引用本文： 李晓龙, 孔清泉. 微小 RNA 在 MSCs 成骨分化中的调控作用及在骨科疾病中作为治疗靶点和诊断工具的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(10): 1332-1340. doi: 10.7507/1002-1892.201912092 复制
创伤、骨质疏松症、骨关节炎（osteoarthritis，OA）和骨肿瘤等疾病会导致骨量减少、骨缺损、骨折不愈合以及股骨头坏死等，带来巨大的社会和经济负担，并且严重影响患者的生活质量。骨组织有很强的再生能力，通过成骨细胞和破骨细胞的协同作用形成新的骨组织，来维持人体正常骨代谢的动态平衡。成骨作用开始于 MSCs 分化为成熟的成骨细胞，因此骨质疏松症和 OA 等疾病的防治可以考虑加强 MSCs 的成骨作用和促进新骨形成[1]。近年来，诸多研究发现一些关键的信号通路参与成骨分化的调控，如 TGF-β/BMP-Smads、Wnt/β-catenin、Notch、猬因子（Hedgehog，Hh）、FGF、丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等[2]。除上述信号通路外，激素、生长因子、趋化因子、细胞因子、DNA 甲基化、微小 RNA（microRNA，miRNA）和染色质结构改变等也参与调控成骨分化[3-5]。目前实验证据表明，miRNAs 在 MSCs 成骨分化调控中发挥着关键作用，但是具体作用机制和细节尚未完全阐明。本综述就 miRNAs 对成骨分化调控作用的研究现状及在骨科疾病中作为治疗靶点和诊断工具的应用研究进展进行总结。
1 miRNAs 的定义与功能
miRNAs 广泛存在于真核生物中，是一种内源性非编码长度为 20～22 个核苷酸的小 RNAs，具有高度保守性、时序性和组织特异性[6]。miRNAs 通过对 mRNAs 切割、降解，翻译抑制或甲基化靶基因，转录后对约 60% 的编码基因表达进行调控，因此在诸多疾病中发挥着潜在的重要作用[7]。miRNAs只占人类基因组中的 1%～5%，但 1 条 miRNA 通常可以调控数十甚至数百个基因[8]。最早发现的 miRNA 是 lin-4，Lee 等[9]在 1993 年研究线虫时发现基因 lin-4 能够抑制基因 lin-14，认为基因 lin-4 是通过表达一种调控蛋白来发挥作用。后来研究发现这个基因的产物是单链 RNA[10]。miRNAs 已成为近年研究热点，截止 2018 年 10 月，miRBase 数据库已收录 271 个物种的 38 589 条 miRNAs。
miRNAs 的加工成熟过程与 mRNAs 类似，需要经历核酸酶的剪切加工及碱基互补配对等一系列复杂过程，根据碱基互补配对原则，在结合 3’UTR 时如果碱基不完全匹配，则抑制靶基因蛋白翻译；若完全匹配，靶基因 mRNAs 降解[11]。靶基因预测工具如 PicTar 等软件和荧光素酶报告质粒系统，原理均是设计出 3’UTR 端碱基序列来实现互补配对[12]。此外，miRNAs 与靶基因 mRNAs 不是完全一一对应的，每条 miRNA 都含有多个 mRNAs 靶点，多条 miRNAs 也可以作用于同一条 mRNA。
miRNAs 在细胞生长、发育、分化、凋亡等生物过程中起着重要作用，同时也广泛参与血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统发育和人类癌细胞生长等过程[13]。例如 miRNA-140，研究显示其在 MSCs 成骨分化中表达增高，而抑制成骨分化时表达明显降低，提示 miRNA-140 可能参与 MSCs 成骨分化的调控作用[14]。
2 miRNAs 在成骨分化中的调控作用
Kobayashi 等[15]首先证实敲除小鼠体内由Ⅱ型 α1 胶原基因（collagen type Ⅱ alpha 1，COL2A1）介导的 RNAse Ⅲ核酸内切酶 Dicer，会导致严重的骨生成障碍和小鼠死亡。Gaur 等[16]随后进一步验证了位于成骨细胞中的 Dicer 是通过沉默重组酶起作用，而这些重组酶是由小鼠Ⅰ型 α1 胶原基因或者人类骨羧谷氨酸蛋白/骨钙蛋白基因启动并表达的。成骨细胞中的 Dicer 敲除或沉默后，细胞内 miRNAs 生成会发生障碍，最后导致小鼠肢体发育障碍，说明 miRNAs 的表达在 MSCs 成骨分化中起着非常关键的作用。多数经过验证的 miRNAs 是通过直接关联组织特异性分化的中心调控基因起作用，因此从 miRNAs 角度寻找调控 MSCs 成骨分化的关键基因可行。目前大量实验证据证实 miRNAs 不只作用于 1 个基因，而是同时作用于多个基因，它具有双向性，即抑制一部分基因表达，同时促进另外一部分基因表达，两者最终的结果是叠加的，而不是相互拮抗的[17-19]。这一机制可能是体内互转化的关键因素，即抑制向一种细胞表型分化，促进向另一种细胞表型转化。即 miRNAs 对 MSCs 的成骨作用是正反两面的，一方面通过作用于促进成骨的靶基因表达而直接抑制成骨作用；另一方面是作用于抑制成骨作用的靶基因，间接对 MSCs 成骨作用进行正向调节[20]。
3 抑制成骨分化的 miRNAs
Wei 等[18]发现在人牙周韧带干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）成骨分化过程中，miRNA-21 表达下降。作者通过构建 miRNA-21 表达载体 pGC-LV-pre-miRNA-21-GFP 刺激 miRNA-21 过表达，hPDLSCs 的成骨分化受抑制；相反，构建抗 miRNA-21 表达载体 pGC-LV-anti-miRNA-21-GFP 抑制 miRNA-21 表达，则会促进 hPDLSCs 的成骨分化。进一步研究发现，miRNA-21 是通过抑制对细胞增殖有调节作用的 Smad5 基因发挥作用的。BMP-9 被确认是 BMP 家族中诱导成骨分化的重要成员，但具体诱导机制一直不明确[21]。近年，Liu 等[22]发现 miRNA-155 能够显著下调 BMP-9 诱导的 MSCs 成骨分化，通过抑制 BMP 信号通路上的靶基因 Runt 相关转录因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）和 BMP 受体 2 来发挥作用。随后，Lin 等[23]发现 BMP-2 可诱导小鼠 MC3T3-E1 细胞成骨分化，miRNA-92a-1-5p 表达明显下调，miRNA-92a-1-5p 对成骨分化起抑制作用，是通过负性调控 β-catenin 基因来实现。Saiganesh 等[24]发现转录因子 TGF-β1 能减弱 miRNA-203a-5p 在 MSCs 成骨分化过程中的表达，同时 miRNA-203a-5p 对基质金属蛋白酶 13（matrix metalloproteinases 13，MMP-13）基因有抑制作用，MMP-13 过表达会促进成骨分化，这样就建立了一种 TGF-β1 抑制 miRNA-203a-5p，使 MMP-13 的抑制得到释放的前反馈调节机制。
