引用本文： 张培, 刘泉, 樊宗庆, 吴敏, 朱坤, 周建生, 项平. 带肌腹血供腓骨长肌腱移植重建对兔前交叉韧带止点转归影响的研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(7): 848-853. doi: 10.7507/1002-1892.201912048 复制
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）是膝关节重要稳定装置，有限制胫骨前移、防止膝关节过伸、控制胫骨旋转、维持胫骨和股骨对应关系的作用[1]。ACL 断裂后无法自愈，如不予以治疗将会导致膝关节不稳，继发软骨和半月板损伤，加速膝关节退变，最终导致骨关节炎，严重影响膝关节功能[2]。
关节镜下自体肌腱重建是临床治疗 ACL 损伤常用方法。血供是影响重建术后腱-骨愈合的重要因素之一，良好血供可以促进移植物腱-骨界面生长，进而有利于韧带止点的形成，对膝关节功能恢复起到积极作用。吴波等[3]研究认为 ACL 残端内有大量生长因子，重建时保留韧带残端可以明显增加移植物血供，进而促进重建韧带功能恢复。周祥兴等[4]采用带血管蒂髌韧带修复重建 ACL，获得良好治疗效果。因此，如何充分利用移植物周围血管促进其重建术后血管化，以提高重建效果，是需要关注的方向。为此，我们从肌腹到肌腱的血供着手，探讨采用带肌腹血供腓骨长肌腱重建兔 ACL 后，移植物在骨隧道内愈合以及韧带止点转归情况，以期为临床提高 ACL 重建疗效提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康新西兰大白兔 80 只，雌雄不拘，体质量 2～3 kg，购自蚌埠医学院实验动物中心。经前、后抽屉试验及侧方应力试验检查膝关节均正常后，随机分成 A、B 两组，每组 40 只，分别制备带或不带肌腹血供的自体腓骨长肌腱移植重建 ACL 模型。
1.2 动物模型制备方法
两组动物术前禁食水 24 h。术前 30 min 肌肉注射阿托品（0.5 mg/kg）、耳缘静脉注射 20% 氨基甲酸乙酯（5 mL/kg），同时缓慢注射 20 mm 平衡液。麻醉满意后，将实验动物固定于手术操作台上，术野聚维酮碘溶液消毒后铺巾。
1.2.1 移植物切取
自右后肢跟骨外侧至足跖趾关节中后 1/3 处作一纵切口，分离皮肤和皮下，可见腓骨长肌腱从外上斜向内下绕至足底；从足外侧缘切断该肌腱，向近端游离达 5 cm 长。A 组将腓骨长肌腱连同肌腹经皮下隧道向上游离至膝关节；B 组不保留肌腹，仅切取腓骨长肌腱。
1.2.2 ACL 损伤模型制备
沿右后肢髌骨内侧作长约 3.5 cm 切口，依次切开皮肤、皮下组织、髌骨内侧支持带及关节囊，使髌骨外侧脱位，充分暴露股骨髁和胫骨平台，在股骨和胫骨 ACL 止点处切除 ACL，检查前抽屉试验阳性提示 ACL 损伤模型制备成功。手术时注意保护关节面、关节软骨、后交叉韧带及髌下脂肪垫。
1.2.3 ACL 重建
① 制备胫骨隧道：屈膝 90°，利用胫骨 ACL 瞄准器，选用直径 2 mm 克氏针装于电钻制备胫骨隧道。骨隧道入口在胫骨结节内侧，与胫骨成 45° 角，出口在原 ACL 胫骨止点中心。② 制备股骨隧道：屈膝 100°，沿 ACL 方向安置股骨隧道定位器（Smith & Nephew 公司，美国），外侧髁定位为 11:00 点处，由关节内向关节外钻穿股骨外侧髁，制作股骨隧道。③ 移植物重建：将腓骨长肌腱远端用细线固定，以带钩的注射器针头引导，将细线穿过胫骨和股骨隧道，牵拉细线将腓骨长肌腱自远端依次穿过胫骨和股骨隧道。屈膝 30°，将腓骨长肌腱两端缝线悬吊固定，A 组注意保护肌腹血供，移植物近端与腓骨长肌肌腹相连。生理盐水冲洗，逐层缝合关节腔及切口。术后即刻膝关节腔内注射庆大霉素 1 万 U。术后两组实验动物自由负重，每天肌肉注射青霉素 8 万 U，共 6 d。见图 1。
图1
A 组 ACL 损伤重建模型制备示意图
a. ACL 损伤（箭头）；b. 切取的带肌腹血供的自体腓骨长肌腱（箭头）；c. ACL 重建（箭头）
