引用本文： 张昭远, 卫愉轩, 张长青, 袁霆. 应用不同离心条件优化富白细胞富血小板血浆制作方案研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(8): 1025-1030. doi: 10.7507/1002-1892.201911054 复制
富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是一种通过离心自体外周血获得的血小板浓缩物[1]。研究已证实 PRP 激活后，血小板中的 α 颗粒可释放 PDGF、VEGF、TGF-β、IGF 和 EGF 等多种生长因子[2-3]。PRP 具有促进组织修复的作用，且来源于自体，具有无排斥反应和来源便捷等优势，临床上已广泛用于骨不连、慢性肌腱损伤、慢性创面、关节内软骨损伤和骨关节炎等多种疾病的治疗[4-7]。
目前，临床上使用的 PRP 制备套装主要采用两次离心法和一次离心法。袁霆等[8]对 Anitua 法[2]（一次离心，160×g、6 min）、Petrungaro 法[9]（两次离心，1 500×g、6 min，1 000×g、6 min）、Landesberg 法[10]（两次离心，200×g、10 min，200×g、10 min）和 Aghaloo 法[11]（两次离心，215×g、10 min，863×g、10 min）4 种 PRP 制备方法进行了比较。结果显示，两次离心法的血小板回收率高于一次离心法，并且 Petrungaro 法的血小板回收率较 Landesberg 法、Aghaloo 法低，存在统计学差异。目前关于 PRP 制作原理的文献中，对最佳离心参数的描述差异较大，第 1 次离心力（200～1 100）×g，第 2 次离心力（200～2 330）×g，离心时间差异也较大，但血小板回收率均超过 46.9%[12-16]。此外，研究者认为，离心力（g）与离心时间（min）的乘积超过 11 000 g·min 将造成血小板大量破坏、生长因子流失[17-18]。
国内临床上目前较常用的 PRP 套装（山东威高集团医用高分子制品股份有限公司）也是采用两次离心法[19]（1 360×g、10 min，1 360×g、10 min），制备所得的 PRP 为富白细胞 PRP（leukocytes-rich PRP，L-PRP）。然而，临床实践中我们观察到，该方法制备的 L-PRP 实际测得的血小板回收率波动性较大，存在一定推广局限性。根据上海交通大学附属第六人民医院骨伤愈合 PRP 合作中心的 PRP 制备经验，该方法导致血小板回收率波动性较大的原因可能是，第 1 次离心后血小板与白细胞聚集的白膜层非常薄，在移除红细胞层的过程中容易误将白膜层一起移除，造成血小板富集系数与血小板回收率降低。因此，该方法要求操作者具有更高的精细化操作能力和容错率，不利于临床进一步推广，同时也导致不同制备者的成品 L-PRP 质量（血小板回收率和富集系数）和效果可能存在参差不齐的现象。鉴于此，我们拟进一步优化 L-PRP 离心方案，以提高 L-PRP 的可推广性。
1 材料与方法
1.1 实验对象选择标准
取 76 例成年健康志愿者的外周血 45.0 mL/例。男 35 例，女 41 例；年龄 18～70 岁，平均 45.4 岁。志愿者纳入标准：① 符合《中华人民共和国献血法》和中华人民共和国卫生部颁布的《献血体格检查标准》，血红蛋白：男性≥120 g/L，女性≥110 g/L；血小板计数≥100×109/L［正常值（100～300）×109/L］。② 采血前 7 d 内未服用影响血小板功能和凝血系统的药物。③ 无传染性疾病、相关血液疾病、恶性肿瘤、严重心脑血管疾病及感染等。
1.2 主要试剂与仪器
输血用枸橼酸钠注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；一次性使用采血针（浙江康德莱医疗器械股份有限公司，0.8×28TW 或 1.2×28TW）；PRP 制备套装、离心机、WG-YLJ-1 全自动血液分析仪（山东威高集团医用高分子制品股份有限公司）。
1.3 L-PRP 制备方法
方法：① 用预先装有 5.0 mL 枸橼酸钠注射液的 50 mL 注射器于志愿者的肘正中静脉或大隐静脉处采血 45.0 mL，注意边采血边摇匀，摇匀后共计 50.0 mL 血样。② 将血样注入 PRP 制备套装的 60 mL 无菌离心管中，取 200 μL 血液进行血常规分析。③ 剩余血样通过两次离心法制备 PRP 5.0 mL，操作过程中严格遵循无菌原则。根据两次离心法参数不同将所有血样分为 3 组：实验组 A（12 例，400×g、10 min，1 100×g、10 min）、实验组 B（27 例，800×g、10 min，1 100×g、10 min）及对照组（37 例，1 360×g、10 min，1 360×g、10 min）。④ 第 1 次离心后，全血分为 3 层，上层为上清液，中层为白膜层，下层为红细胞层。用注射器从离心管中心孔抽出红细胞层（保留约 1 mL 下层顶部的红细胞），弃去红细胞，剩余血样进行第 2 次离心；第 2 次离心后，血样也分为 3 层，上层为上清液，中层为白膜层，下层为红细胞层。用注射器连接无菌移液管，从离心管侧孔贴壁抽出上清液，保留下层共计 5.0 mL 分层血样，摇匀，即 L-PRP 5.0 mL。取 200 μL L-PRP 进行血常规分析。