miRNA-16-2-3p 是新近发现的一种 miRNA，研究证明其可作为标记物用于诊断肝癌、宫颈癌和慢性淋巴细胞白血病和评估预后[25]。最近，Duan 等[26]研究了 miRNA-16-2-3p 调节成骨分化的具体机制，作者发现 46 例骨质疏松症患者骨组织样本中的 miRNA-16-2-3p，其表达与骨形成相关基因 Runx2、成骨相关转录因子（osterix，Osx）和 ALP 的表达成负相关。当上调 miRNA-16-2-3p 时，人 BMSCs 成骨分化过程受阻，miRNA-16-2-3p 直接作用靶基因 Wnt5A 限制 Wnt 信号通路；如果下调 miRNA-16-2-3p，成骨分化明显增加，进一步剔除 miRNA-16-2-3p 后会激活 Runx2 基因，作者推测这可能和 Wnt 信号通路的限制被解除有关。Duan 等认为 miRNA-16-2-3p 是通过阻碍 Wnt5A 介导的 Wnt 信号通路，来抑制人 BMSCs 成骨分化作用的。miRNA-16-2-3p 可望成为一种新型治疗靶点，通过抑制 miRNA-16-2-3p，从而促进 MSCs 分化为成骨细胞，并最终重建骨组织。同样，Wang 等[27]研究了 miRNA-193a 对人 BMSCs 成骨分化的影响，他们发现 miRNA-193a 通过直接作用于靶基因 HMGB1 的 3’UTR 端，反向激活与成骨分化相关联的 MAPK 和 Wnt/β-catenin 信号通路，从而显著抑制 MSCs 的成骨分化。
长链非编码 RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）同 miRNAs 一样，也是参与生长发育、细胞分化和分子转录过程的重要调控因子。位于其中的抗分化非编码 RNA（anti-differentiation non-coding RNA，ANCR），是近年来发现的可负调控 MSCs 分化的 RNA[28]。lncRNAs 与 miRNAs 之间的关系可以概括为以下 4 种：lncRNAs 生成 miRNAs；lncRNAs 与 miRNAs 竞争 mRNAs 靶点；lncRNAs 作为 miRNAs 的海绵，长效抑制 miRNAs；miRNAs 结合 lncRNAs 后降低其稳定性[29]。Peng 等[30]在研究 lncRNA-ANCR 时发现，lncRNA-ANCR 能抑制 hPDLSCs 的成骨分化，过表达 lncRNA-ANCR 时 miRNA-758 的表达会下降；反之，如果抑制 lncRNA-ANCR，miRNA-758 的表达会增加。因此作者认为，lncRNA-ANCR 与 miRNAs 之间的关系是 lncRNA-ANCR 是抑制 miRNAs 的海绵。作者通过进一步靶点预测和验证，发现 miRNA-758 能直接结合 Notch2 的 3’UTR 端第 3222～3228 组碱基，而对 Notch2 起抑制作用。Notch2 是 Wnt/β-catenin 信号通路的关键分子，miRNA-758 通过直接抑制 Notch2 而阻碍 Wnt/β-catenin 信号通路。即 lncRNA-ANCR 是通过 lncRNA-ANCR/miRNA-758/Notch2 轴调控 hPDLSCs 成骨分化的。
目前发现 Hh 信号通路和 OA 的发生密切相关。Woods 等[31]研究了 miRNAs 在 OA 中的作用机制，研究对象分别选用人 MSCs 和小鼠 C3H10T1/2 细胞系，结果发现人和小鼠 miRNA-324-5p 均能通过 Hh 信号通路对 MSCs 成骨分化负调控；但重要的是，两者的作用靶基因并不相同，人类 miRNA-324-5p 的靶基因是 Smo 和 Gli1，小鼠 miRNA-324-5p 的靶基因是 Gpc1。作者强调在人类疾病的研究中，选择人类细胞作为研究对象非常重要，尤其是涉及 miRNAs 与 Hh 信号通路的研究。一种 miRNAs 可以同时作用多个靶基因，比如 miRNA-141。Fariyike 等[32]在研究 miRNA-141 对老化骨骼肌肉系统中的 MSCs 如何起作用时，找到了多个 miRNA-141 的靶基因，包括 SVCT2、SDF1、ZMPSTE24、CDC25 A、Dlx5、BMI1、TGFb1、ICAM-1、PTEN 和 PAPP-A。由于 miRNAs 能结合多个靶基因进行表达，他们猜测在一些关键信号通路上可能还存在尚未发现的靶基因，同样对 miRNA-141 调控成骨分化产生影响。
4 促进成骨分化的 miRNAs
有研究认为通过阻止血清中 Dickkopf-1（DKK1）的表达可以延缓系统性骨丢失的发生，并且 DKK1 的水平与绝经后骨质疏松症以及类风湿性关节炎有密切关系[33]。Tang 等[34]构建了卵巢切除小鼠模型来模拟绝经后骨质疏松症情况，他们发现存在于小鼠血清中的循环 miRNA-433-3p，可以减少 Wnt 信号通路的拮抗物 DKK1 的表达，从而促进成骨细胞形成。这提示循环 miRNAs 与调节 Wnt 信号通路的因子 DKK1 之间存在一种新的反馈调节机制。Fan 等[35]发现，miRNA-450b 是人脂肪来源干细胞（human adipose tissue-derived stromal cells，hADSCs）成骨分化正性调节因子，其靶基因是 BMP-3。miRNA-450b 不仅在体外实验中可以促进 hADSCs 成骨分化，在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠模型中也能增强异位骨的形成。同样，Cai 等[36]也发现 miRNA-224 有促进 MSCs 成骨分化的作用，进一步研究找到其靶基因 Rac1，miRNA-224 抑制 Rac1 表达，反向激活 JAK/STAT3 和 Wnt/β-catenin 信号通路，从而增强 MSCs 成骨分化。
Wang 等[37]研究了 miRNA-33-5p 对成骨分化的调节作用，作者使用一种靶向投递系统将 miRNA-33-5p 送入小鼠后肢卸载（HU）模型中，以检验抗骨质减少的效果。结果表明 miRNA-33-5p 在体外实验中能明显促进小鼠 MC3T3-E1 细胞成骨分化，在投入 HU 模型后能部分恢复机械卸载所导致的骨质减少。因此，作者认为靶向投递 miRNA-33-5p 的模拟物，可以成为一种治疗病理性骨质减少的新策略。Kuang 等[38]在评价循环泛素特异肽酶 45（circulating ubiquitin specific peptidase 45，circUSP45）在糖皮质激素诱导的股骨头坏死（glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head，GIONFH）中的功能时，发现了 1 条 circUSP45/miRNA-127-5p/PTEN 调控轴。PTEN 是 Akt 信号通路重要的抑制因子，miRNA-127-5p 通过抑制 PTEN 表达而间接增加 Akt 的表达，即 miRNA-127-5p 能间接促进人 BMSCs 成骨分化。Kuang 等构建了 GIONFH 小鼠模型来评价 circUSP45 的作用，证实 circUSP45 是 miRNA-127-5p 的海绵，会抑制 miRNA-127-5p 的表达。总之，circUSP45 通过抑制 miRNA-127-5p 表达，增加 PTEN 的表达，阻碍 Akt 信号通路，最终抑制 BMSCs 的成骨分化。
Hu 等[39]研究了 miRNA-26b 在人 BMSCs 分化中的作用，他们发现 miRNA-26b 通过抑制糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）表达激活 Wnt/β-catenin 信号通路。GSK3β 是 Wnt/β-catenin 信号通路关键调控因子，当 miRNA-26b 过表达时，GSK3β 表达下调，导致 β-catenin 通路激活，最后促进了人 BMSCs 的成骨分化。由于地塞米松能促进 GSK3β 的表达，抑制 Wnt 信号通路，所以作者认为 miRNA-26b 可以用来缓解地塞米松所带来的成骨分化抑制作用。Han 等[40]用 miRNAs 序列分析技术检测胸椎黄韧带骨化症与 miRNAs 的关系时发现，miRNA-342-3p 是 MSCs 成骨分化的正性调节因子，它的靶基因是活化转录因子 3（activating transcription factor 3，ATF3）。miRNA-342-3p 能够抑制 ATF3 表达，降低 ATF3 所导致的成骨分化抑制作用。此外，作者还发现在未分化细胞的 Enah/Vasp 样蛋白（recombinant Enah/Vasp like protein，EVL）区域存在高频率的甲基化。当 EVL CpG 岛去甲基化时能够诱导 miRNA-342-3p 的过表达。因此 CpG 岛的甲基化水平及 EVL/miRNA-342-3p 可以用来预测胸椎黄韧带骨化症的风险。