Figure1. Preparation of ACL reconstruction model in group Aa. ACL rupture (arrow); b. Autogenous peroneus longus tendon with blood supply (arrow); c. ACL reconstruction (arrow)
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察术后两组实验动物饮食、切口愈合以及双膝关节活动情况。
1.3.2 大体观察
于 4、8、16 周两组各取 3 只实验动物，同上法麻醉后从原切口进入，使髌骨外脱位，充分显露重建韧带。观察移植物色泽、有无滑膜包裹、滑膜上有无血管浸润，以及半月板、关节软骨有无退变。完整切取两组膝关节，置于 10% 中性甲醛固定 3 d 后，观察关节内移植物与骨隧道间有无空隙。然后将标本置于 50% 甲酸脱钙液脱钙后纵形剖开，观察腱-骨愈合情况。
1.3.3 组织学观察
大体观察后，取两组脱钙后腱-骨标本修整成 1 cm×1 cm×1 cm 组织块，常规脱水、透明、石蜡包埋，切片，片厚 4 μm。常规 HE 染色后，光镜下观察移植物与骨隧道间组织类型，有无血管长入及纤维连接，软骨细胞生长情况，有无炎症细胞浸润，以及有无“潮线”结构。取正常膝关节标本作为对照。
1.3.4 生物力学测试
于 8、16 周两组各取 12 只动物，空气栓塞处死后，于膝关节上、下 3 cm 处截断股骨和胫骨，取完整膝关节，剔除周围软组织，包括半月板、后交叉韧带，胫骨和股骨间只保留移植物相连。将股骨与胫骨分别固定于万能材料试验机（Zwick 公司，德国），调整膝关节于屈曲 30°位，胫骨、股骨以膝关节为中心按 5 mm/min 速度向相反方向加载负荷，最大加载负荷为 500 N，测试并记录腱-骨界面最大抗拉强度。同时观察 ACL 止点（韧带与骨隧道接触部位）断裂发生例数，计算止点断裂率。
1.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；计数资料组间比较采用 Fisher 确切概率法；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
两组动物均存活至实验完成；麻醉苏醒后自动觅食及饮水，切口愈合良好，均恢复正常活动。
2.2 大体观察
术后 4 周，两组移植物表面均有滑膜包裹，且 A 组滑膜多于 B 组。A、B 组腱-骨界面有软组织生长，并且软组织内有血管浸润，但 A 组软组织更致密、血管浸润更丰富。两组骨隧道与移植物间均有空隙，骨隧道均有扩大现象。
术后 8 周，两组移植物表面滑膜包裹更明显，滑膜表面有光泽，重建韧带弹性较好，腱-骨界面软组织变硬，A 组较 B 组变硬明显。A 组移植物与骨隧道间空隙相对 4 周时明显减小，移植物与骨隧道愈合良好，与骨组织相连的周边部分腱性结构模糊；而 B 组仍有轻度骨隧道扩大。
术后 16 周，两组移植物滑膜包裹明显，关节液清亮，重建韧带弹性较好，骨隧道与移植物愈合。A 组移植物腱-骨间分界不清，无骨隧道扩大现象，形成类似正常韧带止点结构；而 B 组腱-骨间仍存在明显分界。见图 2。
图2
各组术后大体观察
从左至右分别为术后 4、8、16 周 a. A 组；b. B 组
Figure2. Gross observation of the two groups after operationFrom left to right for 4, 8, and 16 weeks after operation a. Group A; b. Group B
2.3 组织学观察
正常 ACL 止点处从韧带到骨组织具有韧带、纤维软骨、钙化软骨和骨 4 层移行结构，纤维软骨和钙化软骨之间有典型的“潮线”相隔。
