胞悬液，48 h 后按照分组，在下室内加入 600 μL 含不同浓度 SDF-1α 的完全培养基，于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养 24 h；取出 Transwell 小室，吸弃上室液体，用棉签仔细擦净，37℃ 预温的 PBS 液漂洗 2 次，冰预冷的 4% 多聚甲醛固定 30 min，0.1% 结晶紫染色 10 min；将聚碳酯膜自上室基底切取下来，封片后光镜观察，于 200 倍下取 1 个视野，计数细胞迁移数量，实验重复 3 次，取均值。
1.3.2 腺病毒感染及最佳感染复数（optimal multiplicity of infection，MOI）筛选
取第 3 代 rADSCs 以 4 000 个/孔密度铺板于 96 孔板中，24 h 后分别以 Adv-GFP 腺病毒（MOI 50、100、200），Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒（MOI 100、200、400）感染，72 h 后荧光显微镜观察病毒感染效率，以镜下细胞状态较好和荧光表达细胞数量较多组 MOI 作为最佳 MOI。
1.3.3 CCK-8 法检测细胞增殖
取原代 rADSCs，待 80% 贴壁后调整细胞浓度为 1×104 个/mL，接种于 96 孔培养板，每孔 200 μL，于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养 24 h。将细胞分为 4 组，A 组为单纯 rADSCs；B 组于 rADSCs 中加入最佳浓度的 SDF-1α 共培养；C 组采用 Adv-GFP腺病毒以最佳 MOI 感染 rADSCs；D 组采用 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒以最佳 MOI 感染 rADSCs。分别于培养 12、24、48、72、96 h 每孔加入 20 μL CCK-8，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱避光孵育 3 h；酶标检测仪于 450 nm 波长处检测吸光度（A）值，绘制细胞生长曲线。
1.3.4 SDF-1α 蛋白或 SDF-1α 过表达腺病毒感染后细胞迁移能力检测
取第 3 代 rADSCs，同 1.3.3 方法进行分组培养后，同 1.3.1 方法检测各组细胞迁移数量。
1.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 rADSCs 分离培养及鉴定
2.1.1 rADSCs 的生长特性
原代培养 48 h 后可见细胞贴壁生长，细胞呈长梭形或多角形；培养 6 d 后细胞明显增加，呈集落状生长。传代后细胞形态以长梭状为主，生长速度较原代细胞明显增快。见图 1。
图1
原代 rADSCs 形态学观察（倒置显微镜×200）
a. 培养 48 h；b. 培养 6 d
Figure1. Morphological observation of primary rADSCs (Inverted microscope×200)a. Cultured for 48 hours; b. Cultured for 6 days
2.1.2 体外成脂、成骨、成软骨诱导分化
① 成脂诱导分化：诱导过程中细胞形态发生明显变化，细胞逐渐变圆，14 d 后细胞内充满大量脂滴，细胞核被挤向边缘；油红 O 染色示细胞内脂滴呈红色，符合脂肪细胞的特征。② 成骨诱导分化：诱导过程中细胞由梭形变为多角形、不规则形，呈多层生长，细胞表面钙盐沉积；14 d 茜素红染色示细胞密集处有橘红色钙沉积结节。③ 成软骨诱导分化：培养 21 d，细胞呈多边形或类圆形，局部形成多个结节样结构；甲苯胺蓝染色可见染成蓝色的软骨结节样结构。见图 2。
图2
rADSCs 多向诱导分化鉴定（倒置显微镜×100）
a. 成脂诱导 14 d 油红 O 染色观察；b. 成骨诱导 14 d 茜素红染色观察；c. 成软骨诱导 21 d 甲苯胺蓝染色观察
Figure2. Identification of multi-directional differentiations of rADSCs (Inverted microscope×100)a. Oil red O staining after adipogenic induction for 14 days; b. Alizarin red staining after osteogenic induction for 14 days; c. Toluidine blue staining after chondrogenic induction for 21 days
2.1.3 流式细胞仪鉴定
rADSCs 表面标志物特征为：CD49d、CD90、CD166 表达呈阳性，表达率高于 80%；而 CD34 表达呈阴性，表达率低于 10%。见图 3。
图3
rADSCs 表面标志物流式细胞仪鉴定
a. CD34；b. CD49d；c. CD90；d. CD166
Figure3. Identification of rADSCs surface markers by flow cytometrya. CD34; b. CD49d; c. CD90; d. CD166
2.2 SDF-1α 外源性刺激及内源性修饰对 rADSCs 迁移能力的影响
2.2.1 rADSCs 迁移实验中 SDF-1α 最佳浓度筛选
倒置显微镜观察及细胞迁移计数显示，随着下室内 SDF-1α 浓度提高，迁移的 rADSCs 逐渐增加。其中 3～7 组 rADSCs 迁移数量显著高于 1～2 组，4～7 组显著高于 3 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；4～7 组间差异无统计学意义（P>0.05）。因此，rADSCs 迁移实验中 SDF-1α 的最佳浓度为 4 组 12.5 nmol/L。见图 4、5。
图4
不同 SDF-1α 浓度下 rADSCs 迁移能力比较（倒置显微镜×200）
a. 1 组；b. 2 组；c. 3 组；d. 4 组；e. 5 组；f. 6 组；g. 7 组
Figure4. Comparison of rADSCs migration ability at different SDF-1α concentrations (Inverted microscope×200)a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4; e. Group 5; f. Group 6; g. Group 7
图5
不同 SDF-1α 浓度下 rADSCs 迁移数量比较
Figure5.