综上，在 MSCs 成骨分化过程中存在着许多起调节作用的 miRNAs 和信号通路，这些 miRNAs 和信号通路构成了一个复杂的分子网络，阐明这个网络中各分子之间的关系对骨科疾病的诊治有重要意义。
5 miRNAs 与骨科疾病
随着 miRNAs 调控成骨分化的研究不断深入，探索 miRNAs 对骨科疾病的诊断与治疗价值正在成为一个新的热点。当前 miRNAs 对一些疾病的治疗已进入临床研究阶段，如 miRNA-34 治疗肺癌[41]、miRNA-122 治疗丙型肝炎[42]、miRNA-103/107 治疗 2 型糖尿病[43]等。Ottosen 等[44]研制出一种被称作 Miravirsen 的 miRNA-122 靶向药物，在已开展的临床 2 期试验中证明对丙型肝炎有很好的治疗效果。miRNAs 和骨科疾病关系的研究目前仍处于实验探索阶段。因为循环 miRNAs 存在于血流和体液中，具有高度稳定性，在严酷条件下如煮沸、冷冻/解冻、酸性或碱性 pH 环境下均不会被破坏[45]，而且它们在个体中的表达也比较恒定。所以循环 miRNAs 可成为研究骨科疾病不同病理状态下理想而灵敏的生物标记物。
6 miRNAs 与骨质疏松症
目前已积累了少量 miRNAs 与骨质疏松症关联性的证据。骨质疏松症是一种多因素疾病，和骨微观结构恶化导致高骨折风险、骨强度减弱导致骨密度（bone mineral density，BMD）降低有关，是骨形成和骨吸收失衡的结果，多见于高龄女性[46]。miRNAs 在骨质疏松症中作用的研究仍十分局限，多数研究样本量偏小，结论可信度不高。由于能获取的研究资料来自于不同样本（如取自不同的细胞系），和不同的研究条件（如骨质疏松症患者是否有低 BMD 或者骨折、是否伴有类风湿性关节炎），以及在筛选和检验 miRNAs 过程中使用了不同的技术手段等，都造成各个研究结果之间难以进行比较[47-49]。虽然有上述困难，miRNAs 及其靶基因依然是骨质疏松症治疗的潜在靶点。
最早进行 miRNAs 与骨质疏松症关系研究时选取的对象是破骨细胞的前体——循环单核细胞。Wang 等[50]寻找外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中是否有合适的 miRNAs 可以作为绝经后骨质疏松症的生物标记物。他们选取了 20 例 BMD 异常的绝经后女性作为研究对象并分成两组，一组 BMD 偏高（Z 评分>0.84），另一组 BMD 偏低（Z 评分<−0.84）。经过 miRNA 序列分析和实时荧光定量 PCR 检测，作者发现 miRNA-133a 在低 BMD 组中表达明显上调，并经靶基因预测后找到了 miRNA-133a 的 3 个靶基因，分别是 CXCL11、CXCR3 和 SLC39A1；Pearson 相关性分析示，所有靶基因均和 miRNA-133a 成负相关。因此作者认为 miRNA-133a 是绝经后骨质疏松症 PBMCs 理想的生物标记物。Seeliger 等[51]进行了人血清和骨组织样本中 miRNAs 和骨质疏松性骨折的相关性分析。作者首先选择 20 例髋部骨折女性作为研究对象，其中包括 10 例骨质疏松症患者，在血清中筛选出了 83 种 miRNAs。接着，作者进一步增加样本数，选择 60 例患者的血清（其中骨质疏松症患者 30 例）和另外 40 例患者的骨样本（包括骨质疏松症患者 20 例）进一步验证 miRNAs。再次筛选后在血清和骨样本中找到了 10 种可用于骨质疏松症诊断和治疗的 miRNAs，分为 3 类，分别是血清和骨样本中均存在的 5 种 miRNAs（miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-24、miRNA-100、miRNA-125b），只存在于血清中的 4 种 miRNAs（miRNA-93、miRNA-122a、miRNA-124a 和 miRNA-148a），以及只存在于骨样本中的 miRNA-25。此外，作者认为人血清 miRNAs 作为实验样本有明显优势，避免了动物样本造成的种属差异，抽血检验能消除传统使用 X 线测量 BMD 诊断骨质疏松症引起的放射暴露，同时采血诊断价格便宜、取材方便并便于临床管理。Weilner 等[52]同样研究了 miRNAs 在骨质疏松性骨折中的诊断作用，他们关注的是新近发生的骨质疏松性股骨颈骨折。作者对 7 例患者血清样本中 175 种 miRNAs 进行筛查，发现其中 6 种 miRNAs 的表达与新近骨折明显相关，分别是 miRNA-133b、miRNA-22-3p、miRNA-10a-5p、miRNA-10b-5p、let-7g-5p 和 miRNA-328-3p；在随后的体外 MSCs 成骨分化实验中，作者进一步验证了其中 3 种 miRNAs（miRNA-22-3p、let-7g-5p 和 miRNA-328-3p）的相关性。
miRNAs 与骨质疏松症的相关性研究，目前多集中于绝经后女性的继发性骨质疏松症，较少关注原发性骨质疏松症和女性绝经前骨质疏松症。Kocijan 等[53]设计了一组不同类型骨质疏松症的临床对照研究，试验组挑选 36 例原发性骨质疏松症伴低创伤性骨折患者，包括 16 例<50 岁的男性、10 例绝经前女性和 10 例绝经后女性；对照组包括 39 例无低创伤性骨折且年龄匹配的健康捐献者，其中 16 例男性、12 例绝经前女性和 11 例绝经后女性。各组血清和血浆样本经实时荧光定量 PCR 等筛选出 8 种循环 miRNAs，分别是 miRNA-152-3p、miRNA-30e-5p、miRNA-140-5p、miRNA-324-3p、miRNA-19b-3p、miRNA-335-5p、miRNA-19a-3p 和 miRNA-550a-3，其中 miRNA-324-3p、miRNA-19a-3p 和 miRNA-19b-3p 首次被证明和成骨分化相关。该研究另外一个重要意义在于首次论证了相关 miRNAs 能用于原发性骨质疏松症和女性绝经前骨质疏松症的诊断和骨折风险预测。最近，Mandourah 等[54]也关注了 miRNAs 与骨质疏松症的关系，他们将 139 例研究对象分成 5 组，分别是：A 组，12 例健康捐献者（男 1 例，女 11 例）；B 组，61 例不伴骨折的骨膜病患者（男 9 例，女 52 例）；C 组，15 例伴骨折的骨膜病患者（男 2 例，女 13 例）；D 组，33 例不伴骨折的骨质疏松症患者（男 6 例，女 27 例）；E 组，18 例骨质疏松性骨折患者（男 2 例，女 16 例）。他们收集到 139 例血清样本和 134 例血浆样本，并进行 miRNAs 分析，发现 miRNA-122-5p 和 miRNA-4516 的表达在不同样本间差异最明显；随后进一步证明了这两种 miRNAs 与易碎性骨折以及骨质疏松症患者的低 BMD 有明显关联。诊断试验与 ROC 曲线分析结果表明，miRNA-122 单独用于诊断的作用有限，miRNA-4516 可以单独用于诊断，但同时检测两种 miRNAs 诊断最有价值（P=0.004）。因此作者推荐同时检测 miRNA-122-5p 和 miRNA-4516 作为诊断骨质疏松症的依据。