术后 4 周，两组移植物和骨隧道间充满肉芽组织，血管增生。A 组移植物胶原纤维增生，其中可见血管，成纤维细胞增生；腱-骨之间无缝隙，软骨细胞增生，可见少量胶原纤维，但排列紊乱。B 组移植物胶原纤维增生相对 A 组少；腱-骨之间组织疏松，成纤维细胞较少，可见少量胶原纤维。
术后 8 周，A 组移植物与骨隧道间纤维组织增生较多，腱-骨之间形成致密的纤维连接，并进一步形成纤维软骨带，呈现新骨组织包绕腱组织并向其中长入，但“潮线”结构不明显；软骨细胞增生，分泌细胞外基质并逐渐钙化，骨小梁周围有成骨细胞增生。B 组变化与 A 组相似，腱-骨之间也形成纤维连接带，但纤维软骨连接组织没有 A 组致密，软骨细胞增生和钙化较 A 组明显减少，也未形成“潮线”结构。
术后 16 周，A 组移植物和骨隧道未见明显分界，腱-骨界面之间形成连续的纤维软骨连接，腱-骨移行部分分化成熟，从韧带到骨组织出现韧带、纤维软骨、钙化软骨、骨组织，钙化组织和非钙化组织之间有“潮线”结构；软骨细胞增生明显并钙化。B 组移植物和骨隧道之间也形成纤维软骨连接，按应力方向排列，但骨组织和韧带组织分界尚清楚，“潮线”结构亦不明显。见图 3。
图3
各组术后组织学观察（HE×100）
从左至右分别为术后 4、8、16 周 a. A 组；b. B 组
Figure3. Histological observation of the two groups after operation (HE×100)From left to right for 4, 8, and 16 weeks after operation a. Group A; b. Group B
2.4 生物力学测试
术后 8 周，A、B 组分别有 4、6 例发生 ACL 止点断裂，止点断裂率分别为 33.3%、50.0%；最大抗拉强度分别为（43.42±4.15）、（38.35±4.39）N。术后 16 周，A、B 组分别有 1、3 例发生 ACL 止点断裂，止点断裂率分别为 8.3%、25.0%；最大抗拉强度分别为（74.30±7.62）、（65.94±5.77）N。术后 8、16 周 A、B 组止点断裂率比较，差异均无统计学意义（P=0.680；P=0.590）；而最大抗拉强度比较差异有统计学意义（t=18.503，P=0.001；t=25.391，P=0.001）。
3 讨论
重建术后 ACL 止点的良好转归有利于移植物发挥正常生理功能，移植物和骨隧道之间的转归过程是腱-骨界面宿主细胞生长、胶原纤维生成，而后由纤维细胞长入肌腱。张冉等[5]将肌腱周围组织包绕移植物后植入骨隧道，发现可以显著增加 VEGF 水平和血管生成，加速再血管化过程，进而促进 ACL 止点转归。有学者认为，ACL 残端中具有促进血管、神经修复的基因，因此保留残端重建 ACL 有利于上述相关基因的表达[6-7]，进而降低患者膝关节疼痛评分、促进膝关节活动度的恢复、提高关节功能评分，加速患者术后关节功能康复[8]。并且，Nguyen 等[9]研究认为保留韧带血管的网络纤维，可以进一步促进 ACL 止点转归。Kanamoto 等[10]在兔 ACL 重建过程中，发现血管生成速度和数量与术后关节功能恢复程度相关。同时，研究显示在术中保留髌下脂肪垫能够促进 ACL 移植物的再血管化过程[11]。本研究发现与 B 组相比，A 组重建韧带内血管增生较多，周围细胞增生并逐渐长入韧带组织，有较多增生的纤维软骨。说明 A 组移植物从肌腹直接提供的部分血供有利于移植物和骨隧道之间纤维组织填充、血管再生，而再生的血管又可以与移植物内血供连接，增加了腱-骨间血供，为成纤维细胞再生、胶原纤维分泌、软骨细胞再生以及软骨细胞钙化奠定基础。