Comparison of the migration number of rADSCs at different SDF-1α concentrations
2.2.2 腺病毒感染最佳 MOI 筛选
rADSCs 经 Adv-GFP 腺病毒感染 72 h 后荧光显微镜下可见 rADSCs 有细胞轮廓突起于表面，荧光强度较强，表明多数细胞被转染并成功表达，且 MOI 为 200 时效果最明显。rADSCs 经 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒感染 72 h 后可见荧光表达，随着 MOI 升高，荧光强度越强，且 MOI 为 400 时效果最明显。见图 6、7。因此后续实验中用 MOI 为 200 的 Adv-GFP 腺病毒和 MOI 为 400 的 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒感染 rADSCs。
图6
rADSCs 经 Adv-GFP 腺病毒感染 72 h 后荧光显微镜观察（×100）
a. MOI 为 50；b. MOI 为 100；c. MOI 为 200
Figure6. rADSCs were infected by Adv-GFP adenovirus for 72 hours under fluorescence microscope (×100)a. MOI of 50; b. MOI of 100; c. MOI of 200
图7
rADSCs 经 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒感染 72 h 后荧光显微镜观察（×100）
a. MOI 为 100；b. MOI 为 200；c. MOI 为 400
Figure7. rADSCs were infected by Adv-GFP-SDF-1α overexpressed adenovirus for 72 h under fluorescence microscope (×100)a. MOI of 100; b. MOI of 200; c. MOI of 400
2.2.3 CCK-8 法检测细胞增殖
随培养时间延长，各组细胞 A 值均逐渐增加，自 48 h 开始 B、D 组 A 值均显著高于 A、C 组，且 96 h 时 D 组 A 值显著高于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。其余时间点组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 8。
图8
CCK-8 法检测各组 rADSCs 增殖情况
Figure8.
Proliferation of rADSCs in each group detected by CCK-8 method
2.2.4 SDF-1α 蛋白或 SDF-1α 过表达腺病毒感染后细胞迁移能力检测
倒置显微镜观察示，rADSCs 经外源性添加 SDF-1α 蛋白或者感染 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒后，细胞迁移数量显著增加。见图 9。A、B、C、D 组细胞迁移数量分别为（20.7±1.2）、（48.0±2.6）、（19.0±1.0）、（37.77±2.1）个/视野，B、D 组显著高于 A、C 组，B 组显著高于 D 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图9
SDF-1α 蛋白刺激或 SDF-1α 过表达腺病毒感染后细胞迁移能力检测（倒置显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
Figure9. Detection of cell migration ability after SDF-1α stimulation or SDF-1α overexpressed (Inverted microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 讨论