7 miRNAs 与其他骨科疾病
miRNAs 在其他骨科疾病中作用的研究更加有限。研究结果显示 miRNAs 的失调与 OA、类风湿性关节炎和骨坏死等疾病的病理机制有关。Yamasaki 等[55]对 miRNA-146a 在 OA 患者中的表达情况进行了研究，研究对象包括 15 例 OA 术后患者（全髋关节成形术后 9 例、全膝关节成形术后 6 例），作者通过 RT-PCR 和原位杂交技术分析了患者关节软骨样本和经 IL-1 诱导后的软骨样本中 miRNA-146a 表达，并依据 Mankin 评分将软骨样本分成Ⅰ度（0～5 分）、Ⅱ度（6～10 分）和Ⅲ度（11～14 分），分别代表轻度 OA、中度 OA 和重度 OA。RT-PCR 结果显示Ⅰ度中 miRNA-146a 和 COL2A1 的表达明显增加，但Ⅱ度和Ⅲ度中 miRNA-146a 和 COL2A1 的表达则降低，只有 MMP-13 在Ⅱ度中表达增加。原位杂交结果表明 miRNA-146a 在软骨组织各层均有表达，特别在软骨表层表达最强。此外，经体外 IL-1 诱导后 miRNA-146a 表达会明显增加。上述结果可部分解释 OA 的病理机制，即 miRNA-146a 经 IL-1 诱导下在Ⅰ度 OA 软骨中表达明显。Kurowska-Stolarska 等[56]发现 miRNA-155 在类风湿性关节炎患者的滑膜及滑液单核巨噬细胞中表达明显增加。miRNA-155 在滑液 CD14+ 细胞中表达增加与 SHIP-1 的表达减少相关。SHIP-1 是一种炎症抑制因子，同时是 miRNA-155 的靶基因，miRNA-155 的过表达导致了 SHIP-1 的下调，同时加速了促炎性细胞因子的生成。作者构建 miRNA-155 缺陷小鼠模型进一步证明了 miRNA-155 对抗原特异性 T 细胞和抗原特异性抗体的分化起促进作用。上述研究说明，miRNA-155/SHIP-1 在类风湿性关节炎患者关节的过度炎症反应中起着重要作用，miRNA-155 有望作为靶基因用于类风湿性关节炎的治疗。
椎间盘退变与髓核恶化有关，研究显示 lncRNAs 在椎间盘退变的发生机制中扮演着关键角色。Xi 等[57]研究调控椎间盘退变患者髓核细胞中 miRNAs 表达的 lncRNAs 时，发现了 1 条 HCG18/miRNA-146a-5p/TRAF6/kappa-B 调控轴。lncRNA- HCG18 作为 miRNA-146a-5 的海绵，在髓核细胞中通过直接结合 miRNA-146a-5 的方式抑制 miRNA-146a-5p 表达。HCG18 在椎间盘退变、椎间盘膨出或椎间盘突出患者中表达明显上调，其表达水平与椎间盘退变等级成正相关。在体外研究中，miRNA-146a-5p 促进 HCG18 表达，抑制髓核细胞生长，诱导细胞凋亡。TRAF6 是 miRNA-146a-5p 的靶基因，由 HCG18 调控。作者认为 HCG18 是椎间盘退变的一种新型早期诊断标记物，同时具有潜在的治疗价值。García-Giménez 等[58]设计了一组青少年先天性脊柱侧弯的临床对照研究，选取的研究对象包括 30 例先天性脊柱侧弯患者和 13 例年龄一致的健康捐献者。作者利用下一代 RNA 测序技术在患者血液样本中筛选出 4 种异常的 miRNAs：miRNA-122a-5p、miRNA-27a-5p、miRNA-223-5p 和 miRNA-1306-3p。他们认为这些 miRNAs 通过操纵信号通路的表观遗传特征来调节骨代谢平衡，进而控制先天性脊柱侧弯患者的遗传背景。即失调的 4 种 miRNAs 可部分解释先天性脊柱侧弯发病机制，有望成为先天性脊柱侧弯早期诊断和评价治疗效果的工具，减少手术介入治疗带来的高风险。
Kao 等[59]通过分析 miRNAs 来预测股骨头坏死的病理机制。作者利用生物信息学预测工具对 46 例股骨头坏死患者和 85 例健康捐献者的外周血 miRNAs 进行比较分析，识别出 51 种差异表达的 miRNAs，其中 34 种表达上调、17 种表达下调；接着作者选出其中 6 种 miRNAs（miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-138-1、miRNA-24-2、miRNA-1290、miRNA-3609）进行微滴数字 PCR 分析，发现表达上调的 miRNA-18a 和 miRNA-19a 与诱导缺血后的血管生成有关，表达下调的 miRNA-138-1 可抑制 MSCs 的成骨分化。作者猜测上述 miRNAs 的靶基因可能是 p53 和 SERBP1，它们与缺氧和低纤维蛋白溶解有关。Kao 等的研究解释了部分股骨头坏死的发病机制，即缺氧抑制了 MSCs 成骨作用，而失调的血管生成可能是通过多种 miRNAs 相互作用而造成的。Ou 等[60]为证明与骨硬化相关的 miRNAs 及其靶基因，对 6 例骨硬化患者及 9 例健康捐献者的外周血 PBMCs 进行深度测序，生物信息学预测及实时荧光定量 PCR 等分析发现了 miRNA-320a 和靶基因 Arf1，它们的表达异常与 CLCN7 基因突变型骨硬化的发病有关。Paget 骨病是一种局灶性骨重建疾病，和破骨细胞活动增强有关[61]。Bianciardi 等[62]对 20 例 Paget 骨病患者和 20 例健康捐献者外周血 PBMCs 中 miRNAs 的表达情况进行统计，找到了 22 种表达异常的 miRNAs，经进一步分析发现其中 8 种 miRNAs（miRNA-26a、miRNA-30c、miRNA-31、miRNA-124a、miRNA-146a、miRNA-148a、miRNA-182、miRNA-223）和骨代谢平衡有关。因为早期研究[51, 63-64]显示，miRNA-146a、miRNA-148a 和 miRNA-223 与破骨活动相关，所以作者认为这 3 种 miRNAs 的异常可解释 Paget 骨病发病机制。
虽然上述疾病病理机制的完全阐明还需要搜集更多的证据，但 miRNAs 参与多种骨代谢紊乱是明确的，或许 miRNAs 用于诊断的作用有限（如血清中的循环 miRNAs 是否具有特异性），但针对 miRNAs 的研究至少可以部分解释疾病的病理机制。此外，目前的研究正面临着一系列挑战。如在进行临床试验研究之前，需要展更多的前期研究解决 miRNAs 人工类似物或 miRNAs 抗体在体内高效传递。单个 miRNA 可以调节多个目标基因，部分 miRNAs 给疾病治疗带来好处时，潜在的安全问题同样值得关注，如 miRNA-29a 的表达会增加乳腺癌的侵袭力，因此不太可能被用于疾病治疗[65]。
最后，miRNAs 针对骨肿瘤如骨肉瘤、骨巨细胞瘤、平滑肌瘤、脂肪肉瘤及骨转移瘤等的诊断和治疗已经很好地开展，这些方面的研究在其他文献中已有深入总结[66-71]，限于篇幅此处不再叙述。
8 总结与展望
miRNAs 在 MSCs 成骨分化过程中扮演着重要角色[72]，miRNAs 的研究对于理解骨骼体内动态平衡调节提供了新的视角[73]，也为寻找骨病的治疗靶点提供了理论依据。同时在研究过程中我们也需要注意一些问题，比如 miRNAs 的吸收对正常细胞是否无害；单条 miRNA 可作用于数百个靶基因，必须考虑附带效应，未来可探索特定 miRNAs 在特定地点和特定阶段用于骨病的诊断与治疗。此外，不同的环境和条件如生活方式、体育活动、饮食与昼夜节律等，对 miRNAs 表达是否有影响也值得探讨。