移植物在骨隧道内的血管化受诸多因素影响，如骨隧道直径、骨隧道位置、移植物固定是否牢固、移植物在骨隧道内的长度、移植物来源、移植物血供等[12-13]，而再血管化是重建韧带成功的重要因素。纪庆明等[14]研究表明，临床 ACL 重建时将自体富血小板血浆植入骨隧道中，可以明显促进止点再血管化。郝滋辰等[15]研究认为相对于 BMSCs，ACL 来源的 MSCs 可以明显促进移植物在骨隧道内的早期血管化。重建韧带的肌腱由于游离后很容易失去血供，其血循环重建需要较长时间才能完成。术后重建 ACL 血供来源于手术创伤刺激引起的炎症介质以及各种生长因子的释放，同时髌下脂肪垫中的毛细血管增生并向移植物表面包裹[16]。本课题组前期以兔为实验模型，将 TGF-β1、bFGF 植入移植物骨隧道中，术后发现韧带内的血管增生明显，而细胞坏死、胶原崩解减少。然而这些方法均为血管再生，并不是来源于移植物本身的血供[17]。本研究 A 组是用近端与肌腹相连的腓骨长肌腱移植重建 ACL，充分利用肌腹血供，实验结果显示 A 组 ACL 止点愈合快于 B 组，止点较早形成成熟的纤维软骨连接，说明从肌腹进入肌腱的血供对移植后的腱-骨愈合有直接促进作用，使腱-骨之间血供更丰富，有利于成纤维细胞增生并分泌胶原纤维，更有利于软骨细胞增生和钙化。
移植物的良好转归对韧带的生物力学改善起到重要作用，一般认为肌腱移植重建 ACL 后都要经历变性坏死、重新血管化、细胞增殖和重新塑形过程，在此过程中移植物生物力学性能会下降[18]。之后，随着时间延长，移植物止点愈合逐渐成熟，最大抗拉强度等力学性能逐渐改善[19-20]。本实验结果显示两组止点断裂率无明显差异，但 A 组最大抗拉强度明显大于 B 组，说明 A 组肌腱组织由于有来自肌腹的血供，移植后早期变性坏死不明显，肌腱抗拉强度较 B 组大。组织学观察结果也进一步验证了生物力学测试结果。8 周时 A 组 ACL 止点愈合较 B 组好，已经形成致密纤维软骨连接，而 B 组软骨钙化明显少于 A 组，所形成的纤维软骨连接亦不明显，8 周时的止点断裂率较高。因此，肌腹直接血供可以明显减少移植物变性坏死，对力学性能的改善起到积极作用。
目前认为韧带或者肌腱止点根据其结构不同可分为直接止点和间接止点，直接止点有典型的 4 层结构，从韧带到骨组织依次是纤维组织、纤维软骨、钙化软骨和骨，纤维软骨和钙化软骨之间有“潮线”结构。间接止点根据结构不同又分为两种亚型：骨膜型间接止点和骨型间接止点，前者是纤维组织间接通过骨膜连于骨，后者则直接连于骨，一般认为间接止点是在肌腱与骨组织之间形成穿透性的胶原纤维连接，即 Sharpey 纤维，Sharpey 纤维是将肌腱、韧带或骨膜锚定在骨上的纤维结构[21]。以 Sharpey 纤维为止点的愈合成为间接愈合，而以纤维软骨为止点的愈合则认为是直接愈合。关于腱-骨愈合的组织学转归，相关研究结果不一致，主要与学者们对间接止点和直接止点的界定标准不同有关，另外观察部位也会影响组织学结果。本研究发现，4 周时 A 组腱-骨之间相对 B 组有较多肉芽组织填充、血管增生、成纤维细胞增生，并分泌胶原纤维，软骨细胞增生，此时的腱-骨连接主要是肉芽组织和胶原纤维，亦可认为是间接止点；8 周时 A 组胶原纤维进一步增多，软骨细胞增生，钙化增多，腱-骨之间形成纤维软骨连接；16 周时此连接更加紧密，钙化区和非钙化区形成“潮线”结构，4 层结构逐渐明显，此时肌腱和骨隧道之间形成成熟的纤维软骨连接，亦可认为是直接止点。上述结果提示移植物肌腹血供有利于移植韧带直接止点的形成。此外，腓骨长肌腱切取时保留肌腹的同时保留了部分腓浅神经，对肌腱具有神经营养作用，膝关节的稳定和功能维持离不开正常的本体感觉，保留肌腹的血供更有利于移植物以及周围滑膜神经的恢复[22]。
综上述，带肌腹血供的腓骨长肌腱移植重建对 ACL 止点转归具有明显促进作用，进而提高重建效果，同时也进一步说明了移植物血供是影响 ACL 移植重建后止点转归的重要因素。在保证血供条件下如何有效固定移植物止点，以及血供促进止点转归的基因表达机制，尚需进一步探讨。
作者贡献：刘泉、周建生、吴敏、张培负责科研课题设计；张培、樊宗庆、项平负责实验实施及文章撰写；朱坤负责数据收集、整理。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经蚌埠医学院动物伦理委员会批准（伦动批字［2016］第 032 号）。实验过程中对动物处置严格遵守国家科学技术部 2006 年《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。实验动物使用许可证号：SYXK（皖）2016-006。