1.4 观测指标
计算并比较各组血小板富集系数和回收率、白细胞富集系数。公式：血小板富集系数=L-PRP 中血小板浓度/全血中血小板浓度；血小板回收率=（L-PRP 体积×L-PRP 中血小板浓度）/（全血体积×全血中血小板浓度）×100%；白细胞富集系数=L-PRP 中白细胞浓度/全血中白细胞浓度。
1.5 统计学方法
采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；若数据不符合正态分布或方差齐性，组间比较采用 Kruskal-Wallis 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
76 例志愿者中，14 例血样的血小板回收率>100%，其中实验组 A 2 例，实验组 B 4 例，对照组 8 例；7 例血样的 L-PRP 在第 2 次离心后，出现透明斑块（血小板激活、聚集）导致血小板计数低于相应血样的全血血小板计数，其中实验组 B 2 例，对照组 5 例。将上述异常血样剔除后剩余 55 例，其中实验组 A 10 例，实验组 B 21 例，对照组 24 例。实验组 B 血小板富集系数和血小板回收率显著高于实验组 A 及对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组 A 和对照组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。实验组 A、B 和对照组的白细胞富集系数差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
各组 L-PRP 的血小板回收率及血小板和白细胞富集系数比较（
）
Table1.
Comparison of platelet recovery rate and platelet and leukocyte enrichment coefficient of L-PRP in each group (
)
3 讨论
PRP 是含有数倍于血小板生理浓度的血小板浓缩物，通常认为，PRP 中的血小板计数达到全血 3～6 倍以上才能达到有效的治疗浓度[20]。本研究中，各组制备的 L-PRP 血小板浓度均在全血的 6 倍以上。在剔除异常血样后，只有 2 个血样制备的 L-PRP 血小板浓度未达全血的 3 倍，其中实验组 A 和对照组各 1 例；而实验组 B 中所有 L-PRP 的血小板浓度均在全血的 5 倍以上。无论采用上述哪种离心条件，均可制备出满足临床要求、合格的 PRP。因此我们认为，除了离心力及离心时间，可能还有其他重要因素影响 L-PRP 的制备质量、稳定性和推广性。
3.1 全血离心后血小板与白细胞的分布情况
离心条件设置是影响 PRP 制备质量的重要因素。全血一次离心后分为 3 层，即上清液、白膜层和红细胞层。Piao 等[21]认为，血液离心后，红细胞在离心管中的分布将呈现上清液（α=0）、延迟沉降区（0<α≤αmax）和填充层（α=αmax），其中 α 为红细胞的浓度，且随着离心力增大或离心时间增加，延迟沉降区的红细胞将完全沉降至填充层。本研究的预实验中，我们对第 1 次离心后红细胞层与第 2 次离心后上清液进行分层采样，即根据深度将红细胞层和上清液自上而下分为四等分，在四等分点采集血样，并对白膜层进行取样分析。我们观察到，第一次离心后的细胞层各深度的血小板与白细胞计数基本相似，且远低于全血血小板及白细胞计数，并且第 2 次离心（1 100×g、10 min）后的上清液中仅含有极少量细胞成分，白膜层的血小板计数比全血基线浓度高 20～40 倍以上，白细胞计数也远高于其余各层。即两次离心后，血小板和白细胞的浓度在分层血样中并非呈现随深度递增的梯度分布。据此，我们推测，在填充层中，当红细胞浓度达到最大时，血小板与白细胞将因空间被挤压而离开填充层，并与因离心而沉降的血小板及白细胞聚集，形成白膜层（图 1）；在白膜层中，血小板和白细胞浓度最高，向上（上清层）或向下（红细胞层）血小板浓度急剧降低，且在不同深度血小板的浓度较为相近。因此，我们认为，在避免抽吸到白膜层的前提下，可确保血小板及白细胞的回收率和富集系数，并通过改变最终 L-PRP 的体积（即减少上清和红细胞层）来提高 L-PRP 中血小板的富集系数。
图1
当填充层中红细胞浓度达最大后，白细胞将因空间被挤压而离开填充层
红色圆形示红细胞，白色圆形示白细胞及血小板，F 示离心力及其方向
Figure1. When the concentration of erythrocytes in the filling layer reaches the maximum, the leukocytes will be crushed out of the filling layerRed circles represented erythrocytes, white circles represented leukocytes and platelets, and F represented the centrifugal force and its direction
3.2 影响 PRP 成品质量的重要因素