作者贡献：李晓龙负责综述构思及设计、观点形成、资料收集及文章撰写；孔清泉负责综述构思及设计。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
创伤、骨质疏松症、骨关节炎（osteoarthritis，OA）和骨肿瘤等疾病会导致骨量减少、骨缺损、骨折不愈合以及股骨头坏死等，带来巨大的社会和经济负担，并且严重影响患者的生活质量。骨组织有很强的再生能力，通过成骨细胞和破骨细胞的协同作用形成新的骨组织，来维持人体正常骨代谢的动态平衡。成骨作用开始于 MSCs 分化为成熟的成骨细胞，因此骨质疏松症和 OA 等疾病的防治可以考虑加强 MSCs 的成骨作用和促进新骨形成[1]。近年来，诸多研究发现一些关键的信号通路参与成骨分化的调控，如 TGF-β/BMP-Smads、Wnt/β-catenin、Notch、猬因子（Hedgehog，Hh）、FGF、丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等[2]。除上述信号通路外，激素、生长因子、趋化因子、细胞因子、DNA 甲基化、微小 RNA（microRNA，miRNA）和染色质结构改变等也参与调控成骨分化[3-5]。目前实验证据表明，miRNAs 在 MSCs 成骨分化调控中发挥着关键作用，但是具体作用机制和细节尚未完全阐明。本综述就 miRNAs 对成骨分化调控作用的研究现状及在骨科疾病中作为治疗靶点和诊断工具的应用研究进展进行总结。
1 miRNAs 的定义与功能
miRNAs 广泛存在于真核生物中，是一种内源性非编码长度为 20～22 个核苷酸的小 RNAs，具有高度保守性、时序性和组织特异性[6]。miRNAs 通过对 mRNAs 切割、降解，翻译抑制或甲基化靶基因，转录后对约 60% 的编码基因表达进行调控，因此在诸多疾病中发挥着潜在的重要作用[7]。miRNAs只占人类基因组中的 1%～5%，但 1 条 miRNA 通常可以调控数十甚至数百个基因[8]。最早发现的 miRNA 是 lin-4，Lee 等[9]在 1993 年研究线虫时发现基因 lin-4 能够抑制基因 lin-14，认为基因 lin-4 是通过表达一种调控蛋白来发挥作用。后来研究发现这个基因的产物是单链 RNA[10]。miRNAs 已成为近年研究热点，截止 2018 年 10 月，miRBase 数据库已收录 271 个物种的 38 589 条 miRNAs。
miRNAs 的加工成熟过程与 mRNAs 类似，需要经历核酸酶的剪切加工及碱基互补配对等一系列复杂过程，根据碱基互补配对原则，在结合 3’UTR 时如果碱基不完全匹配，则抑制靶基因蛋白翻译；若完全匹配，靶基因 mRNAs 降解[11]。靶基因预测工具如 PicTar 等软件和荧光素酶报告质粒系统，原理均是设计出 3’UTR 端碱基序列来实现互补配对[12]。此外，miRNAs 与靶基因 mRNAs 不是完全一一对应的，每条 miRNA 都含有多个 mRNAs 靶点，多条 miRNAs 也可以作用于同一条 mRNA。
miRNAs 在细胞生长、发育、分化、凋亡等生物过程中起着重要作用，同时也广泛参与血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统发育和人类癌细胞生长等过程[13]。例如 miRNA-140，研究显示其在 MSCs 成骨分化中表达增高，而抑制成骨分化时表达明显降低，提示 miRNA-140 可能参与 MSCs 成骨分化的调控作用[14]。
2 miRNAs 在成骨分化中的调控作用
Kobayashi 等[15]首先证实敲除小鼠体内由Ⅱ型 α1 胶原基因（collagen type Ⅱ alpha 1，COL2A1）介导的 RNAse Ⅲ核酸内切酶 Dicer，会导致严重的骨生成障碍和小鼠死亡。Gaur 等[16]随后进一步验证了位于成骨细胞中的 Dicer 是通过沉默重组酶起作用，而这些重组酶是由小鼠Ⅰ型 α1 胶原基因或者人类骨羧谷氨酸蛋白/骨钙蛋白基因启动并表达的。成骨细胞中的 Dicer 敲除或沉默后，细胞内 miRNAs 生成会发生障碍，最后导致小鼠肢体发育障碍，说明 miRNAs 的表达在 MSCs 成骨分化中起着非常关键的作用。多数经过验证的 miRNAs 是通过直接关联组织特异性分化的中心调控基因起作用，因此从 miRNAs 角度寻找调控 MSCs 成骨分化的关键基因可行。目前大量实验证据证实 miRNAs 不只作用于 1 个基因，而是同时作用于多个基因，它具有双向性，即抑制一部分基因表达，同时促进另外一部分基因表达，两者最终的结果是叠加的，而不是相互拮抗的[17-19]。这一机制可能是体内互转化的关键因素，即抑制向一种细胞表型分化，促进向另一种细胞表型转化。即 miRNAs 对 MSCs 的成骨作用是正反两面的，一方面通过作用于促进成骨的靶基因表达而直接抑制成骨作用；另一方面是作用于抑制成骨作用的靶基因，间接对 MSCs 成骨作用进行正向调节[20]。
3 抑制成骨分化的 miRNAs
Wei 等[18]发现在人牙周韧带干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）成骨分化过程中，miRNA-21 表达下降。作者通过构建 miRNA-21 表达载体 pGC-LV-pre-miRNA-21-GFP 刺激 miRNA-21 过表达，hPDLSCs 的成骨分化受抑制；相反，构建抗 miRNA-21 表达载体 pGC-LV-anti-miRNA-21-GFP 抑制 miRNA-21 表达，则会促进 hPDLSCs 的成骨分化。进一步研究发现，miRNA-21 是通过抑制对细胞增殖有调节作用的 Smad5 基因发挥作用的。BMP-9 被确认是 BMP 家族中诱导成骨分化的重要成员，但具体诱导机制一直不明确[21]。近年，Liu 等[22]发现 miRNA-155 能够显著下调 BMP-9 诱导的 MSCs 成骨分化，通过抑制 BMP 信号通路上的靶基因 Runt 相关转录因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）和 BMP 受体 2 来发挥作用。随后，Lin 等[23]发现 BMP-2 可诱导小鼠 MC3T3-E1 细胞成骨分化，miRNA-92a-1-5p 表达明显下调，miRNA-92a-1-5p 对成骨分化起抑制作用，是通过负性调控 β-catenin 基因来实现。Saiganesh 等[24]发现转录因子 TGF-β1 能减弱 miRNA-203a-5p 在 MSCs 成骨分化过程中的表达，同时 miRNA-203a-5p 对基质金属蛋白酶 13（matrix metalloproteinases 13，MMP-13）基因有抑制作用，MMP-13 过表达会促进成骨分化，这样就建立了一种 TGF-β1 抑制 miRNA-203a-5p，使 MMP-13 的抑制得到释放的前反馈调节机制。
miRNA-16-2-3p 是新近发现的一种 miRNA，研究证明其可作为标记物用于诊断肝癌、宫颈癌和慢性淋巴细胞白血病和评估预后[25]。最近，Duan 等[26]研究了 miRNA-16-2-3p 调节成骨分化的具体机制，作者发现 46 例骨质疏松症患者骨组织样本中的 miRNA-16-2-3p，其表达与骨形成相关基因 Runx2、成骨相关转录因子（osterix，Osx）和 ALP 的表达成负相关。当上调 miRNA-16-2-3p 时，人 BMSCs 成骨分化过程受阻，miRNA-16-2-3p 直接作用靶基因 Wnt5A 限制 Wnt 信号通路；如果下调 miRNA-16-2-3p，成骨分化明显增加，进一步剔除 miRNA-16-2-3p 后会激活 Runx2 基因，作者推测这可能和 Wnt 信号通路的限制被解除有关。Duan 等认为 miRNA-16-2-3p 是通过阻碍 Wnt5A 介导的 Wnt 信号通路，来抑制人 BMSCs 成骨分化作用的。miRNA-16-2-3p 可望成为一种新型治疗靶点，通过抑制 miRNA-16-2-3p，从而促进 MSCs 分化为成骨细胞，并最终重建骨组织。同样，Wang 等[27]研究了 miRNA-193a 对人 BMSCs 成骨分化的影响，他们发现 miRNA-193a 通过直接作用于靶基因 HMGB1 的 3’UTR 端，反向激活与成骨分化相关联的 MAPK 和 Wnt/β-catenin 信号通路，从而显著抑制 MSCs 的成骨分化。