ADSCs 具有取材简便、易于分离培养获得、低免疫原性、多向分化潜能及旁分泌功能等特性[10]，经定向诱导后可分化成为具有脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经元及肝细胞等细胞谱系特征的成熟细胞[11-13]，是组织工程研究中重要的种子细胞。目前，ADSCs 已用于治疗多种疾病治疗以及组织再生创伤修复，如缺血性疾病、关节软骨缺损[14-15]、心肌损伤[16]、泌尿系统功能障碍修复治疗[17]等，并取得了理想效果。
在临床实践中，ADSCs 多作为成体组织种子细胞直接移植于体表部位或与支架复合体内移植，如面部凹陷填充修复[18]、骨组织缺损重建[19]等。ADSCs 促进组织修复再生的可能机制为：① 向再生组织的成熟细胞定向分化；② 通过旁分泌细胞因子促进局部新生血管形成，以及促周围的炎症细胞、成纤维细胞等发挥相关功能。对于深部损伤组织及部位实行修复再生治疗，需要将 MSCs 经静脉或动脉方式注入，如缺血性脑损伤修复[20-21]、心肌梗死修复[22]、肾脏缺血性损伤修复[23]、组织缺血再灌注损伤的修复[24]等。然而，经外周静脉注射修复深部组织的方式面临着 MSCs 注射后归巢率的问题，归巢率过低会使移植疗效受限[25]，但提高输注细胞数量会极大提高治疗成本。这使得提高 MSCs 向损伤区域迁移能力成为优化疗效的重要突破口之一，也是临床应用中需要面临的挑战。
SDF-1 被认为是最主要的 MSCs 归巢趋化因子之一，可以充当 MSCs 定向迁移的化学引诱物。有研究[26]证实，MSCs 的动员及归巢（无论是外源性移植或内源性细胞）多依赖于 SDF-1 调控。SDF-1 在体内损伤组织局部通常高表达，有助于诱导 MSCs 沿浓度梯度迁移至损伤部位实现归巢[27-28]，促进受损组织再生、修复以及炎症因子在损伤部位的浸润。外源性 SDF-1 也可以用于促进移植 MSCs 的动员与归巢[29]，通过与细胞中的特异性受体 CXCR4 结合形成偶联分子对，从而促进细胞的黏附、迁移、分泌和增殖能力，SDF-1/CXCR-4 通路的激活在 MSCs 迁移归巢过程中发挥了关键作用[30-31]。这些研究说明了优化 MSCs 迁移能力是有价值的研究方向，而 SDF-1 是促进 MSCs 迁移最为高效的因子之一。
MSCs 的迁移能力对其移植治疗效果的影响极大。Gleeson 等[32]的研究表明，经静脉、动脉及局部注射途径给予 MSCs 时，只有 2%～12% 细胞到达目标区域，且存活率很低。因此，要提高 MSCs 治疗疗效，就需要提高 MSCs 进入体内迁移至损伤区域的速度，但在有效提高 ADSCs 本身趋化性迁移能力的同时，还应优化细胞活性，使其在凋亡前及时到达损伤部位发挥作用。本研究体外实验表明了在适宜浓度范围内，外源性 SDF-1α 能促进 rADSCs 体外增殖及迁移能力增加。然而体内的相关归巢机制比体外的迁移机制更为复杂，体内环境中外源性 SDF-1α 的浓度控制及其对体内 ADSCs 的驱动效果存在不确定性，但内源性 SDF-1α 表达则可给予细胞较为稳定和持续的驱动力。故我们采用 Adv-GFP-SDF-1α 过表达腺病毒感染 rADSCs，与空白对照的 rADSCs 相比，其增殖和迁移能力明显增强，虽然与最佳浓度外源性 SDF-1α 刺激的 rADSCs 相比其迁移能力仍有一定差距，但增殖能力明显高于外源性 SDF-1α 刺激的 rADSCs，提示感染 SDF-1α 也能使 rADSCs 迁移及增殖能力获得优化。但能否利用有效浓度的 SDF-1α 或转染 SDF-1α 增强 ADSCs 的趋化性迁移能力，促使 ADSCs 在体内迅速归巢优化组织修复再生，以及比较两种方法的优劣，均有待我们进一步的动物实验验证。
综上述，SDF-1α 作为趋化因子不仅能促进 rADSCs 增殖，还可提高 rADSCs 迁移能力，构建稳定表达 SDF-1α 的 rADSCs 也能获得这种优化效果。SDF-1α 对 ADSCs 应用于临床组织再生、创伤修复治疗有一定的优化作用，为优化 ADSCs 促进损伤组织修复提供了有力的实验数据支撑。
作者贡献：梁至洁、黄东琳负责数据分析及文章撰写；张木子、易晓林、吴芳晓负责数据收集整理；朱丹丹、宁艳、甘慧敏负责细胞实验；黎洪棉负责科研设计。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：涉及动物的研究方案获得广西医科大学实验动物伦理委员会批准（201905057）。实验动物使用许可证号：SYXK（桂）2014-0003。