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）是膝关节重要稳定装置，有限制胫骨前移、防止膝关节过伸、控制胫骨旋转、维持胫骨和股骨对应关系的作用[1]。ACL 断裂后无法自愈，如不予以治疗将会导致膝关节不稳，继发软骨和半月板损伤，加速膝关节退变，最终导致骨关节炎，严重影响膝关节功能[2]。
关节镜下自体肌腱重建是临床治疗 ACL 损伤常用方法。血供是影响重建术后腱-骨愈合的重要因素之一，良好血供可以促进移植物腱-骨界面生长，进而有利于韧带止点的形成，对膝关节功能恢复起到积极作用。吴波等[3]研究认为 ACL 残端内有大量生长因子，重建时保留韧带残端可以明显增加移植物血供，进而促进重建韧带功能恢复。周祥兴等[4]采用带血管蒂髌韧带修复重建 ACL，获得良好治疗效果。因此，如何充分利用移植物周围血管促进其重建术后血管化，以提高重建效果，是需要关注的方向。为此，我们从肌腹到肌腱的血供着手，探讨采用带肌腹血供腓骨长肌腱重建兔 ACL 后，移植物在骨隧道内愈合以及韧带止点转归情况，以期为临床提高 ACL 重建疗效提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康新西兰大白兔 80 只，雌雄不拘，体质量 2～3 kg，购自蚌埠医学院实验动物中心。经前、后抽屉试验及侧方应力试验检查膝关节均正常后，随机分成 A、B 两组，每组 40 只，分别制备带或不带肌腹血供的自体腓骨长肌腱移植重建 ACL 模型。
1.2 动物模型制备方法
两组动物术前禁食水 24 h。术前 30 min 肌肉注射阿托品（0.5 mg/kg）、耳缘静脉注射 20% 氨基甲酸乙酯（5 mL/kg），同时缓慢注射 20 mm 平衡液。麻醉满意后，将实验动物固定于手术操作台上，术野聚维酮碘溶液消毒后铺巾。
1.2.1 移植物切取
自右后肢跟骨外侧至足跖趾关节中后 1/3 处作一纵切口，分离皮肤和皮下，可见腓骨长肌腱从外上斜向内下绕至足底；从足外侧缘切断该肌腱，向近端游离达 5 cm 长。A 组将腓骨长肌腱连同肌腹经皮下隧道向上游离至膝关节；B 组不保留肌腹，仅切取腓骨长肌腱。
1.2.2 ACL 损伤模型制备
沿右后肢髌骨内侧作长约 3.5 cm 切口，依次切开皮肤、皮下组织、髌骨内侧支持带及关节囊，使髌骨外侧脱位，充分暴露股骨髁和胫骨平台，在股骨和胫骨 ACL 止点处切除 ACL，检查前抽屉试验阳性提示 ACL 损伤模型制备成功。手术时注意保护关节面、关节软骨、后交叉韧带及髌下脂肪垫。
1.2.3 ACL 重建
① 制备胫骨隧道：屈膝 90°，利用胫骨 ACL 瞄准器，选用直径 2 mm 克氏针装于电钻制备胫骨隧道。骨隧道入口在胫骨结节内侧，与胫骨成 45° 角，出口在原 ACL 胫骨止点中心。② 制备股骨隧道：屈膝 100°，沿 ACL 方向安置股骨隧道定位器（Smith & Nephew 公司，美国），外侧髁定位为 11:00 点处，由关节内向关节外钻穿股骨外侧髁，制作股骨隧道。③ 移植物重建：将腓骨长肌腱远端用细线固定，以带钩的注射器针头引导，将细线穿过胫骨和股骨隧道，牵拉细线将腓骨长肌腱自远端依次穿过胫骨和股骨隧道。屈膝 30°，将腓骨长肌腱两端缝线悬吊固定，A 组注意保护肌腹血供，移植物近端与腓骨长肌肌腹相连。生理盐水冲洗，逐层缝合关节腔及切口。术后即刻膝关节腔内注射庆大霉素 1 万 U。术后两组实验动物自由负重，每天肌肉注射青霉素 8 万 U，共 6 d。见图 1。
图1
A 组 ACL 损伤重建模型制备示意图
a. ACL 损伤（箭头）；b. 切取的带肌腹血供的自体腓骨长肌腱（箭头）；c. ACL 重建（箭头）