长链非编码 RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）同 miRNAs 一样，也是参与生长发育、细胞分化和分子转录过程的重要调控因子。位于其中的抗分化非编码 RNA（anti-differentiation non-coding RNA，ANCR），是近年来发现的可负调控 MSCs 分化的 RNA[28]。lncRNAs 与 miRNAs 之间的关系可以概括为以下 4 种：lncRNAs 生成 miRNAs；lncRNAs 与 miRNAs 竞争 mRNAs 靶点；lncRNAs 作为 miRNAs 的海绵，长效抑制 miRNAs；miRNAs 结合 lncRNAs 后降低其稳定性[29]。Peng 等[30]在研究 lncRNA-ANCR 时发现，lncRNA-ANCR 能抑制 hPDLSCs 的成骨分化，过表达 lncRNA-ANCR 时 miRNA-758 的表达会下降；反之，如果抑制 lncRNA-ANCR，miRNA-758 的表达会增加。因此作者认为，lncRNA-ANCR 与 miRNAs 之间的关系是 lncRNA-ANCR 是抑制 miRNAs 的海绵。作者通过进一步靶点预测和验证，发现 miRNA-758 能直接结合 Notch2 的 3’UTR 端第 3222～3228 组碱基，而对 Notch2 起抑制作用。Notch2 是 Wnt/β-catenin 信号通路的关键分子，miRNA-758 通过直接抑制 Notch2 而阻碍 Wnt/β-catenin 信号通路。即 lncRNA-ANCR 是通过 lncRNA-ANCR/miRNA-758/Notch2 轴调控 hPDLSCs 成骨分化的。
目前发现 Hh 信号通路和 OA 的发生密切相关。Woods 等[31]研究了 miRNAs 在 OA 中的作用机制，研究对象分别选用人 MSCs 和小鼠 C3H10T1/2 细胞系，结果发现人和小鼠 miRNA-324-5p 均能通过 Hh 信号通路对 MSCs 成骨分化负调控；但重要的是，两者的作用靶基因并不相同，人类 miRNA-324-5p 的靶基因是 Smo 和 Gli1，小鼠 miRNA-324-5p 的靶基因是 Gpc1。作者强调在人类疾病的研究中，选择人类细胞作为研究对象非常重要，尤其是涉及 miRNAs 与 Hh 信号通路的研究。一种 miRNAs 可以同时作用多个靶基因，比如 miRNA-141。Fariyike 等[32]在研究 miRNA-141 对老化骨骼肌肉系统中的 MSCs 如何起作用时，找到了多个 miRNA-141 的靶基因，包括 SVCT2、SDF1、ZMPSTE24、CDC25 A、Dlx5、BMI1、TGFb1、ICAM-1、PTEN 和 PAPP-A。由于 miRNAs 能结合多个靶基因进行表达，他们猜测在一些关键信号通路上可能还存在尚未发现的靶基因，同样对 miRNA-141 调控成骨分化产生影响。
4 促进成骨分化的 miRNAs
有研究认为通过阻止血清中 Dickkopf-1（DKK1）的表达可以延缓系统性骨丢失的发生，并且 DKK1 的水平与绝经后骨质疏松症以及类风湿性关节炎有密切关系[33]。Tang 等[34]构建了卵巢切除小鼠模型来模拟绝经后骨质疏松症情况，他们发现存在于小鼠血清中的循环 miRNA-433-3p，可以减少 Wnt 信号通路的拮抗物 DKK1 的表达，从而促进成骨细胞形成。这提示循环 miRNAs 与调节 Wnt 信号通路的因子 DKK1 之间存在一种新的反馈调节机制。Fan 等[35]发现，miRNA-450b 是人脂肪来源干细胞（human adipose tissue-derived stromal cells，hADSCs）成骨分化正性调节因子，其靶基因是 BMP-3。miRNA-450b 不仅在体外实验中可以促进 hADSCs 成骨分化，在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠模型中也能增强异位骨的形成。同样，Cai 等[36]也发现 miRNA-224 有促进 MSCs 成骨分化的作用，进一步研究找到其靶基因 Rac1，miRNA-224 抑制 Rac1 表达，反向激活 JAK/STAT3 和 Wnt/β-catenin 信号通路，从而增强 MSCs 成骨分化。
Wang 等[37]研究了 miRNA-33-5p 对成骨分化的调节作用，作者使用一种靶向投递系统将 miRNA-33-5p 送入小鼠后肢卸载（HU）模型中，以检验抗骨质减少的效果。结果表明 miRNA-33-5p 在体外实验中能明显促进小鼠 MC3T3-E1 细胞成骨分化，在投入 HU 模型后能部分恢复机械卸载所导致的骨质减少。因此，作者认为靶向投递 miRNA-33-5p 的模拟物，可以成为一种治疗病理性骨质减少的新策略。Kuang 等[38]在评价循环泛素特异肽酶 45（circulating ubiquitin specific peptidase 45，circUSP45）在糖皮质激素诱导的股骨头坏死（glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head，GIONFH）中的功能时，发现了 1 条 circUSP45/miRNA-127-5p/PTEN 调控轴。PTEN 是 Akt 信号通路重要的抑制因子，miRNA-127-5p 通过抑制 PTEN 表达而间接增加 Akt 的表达，即 miRNA-127-5p 能间接促进人 BMSCs 成骨分化。Kuang 等构建了 GIONFH 小鼠模型来评价 circUSP45 的作用，证实 circUSP45 是 miRNA-127-5p 的海绵，会抑制 miRNA-127-5p 的表达。总之，circUSP45 通过抑制 miRNA-127-5p 表达，增加 PTEN 的表达，阻碍 Akt 信号通路，最终抑制 BMSCs 的成骨分化。
Hu 等[39]研究了 miRNA-26b 在人 BMSCs 分化中的作用，他们发现 miRNA-26b 通过抑制糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）表达激活 Wnt/β-catenin 信号通路。GSK3β 是 Wnt/β-catenin 信号通路关键调控因子，当 miRNA-26b 过表达时，GSK3β 表达下调，导致 β-catenin 通路激活，最后促进了人 BMSCs 的成骨分化。由于地塞米松能促进 GSK3β 的表达，抑制 Wnt 信号通路，所以作者认为 miRNA-26b 可以用来缓解地塞米松所带来的成骨分化抑制作用。Han 等[40]用 miRNAs 序列分析技术检测胸椎黄韧带骨化症与 miRNAs 的关系时发现，miRNA-342-3p 是 MSCs 成骨分化的正性调节因子，它的靶基因是活化转录因子 3（activating transcription factor 3，ATF3）。miRNA-342-3p 能够抑制 ATF3 表达，降低 ATF3 所导致的成骨分化抑制作用。此外，作者还发现在未分化细胞的 Enah/Vasp 样蛋白（recombinant Enah/Vasp like protein，EVL）区域存在高频率的甲基化。当 EVL CpG 岛去甲基化时能够诱导 miRNA-342-3p 的过表达。因此 CpG 岛的甲基化水平及 EVL/miRNA-342-3p 可以用来预测胸椎黄韧带骨化症的风险。