在 Piao 等[21]建立的 PRP 中血小板和白细胞的回收率预测模型中，全血体积和离心时间固定时，血小板与白细胞的回收率将随离心力的增加而增加，并逐渐达到峰值；此后，随着离心力逐渐增大，血小板与白细胞的回收率将趋于稳定，并逐渐下降（全血的体积越大，下降趋势越不明显）；并且在一定离心力区间内，血小板回收率与第 1 次离心上清获取率成正相关。本研究预实验观察到，小离心力组［（400～600）×g］第 1 次离心后血液分层效果不满意（离心后上清液体积<40%）的情况较多，按照上述 PRP 制备操作步骤易出现低浓度的血小板。其原因可能是过小的离心力无法使血液有效分层，不能有效地使血小板从上清液中沉降至白膜层，或较多血小板混杂在红细胞层，进而导致 PRP 制备质量不理想。超过一定离心力和离心时间后，PRP 中血小板回收率开始逐渐下降，这种回收率下降的趋势可能与过大的离心力造成血小板与白细胞破坏有关[17-18]。此外，L-PRP 制备过程的手工操作也非常重要。在血液样本第 1 次离心后移除红细胞层时，注射器应缓慢抽吸，避免抽吸过猛而抽出过多的白膜层；第 2 次离心后，移液管口应时刻紧贴离心管内壁，贴近液面（图 2），从上至下缓慢抽吸。整个操作过程须严格遵守无菌原则。
图2
血液离心后移除红细胞和上清液时，移液管口应时刻 紧贴液面
Figure2.
The mouth of pipette should touch the liquid surface close at all times, when erythrocytes and supernatant were removed after centrifugation
3.3 离心条件设定
结合临床实践及调查研究后，我们观察到根据对照组方案制备的 L-PRP 血小板回收率波动性较大，并且制备的 L-PRP 质量对操作者技术的依赖性较强。可能原因是两次离心后白膜层较薄，在移除红细胞和上清液的过程中容易误将白膜层一起移除，因而造成血小板富集系数与血小板回收率降低。为了提高 L-PRP 制备的可操作性、稳定性和制备的容错率，我们根据全血离心后血小板与白细胞的分布情况进行分析，下调了第 1 次离心的离心力；同时，为了更好地减少离心对血小板形态和功能的损害，也下调了第 2 次离心的离心力。实验中我们发现，2 个实验组的白膜层均较对照组厚，更易被操作者观察到，在移除红细胞和上清液过程中，可更好地避免误吸白膜层。既往 Yin 等[16]将 35 mL 血样（包含 3 mL 枸橼酸钠抗凝剂）按离心力 400×g、离心时间 10 min 离心 2 次，制备的 PRP 中血小板富集系数为 5.18±0.59，血小板回收率为 57.87%±6.45%。袁霆等[8]有关 PRP 制备原理的研究发现，Petrungaro 法、Landesberg 法和 Aghaloo 法的血小板回收率高于 Anitua 法，并且 Landesberg 法和 Aghaloo 法的效果最佳，两者的血小板回收率均可达 85% 以上。本研究中，实验组 B 的每一个 L-PRP 样本血小板计数均>5 倍，并且实验组 B 与实验组 A 及对照组的血小板富集系数比较差异有统计学意义，说明实验组 B 的离心参数设置使血小板富集效果更佳。实验组 A、B 与对照组在白细胞富集系数上无统计学意义，可见第 1 次离心力的大小对白细胞富集效果不会产生明显影响。因此，根据实验组 B 离心方案制备的 L-PRP 血小板富集系数和回收率区间更为稳定，且白膜层较厚，容错率较高，便于临床推广。
3.4 影响 PRP 成品质量的其他因素
影响 PRP 成品质量（血小板富集系数和回收率）和准确性的其他因素还包括血样基线、异常白色斑块形成、红细胞破损、血小板激活、温度等。在制备 L-PRP 的过程中我们发现，若第 2 次离心前，保留的红细胞过少或不保留红细胞，离心后可出现白色斑块，PRP 摇匀后白色斑块不溶解（图 3）。当出现白色斑块时，PRP 中的血小板计数将明显下降，低于全血血小板浓度。我们推断，这种白色半透明凝胶状物质可能属于一种白色斑块，主要成分为血小板；由于离心力过大或离心时间过长等诱发血小板激活、聚集，形成白色斑块，因而影响血小板的浓度与功能[16, 22-23]。同时，我们发现当保留红细胞层较少或不保留时，白色斑块形成的例数较多。此外，在血液离心时，如果发生溶血，全血细胞测试仪可能会将红细胞的碎片误认为是血小板，从而导致计数错误，使血小板计数异常偏高。并且，在血常规分析前，未将血样摇匀也将影响血细胞测试仪计数的准确性。本研究中部分样本 PRP 的血小板回收率超过 100% 或远低于预期值均与上述原因有关。制备 PRP 时的环境温度和全血血样保存温度也是影响 PRP 质量的重要因素。Du 等[15]发现，相同体积的同源血样，在 4℃ 下 PRP 分层情况优于室温下以相同离心条件制备的 PRP（对照组），血小板富集系数和回收率均高于对照组。然而，Amable 等[12]认为温度对血小板富集系数和回收率不会产生影响。我们在制备 PRP 时发现，在相同离心条件下，相比于室温（18～25℃）保存，4℃ 保存的全血离心后更易出现难以分层的情况（图 4），进而导致提取困难，血小板回收率下降。因此，温度对 PRP 制备的影响仍然需要更多研究去探索。
图3
白色斑块
Figure3.