Figure1. Preparation of ACL reconstruction model in group Aa. ACL rupture (arrow); b. Autogenous peroneus longus tendon with blood supply (arrow); c. ACL reconstruction (arrow)
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察术后两组实验动物饮食、切口愈合以及双膝关节活动情况。
1.3.2 大体观察
于 4、8、16 周两组各取 3 只实验动物，同上法麻醉后从原切口进入，使髌骨外脱位，充分显露重建韧带。观察移植物色泽、有无滑膜包裹、滑膜上有无血管浸润，以及半月板、关节软骨有无退变。完整切取两组膝关节，置于 10% 中性甲醛固定 3 d 后，观察关节内移植物与骨隧道间有无空隙。然后将标本置于 50% 甲酸脱钙液脱钙后纵形剖开，观察腱-骨愈合情况。
1.3.3 组织学观察
大体观察后，取两组脱钙后腱-骨标本修整成 1 cm×1 cm×1 cm 组织块，常规脱水、透明、石蜡包埋，切片，片厚 4 μm。常规 HE 染色后，光镜下观察移植物与骨隧道间组织类型，有无血管长入及纤维连接，软骨细胞生长情况，有无炎症细胞浸润，以及有无“潮线”结构。取正常膝关节标本作为对照。
1.3.4 生物力学测试
于 8、16 周两组各取 12 只动物，空气栓塞处死后，于膝关节上、下 3 cm 处截断股骨和胫骨，取完整膝关节，剔除周围软组织，包括半月板、后交叉韧带，胫骨和股骨间只保留移植物相连。将股骨与胫骨分别固定于万能材料试验机（Zwick 公司，德国），调整膝关节于屈曲 30°位，胫骨、股骨以膝关节为中心按 5 mm/min 速度向相反方向加载负荷，最大加载负荷为 500 N，测试并记录腱-骨界面最大抗拉强度。同时观察 ACL 止点（韧带与骨隧道接触部位）断裂发生例数，计算止点断裂率。
1.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；计数资料组间比较采用 Fisher 确切概率法；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
两组动物均存活至实验完成；麻醉苏醒后自动觅食及饮水，切口愈合良好，均恢复正常活动。
2.2 大体观察
术后 4 周，两组移植物表面均有滑膜包裹，且 A 组滑膜多于 B 组。A、B 组腱-骨界面有软组织生长，并且软组织内有血管浸润，但 A 组软组织更致密、血管浸润更丰富。两组骨隧道与移植物间均有空隙，骨隧道均有扩大现象。
术后 8 周，两组移植物表面滑膜包裹更明显，滑膜表面有光泽，重建韧带弹性较好，腱-骨界面软组织变硬，A 组较 B 组变硬明显。A 组移植物与骨隧道间空隙相对 4 周时明显减小，移植物与骨隧道愈合良好，与骨组织相连的周边部分腱性结构模糊；而 B 组仍有轻度骨隧道扩大。
术后 16 周，两组移植物滑膜包裹明显，关节液清亮，重建韧带弹性较好，骨隧道与移植物愈合。A 组移植物腱-骨间分界不清，无骨隧道扩大现象，形成类似正常韧带止点结构；而 B 组腱-骨间仍存在明显分界。见图 2。
图2
各组术后大体观察
从左至右分别为术后 4、8、16 周 a. A 组；b. B 组
Figure2. Gross observation of the two groups after operationFrom left to right for 4, 8, and 16 weeks after operation a. Group A; b. Group B
2.3 组织学观察
正常 ACL 止点处从韧带到骨组织具有韧带、纤维软骨、钙化软骨和骨 4 层移行结构，纤维软骨和钙化软骨之间有典型的“潮线”相隔。
术后 4 周，两组移植物和骨隧道间充满肉芽组织，血管增生。A 组移植物胶原纤维增生，其中可见血管，成纤维细胞增生；腱-骨之间无缝隙，软骨细胞增生，可见少量胶原纤维，但排列紊乱。B 组移植物胶原纤维增生相对 A 组少；腱-骨之间组织疏松，成纤维细胞较少，可见少量胶原纤维。