综上，在 MSCs 成骨分化过程中存在着许多起调节作用的 miRNAs 和信号通路，这些 miRNAs 和信号通路构成了一个复杂的分子网络，阐明这个网络中各分子之间的关系对骨科疾病的诊治有重要意义。
5 miRNAs 与骨科疾病
随着 miRNAs 调控成骨分化的研究不断深入，探索 miRNAs 对骨科疾病的诊断与治疗价值正在成为一个新的热点。当前 miRNAs 对一些疾病的治疗已进入临床研究阶段，如 miRNA-34 治疗肺癌[41]、miRNA-122 治疗丙型肝炎[42]、miRNA-103/107 治疗 2 型糖尿病[43]等。Ottosen 等[44]研制出一种被称作 Miravirsen 的 miRNA-122 靶向药物，在已开展的临床 2 期试验中证明对丙型肝炎有很好的治疗效果。miRNAs 和骨科疾病关系的研究目前仍处于实验探索阶段。因为循环 miRNAs 存在于血流和体液中，具有高度稳定性，在严酷条件下如煮沸、冷冻/解冻、酸性或碱性 pH 环境下均不会被破坏[45]，而且它们在个体中的表达也比较恒定。所以循环 miRNAs 可成为研究骨科疾病不同病理状态下理想而灵敏的生物标记物。
6 miRNAs 与骨质疏松症
目前已积累了少量 miRNAs 与骨质疏松症关联性的证据。骨质疏松症是一种多因素疾病，和骨微观结构恶化导致高骨折风险、骨强度减弱导致骨密度（bone mineral density，BMD）降低有关，是骨形成和骨吸收失衡的结果，多见于高龄女性[46]。miRNAs 在骨质疏松症中作用的研究仍十分局限，多数研究样本量偏小，结论可信度不高。由于能获取的研究资料来自于不同样本（如取自不同的细胞系），和不同的研究条件（如骨质疏松症患者是否有低 BMD 或者骨折、是否伴有类风湿性关节炎），以及在筛选和检验 miRNAs 过程中使用了不同的技术手段等，都造成各个研究结果之间难以进行比较[47-49]。虽然有上述困难，miRNAs 及其靶基因依然是骨质疏松症治疗的潜在靶点。
最早进行 miRNAs 与骨质疏松症关系研究时选取的对象是破骨细胞的前体——循环单核细胞。Wang 等[50]寻找外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中是否有合适的 miRNAs 可以作为绝经后骨质疏松症的生物标记物。他们选取了 20 例 BMD 异常的绝经后女性作为研究对象并分成两组，一组 BMD 偏高（Z 评分>0.84），另一组 BMD 偏低（Z 评分<−0.84）。经过 miRNA 序列分析和实时荧光定量 PCR 检测，作者发现 miRNA-133a 在低 BMD 组中表达明显上调，并经靶基因预测后找到了 miRNA-133a 的 3 个靶基因，分别是 CXCL11、CXCR3 和 SLC39A1；Pearson 相关性分析示，所有靶基因均和 miRNA-133a 成负相关。因此作者认为 miRNA-133a 是绝经后骨质疏松症 PBMCs 理想的生物标记物。Seeliger 等[51]进行了人血清和骨组织样本中 miRNAs 和骨质疏松性骨折的相关性分析。作者首先选择 20 例髋部骨折女性作为研究对象，其中包括 10 例骨质疏松症患者，在血清中筛选出了 83 种 miRNAs。接着，作者进一步增加样本数，选择 60 例患者的血清（其中骨质疏松症患者 30 例）和另外 40 例患者的骨样本（包括骨质疏松症患者 20 例）进一步验证 miRNAs。再次筛选后在血清和骨样本中找到了 10 种可用于骨质疏松症诊断和治疗的 miRNAs，分为 3 类，分别是血清和骨样本中均存在的 5 种 miRNAs（miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-24、miRNA-100、miRNA-125b），只存在于血清中的 4 种 miRNAs（miRNA-93、miRNA-122a、miRNA-124a 和 miRNA-148a），以及只存在于骨样本中的 miRNA-25。此外，作者认为人血清 miRNAs 作为实验样本有明显优势，避免了动物样本造成的种属差异，抽血检验能消除传统使用 X 线测量 BMD 诊断骨质疏松症引起的放射暴露，同时采血诊断价格便宜、取材方便并便于临床管理。Weilner 等[52]同样研究了 miRNAs 在骨质疏松性骨折中的诊断作用，他们关注的是新近发生的骨质疏松性股骨颈骨折。作者对 7 例患者血清样本中 175 种 miRNAs 进行筛查，发现其中 6 种 miRNAs 的表达与新近骨折明显相关，分别是 miRNA-133b、miRNA-22-3p、miRNA-10a-5p、miRNA-10b-5p、let-7g-5p 和 miRNA-328-3p；在随后的体外 MSCs 成骨分化实验中，作者进一步验证了其中 3 种 miRNAs（miRNA-22-3p、let-7g-5p 和 miRNA-328-3p）的相关性。
miRNAs 与骨质疏松症的相关性研究，目前多集中于绝经后女性的继发性骨质疏松症，较少关注原发性骨质疏松症和女性绝经前骨质疏松症。Kocijan 等[53]设计了一组不同类型骨质疏松症的临床对照研究，试验组挑选 36 例原发性骨质疏松症伴低创伤性骨折患者，包括 16 例<50 岁的男性、10 例绝经前女性和 10 例绝经后女性；对照组包括 39 例无低创伤性骨折且年龄匹配的健康捐献者，其中 16 例男性、12 例绝经前女性和 11 例绝经后女性。各组血清和血浆样本经实时荧光定量 PCR 等筛选出 8 种循环 miRNAs，分别是 miRNA-152-3p、miRNA-30e-5p、miRNA-140-5p、miRNA-324-3p、miRNA-19b-3p、miRNA-335-5p、miRNA-19a-3p 和 miRNA-550a-3，其中 miRNA-324-3p、miRNA-19a-3p 和 miRNA-19b-3p 首次被证明和成骨分化相关。该研究另外一个重要意义在于首次论证了相关 miRNAs 能用于原发性骨质疏松症和女性绝经前骨质疏松症的诊断和骨折风险预测。最近，Mandourah 等[54]也关注了 miRNAs 与骨质疏松症的关系，他们将 139 例研究对象分成 5 组，分别是：A 组，12 例健康捐献者（男 1 例，女 11 例）；B 组，61 例不伴骨折的骨膜病患者（男 9 例，女 52 例）；C 组，15 例伴骨折的骨膜病患者（男 2 例，女 13 例）；D 组，33 例不伴骨折的骨质疏松症患者（男 6 例，女 27 例）；E 组，18 例骨质疏松性骨折患者（男 2 例，女 16 例）。他们收集到 139 例血清样本和 134 例血浆样本，并进行 miRNAs 分析，发现 miRNA-122-5p 和 miRNA-4516 的表达在不同样本间差异最明显；随后进一步证明了这两种 miRNAs 与易碎性骨折以及骨质疏松症患者的低 BMD 有明显关联。诊断试验与 ROC 曲线分析结果表明，miRNA-122 单独用于诊断的作用有限，miRNA-4516 可以单独用于诊断，但同时检测两种 miRNAs 诊断最有价值（P=0.004）。因此作者推荐同时检测 miRNA-122-5p 和 miRNA-4516 作为诊断骨质疏松症的依据。
7 miRNAs 与其他骨科疾病
miRNAs 在其他骨科疾病中作用的研究更加有限。研究结果显示 miRNAs 的失调与 OA、类风湿性关节炎和骨坏死等疾病的病理机制有关。Yamasaki 等[55]对 miRNA-146a 在 OA 患者中的表达情况进行了研究，研究对象包括 15 例 OA 术后患者（全髋关节成形术后 9 例、全膝关节成形术后 6 例），作者通过 RT-PCR 和原位杂交技术分析了患者关节软骨样本和经 IL-1 诱导后的软骨样本中 miRNA-146a 表达，并依据 Mankin 评分将软骨样本分成Ⅰ度（0～5 分）、Ⅱ度（6～10 分）和Ⅲ度（11～14 分），分别代表轻度 OA、中度 OA 和重度 OA。RT-PCR 结果显示Ⅰ度中 miRNA-146a 和 COL2A1 的表达明显增加，但Ⅱ度和Ⅲ度中 miRNA-146a 和 COL2A1 的表达则降低，只有 MMP-13 在Ⅱ度中表达增加。原位杂交结果表明 miRNA-146a 在软骨组织各层均有表达，特别在软骨表层表达最强。此外，经体外 IL-1 诱导后 miRNA-146a 表达会明显增加。上述结果可部分解释 OA 的病理机制，即 miRNA-146a 经 IL-1 诱导下在Ⅰ度 OA 软骨中表达明显。Kurowska-Stolarska 等[56]发现 miRNA-155 在类风湿性关节炎患者的滑膜及滑液单核巨噬细胞中表达明显增加。miRNA-155 在滑液 CD14+ 细胞中表达增加与 SHIP-1 的表达减少相关。SHIP-1 是一种炎症抑制因子，同时是 miRNA-155 的靶基因，miRNA-155 的过表达导致了 SHIP-1 的下调，同时加速了促炎性细胞因子的生成。作者构建 miRNA-155 缺陷小鼠模型进一步证明了 miRNA-155 对抗原特异性 T 细胞和抗原特异性抗体的分化起促进作用。上述研究说明，miRNA-155/SHIP-1 在类风湿性关节炎患者关节的过度炎症反应中起着重要作用，miRNA-155 有望作为靶基因用于类风湿性关节炎的治疗。
椎间盘退变与髓核恶化有关，研究显示 lncRNAs 在椎间盘退变的发生机制中扮演着关键角色。Xi 等[57]研究调控椎间盘退变患者髓核细胞中 miRNAs 表达的 lncRNAs 时，发现了 1 条 HCG18/miRNA-146a-5p/TRAF6/kappa-B 调控轴。lncRNA- HCG18 作为 miRNA-146a-5 的海绵，在髓核细胞中通过直接结合 miRNA-146a-5 的方式抑制 miRNA-146a-5p 表达。HCG18 在椎间盘退变、椎间盘膨出或椎间盘突出患者中表达明显上调，其表达水平与椎间盘退变等级成正相关。在体外研究中，miRNA-146a-5p 促进 HCG18 表达，抑制髓核细胞生长，诱导细胞凋亡。TRAF6 是 miRNA-146a-5p 的靶基因，由 HCG18 调控。作者认为 HCG18 是椎间盘退变的一种新型早期诊断标记物，同时具有潜在的治疗价值。García-Giménez 等[58]设计了一组青少年先天性脊柱侧弯的临床对照研究，选取的研究对象包括 30 例先天性脊柱侧弯患者和 13 例年龄一致的健康捐献者。作者利用下一代 RNA 测序技术在患者血液样本中筛选出 4 种异常的 miRNAs：miRNA-122a-5p、miRNA-27a-5p、miRNA-223-5p 和 miRNA-1306-3p。他们认为这些 miRNAs 通过操纵信号通路的表观遗传特征来调节骨代谢平衡，进而控制先天性脊柱侧弯患者的遗传背景。即失调的 4 种 miRNAs 可部分解释先天性脊柱侧弯发病机制，有望成为先天性脊柱侧弯早期诊断和评价治疗效果的工具，减少手术介入治疗带来的高风险。
Kao 等[59]通过分析 miRNAs 来预测股骨头坏死的病理机制。作者利用生物信息学预测工具对 46 例股骨头坏死患者和 85 例健康捐献者的外周血 miRNAs 进行比较分析，识别出 51 种差异表达的 miRNAs，其中 34 种表达上调、17 种表达下调；接着作者选出其中 6 种 miRNAs（miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-138-1、miRNA-24-2、miRNA-1290、miRNA-3609）进行微滴数字 PCR 分析，发现表达上调的 miRNA-18a 和 miRNA-19a 与诱导缺血后的血管生成有关，表达下调的 miRNA-138-1 可抑制 MSCs 的成骨分化。作者猜测上述 miRNAs 的靶基因可能是 p53 和 SERBP1，它们与缺氧和低纤维蛋白溶解有关。Kao 等的研究解释了部分股骨头坏死的发病机制，即缺氧抑制了 MSCs 成骨作用，而失调的血管生成可能是通过多种 miRNAs 相互作用而造成的。Ou 等[60]为证明与骨硬化相关的 miRNAs 及其靶基因，对 6 例骨硬化患者及 9 例健康捐献者的外周血 PBMCs 进行深度测序，生物信息学预测及实时荧光定量 PCR 等分析发现了 miRNA-320a 和靶基因 Arf1，它们的表达异常与 CLCN7 基因突变型骨硬化的发病有关。Paget 骨病是一种局灶性骨重建疾病，和破骨细胞活动增强有关[61]。Bianciardi 等[62]对 20 例 Paget 骨病患者和 20 例健康捐献者外周血 PBMCs 中 miRNAs 的表达情况进行统计，找到了 22 种表达异常的 miRNAs，经进一步分析发现其中 8 种 miRNAs（miRNA-26a、miRNA-30c、miRNA-31、miRNA-124a、miRNA-146a、miRNA-148a、miRNA-182、miRNA-223）和骨代谢平衡有关。因为早期研究[51, 63-64]显示，miRNA-146a、miRNA-148a 和 miRNA-223 与破骨活动相关，所以作者认为这 3 种 miRNAs 的异常可解释 Paget 骨病发病机制。
虽然上述疾病病理机制的完全阐明还需要搜集更多的证据，但 miRNAs 参与多种骨代谢紊乱是明确的，或许 miRNAs 用于诊断的作用有限（如血清中的循环 miRNAs 是否具有特异性），但针对 miRNAs 的研究至少可以部分解释疾病的病理机制。此外，目前的研究正面临着一系列挑战。如在进行临床试验研究之前，需要展更多的前期研究解决 miRNAs 人工类似物或 miRNAs 抗体在体内高效传递。单个 miRNA 可以调节多个目标基因，部分 miRNAs 给疾病治疗带来好处时，潜在的安全问题同样值得关注，如 miRNA-29a 的表达会增加乳腺癌的侵袭力，因此不太可能被用于疾病治疗[65]。
最后，miRNAs 针对骨肿瘤如骨肉瘤、骨巨细胞瘤、平滑肌瘤、脂肪肉瘤及骨转移瘤等的诊断和治疗已经很好地开展，这些方面的研究在其他文献中已有深入总结[66-71]，限于篇幅此处不再叙述。
8 总结与展望
miRNAs 在 MSCs 成骨分化过程中扮演着重要角色[72]，miRNAs 的研究对于理解骨骼体内动态平衡调节提供了新的视角[73]，也为寻找骨病的治疗靶点提供了理论依据。同时在研究过程中我们也需要注意一些问题，比如 miRNAs 的吸收对正常细胞是否无害；单条 miRNA 可作用于数百个靶基因，必须考虑附带效应，未来可探索特定 miRNAs 在特定地点和特定阶段用于骨病的诊断与治疗。此外，不同的环境和条件如生活方式、体育活动、饮食与昼夜节律等，对 miRNAs 表达是否有影响也值得探讨。
作者贡献：李晓龙负责综述构思及设计、观点形成、资料收集及文章撰写；孔清泉负责综述构思及设计。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。