术后 8 周，A 组移植物与骨隧道间纤维组织增生较多，腱-骨之间形成致密的纤维连接，并进一步形成纤维软骨带，呈现新骨组织包绕腱组织并向其中长入，但“潮线”结构不明显；软骨细胞增生，分泌细胞外基质并逐渐钙化，骨小梁周围有成骨细胞增生。B 组变化与 A 组相似，腱-骨之间也形成纤维连接带，但纤维软骨连接组织没有 A 组致密，软骨细胞增生和钙化较 A 组明显减少，也未形成“潮线”结构。
术后 16 周，A 组移植物和骨隧道未见明显分界，腱-骨界面之间形成连续的纤维软骨连接，腱-骨移行部分分化成熟，从韧带到骨组织出现韧带、纤维软骨、钙化软骨、骨组织，钙化组织和非钙化组织之间有“潮线”结构；软骨细胞增生明显并钙化。B 组移植物和骨隧道之间也形成纤维软骨连接，按应力方向排列，但骨组织和韧带组织分界尚清楚，“潮线”结构亦不明显。见图 3。
图3
各组术后组织学观察（HE×100）
从左至右分别为术后 4、8、16 周 a. A 组；b. B 组
Figure3. Histological observation of the two groups after operation (HE×100)From left to right for 4, 8, and 16 weeks after operation a. Group A; b. Group B
2.4 生物力学测试
术后 8 周，A、B 组分别有 4、6 例发生 ACL 止点断裂，止点断裂率分别为 33.3%、50.0%；最大抗拉强度分别为（43.42±4.15）、（38.35±4.39）N。术后 16 周，A、B 组分别有 1、3 例发生 ACL 止点断裂，止点断裂率分别为 8.3%、25.0%；最大抗拉强度分别为（74.30±7.62）、（65.94±5.77）N。术后 8、16 周 A、B 组止点断裂率比较，差异均无统计学意义（P=0.680；P=0.590）；而最大抗拉强度比较差异有统计学意义（t=18.503，P=0.001；t=25.391，P=0.001）。
3 讨论
重建术后 ACL 止点的良好转归有利于移植物发挥正常生理功能，移植物和骨隧道之间的转归过程是腱-骨界面宿主细胞生长、胶原纤维生成，而后由纤维细胞长入肌腱。张冉等[5]将肌腱周围组织包绕移植物后植入骨隧道，发现可以显著增加 VEGF 水平和血管生成，加速再血管化过程，进而促进 ACL 止点转归。有学者认为，ACL 残端中具有促进血管、神经修复的基因，因此保留残端重建 ACL 有利于上述相关基因的表达[6-7]，进而降低患者膝关节疼痛评分、促进膝关节活动度的恢复、提高关节功能评分，加速患者术后关节功能康复[8]。并且，Nguyen 等[9]研究认为保留韧带血管的网络纤维，可以进一步促进 ACL 止点转归。Kanamoto 等[10]在兔 ACL 重建过程中，发现血管生成速度和数量与术后关节功能恢复程度相关。同时，研究显示在术中保留髌下脂肪垫能够促进 ACL 移植物的再血管化过程[11]。本研究发现与 B 组相比，A 组重建韧带内血管增生较多，周围细胞增生并逐渐长入韧带组织，有较多增生的纤维软骨。说明 A 组移植物从肌腹直接提供的部分血供有利于移植物和骨隧道之间纤维组织填充、血管再生，而再生的血管又可以与移植物内血供连接，增加了腱-骨间血供，为成纤维细胞再生、胶原纤维分泌、软骨细胞再生以及软骨细胞钙化奠定基础。
移植物在骨隧道内的血管化受诸多因素影响，如骨隧道直径、骨隧道位置、移植物固定是否牢固、移植物在骨隧道内的长度、移植物来源、移植物血供等[12-13]，而再血管化是重建韧带成功的重要因素。纪庆明等[14]研究表明，临床 ACL 重建时将自体富血小板血浆植入骨隧道中，可以明显促进止点再血管化。郝滋辰等[15]研究认为相对于 BMSCs，ACL 来源的 MSCs 可以明显促进移植物在骨隧道内的早期血管化。重建韧带的肌腱由于游离后很容易失去血供，其血循环重建需要较长时间才能完成。术后重建 ACL 血供来源于手术创伤刺激引起的炎症介质以及各种生长因子的释放，同时髌下脂肪垫中的毛细血管增生并向移植物表面包裹[16]。本课题组前期以兔为实验模型，将 TGF-β1、bFGF 植入移植物骨隧道中，术后发现韧带内的血管增生明显，而细胞坏死、胶原崩解减少。然而这些方法均为血管再生，并不是来源于移植物本身的血供[17]。本研究 A 组是用近端与肌腹相连的腓骨长肌腱移植重建 ACL，充分利用肌腹血供，实验结果显示 A 组 ACL 止点愈合快于 B 组，止点较早形成成熟的纤维软骨连接，说明从肌腹进入肌腱的血供对移植后的腱-骨愈合有直接促进作用，使腱-骨之间血供更丰富，有利于成纤维细胞增生并分泌胶原纤维，更有利于软骨细胞增生和钙化。
移植物的良好转归对韧带的生物力学改善起到重要作用，一般认为肌腱移植重建 ACL 后都要经历变性坏死、重新血管化、细胞增殖和重新塑形过程，在此过程中移植物生物力学性能会下降[18]。之后，随着时间延长，移植物止点愈合逐渐成熟，最大抗拉强度等力学性能逐渐改善[19-20]。本实验结果显示两组止点断裂率无明显差异，但 A 组最大抗拉强度明显大于 B 组，说明 A 组肌腱组织由于有来自肌腹的血供，移植后早期变性坏死不明显，肌腱抗拉强度较 B 组大。组织学观察结果也进一步验证了生物力学测试结果。8 周时 A 组 ACL 止点愈合较 B 组好，已经形成致密纤维软骨连接，而 B 组软骨钙化明显少于 A 组，所形成的纤维软骨连接亦不明显，8 周时的止点断裂率较高。因此，肌腹直接血供可以明显减少移植物变性坏死，对力学性能的改善起到积极作用。
目前认为韧带或者肌腱止点根据其结构不同可分为直接止点和间接止点，直接止点有典型的 4 层结构，从韧带到骨组织依次是纤维组织、纤维软骨、钙化软骨和骨，纤维软骨和钙化软骨之间有“潮线”结构。间接止点根据结构不同又分为两种亚型：骨膜型间接止点和骨型间接止点，前者是纤维组织间接通过骨膜连于骨，后者则直接连于骨，一般认为间接止点是在肌腱与骨组织之间形成穿透性的胶原纤维连接，即 Sharpey 纤维，Sharpey 纤维是将肌腱、韧带或骨膜锚定在骨上的纤维结构[21]。以 Sharpey 纤维为止点的愈合成为间接愈合，而以纤维软骨为止点的愈合则认为是直接愈合。关于腱-骨愈合的组织学转归，相关研究结果不一致，主要与学者们对间接止点和直接止点的界定标准不同有关，另外观察部位也会影响组织学结果。本研究发现，4 周时 A 组腱-骨之间相对 B 组有较多肉芽组织填充、血管增生、成纤维细胞增生，并分泌胶原纤维，软骨细胞增生，此时的腱-骨连接主要是肉芽组织和胶原纤维，亦可认为是间接止点；8 周时 A 组胶原纤维进一步增多，软骨细胞增生，钙化增多，腱-骨之间形成纤维软骨连接；16 周时此连接更加紧密，钙化区和非钙化区形成“潮线”结构，4 层结构逐渐明显，此时肌腱和骨隧道之间形成成熟的纤维软骨连接，亦可认为是直接止点。上述结果提示移植物肌腹血供有利于移植韧带直接止点的形成。此外，腓骨长肌腱切取时保留肌腹的同时保留了部分腓浅神经，对肌腱具有神经营养作用，膝关节的稳定和功能维持离不开正常的本体感觉，保留肌腹的血供更有利于移植物以及周围滑膜神经的恢复[22]。
综上述，带肌腹血供的腓骨长肌腱移植重建对 ACL 止点转归具有明显促进作用，进而提高重建效果，同时也进一步说明了移植物血供是影响 ACL 移植重建后止点转归的重要因素。在保证血供条件下如何有效固定移植物止点，以及血供促进止点转归的基因表达机制，尚需进一步探讨。
作者贡献：刘泉、周建生、吴敏、张培负责科研课题设计；张培、樊宗庆、项平负责实验实施及文章撰写；朱坤负责数据收集、整理。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经蚌埠医学院动物伦理委员会批准（伦动批字［2016］第 032 号）。实验过程中对动物处置严格遵守国家科学技术部 2006 年《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。实验动物使用许可证号：SYXK（皖）2016-006。