White plaque
图4
温度对全血离心后分层的影响
a. 室温（18～25℃）下，以 800×g 离心 10 min 即可得到满意分层；b. 4℃ 时即使增加离心力至 1 100×g 离心 10 min 也难以获得理想分层
Figure4. The effect of temperature on the stratification of whole blood after centrifugationa. Centrifugation with 800×g for 10 minutes can obtain satisfactory stratification at room temperature (18-25℃); b. Even if the centrifugal force is increased to 1 100×g for 10 minutes, it is difficult to obtain ideal stratification at 4℃
综上述，PPR 质量受多种因素影响，包括离心力、离心时间、温度和操作过程等。通过本研究我们认为，两次离心法（800×g、10 min，1 100×g、10 min）是一种较为理想且可行的离心方法，可以获得满意的血小板回收率和富集系数，且两次离心后白膜层较厚，可降低对操作者的精细化要求，具有较高的容错率及可推广性。
作者贡献：张昭远参与实验设计与实施、数据收集整理及统计分析、文章撰写；卫愉轩参与实验设计与实施、数据收集整理及统计分析；袁霆参与实验设计与实施；张长青、袁霆对实验方案和文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经上海市第六人民医院伦理委员会批准（2019-010）。
富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）是一种通过离心自体外周血获得的血小板浓缩物[1]。研究已证实 PRP 激活后，血小板中的 α 颗粒可释放 PDGF、VEGF、TGF-β、IGF 和 EGF 等多种生长因子[2-3]。PRP 具有促进组织修复的作用，且来源于自体，具有无排斥反应和来源便捷等优势，临床上已广泛用于骨不连、慢性肌腱损伤、慢性创面、关节内软骨损伤和骨关节炎等多种疾病的治疗[4-7]。
目前，临床上使用的 PRP 制备套装主要采用两次离心法和一次离心法。袁霆等[8]对 Anitua 法[2]（一次离心，160×g、6 min）、Petrungaro 法[9]（两次离心，1 500×g、6 min，1 000×g、6 min）、Landesberg 法[10]（两次离心，200×g、10 min，200×g、10 min）和 Aghaloo 法[11]（两次离心，215×g、10 min，863×g、10 min）4 种 PRP 制备方法进行了比较。结果显示，两次离心法的血小板回收率高于一次离心法，并且 Petrungaro 法的血小板回收率较 Landesberg 法、Aghaloo 法低，存在统计学差异。目前关于 PRP 制作原理的文献中，对最佳离心参数的描述差异较大，第 1 次离心力（200～1 100）×g，第 2 次离心力（200～2 330）×g，离心时间差异也较大，但血小板回收率均超过 46.9%[12-16]。此外，研究者认为，离心力（g）与离心时间（min）的乘积超过 11 000 g·min 将造成血小板大量破坏、生长因子流失[17-18]。
国内临床上目前较常用的 PRP 套装（山东威高集团医用高分子制品股份有限公司）也是采用两次离心法[19]（1 360×g、10 min，1 360×g、10 min），制备所得的 PRP 为富白细胞 PRP（leukocytes-rich PRP，L-PRP）。然而，临床实践中我们观察到，该方法制备的 L-PRP 实际测得的血小板回收率波动性较大，存在一定推广局限性。根据上海交通大学附属第六人民医院骨伤愈合 PRP 合作中心的 PRP 制备经验，该方法导致血小板回收率波动性较大的原因可能是，第 1 次离心后血小板与白细胞聚集的白膜层非常薄，在移除红细胞层的过程中容易误将白膜层一起移除，造成血小板富集系数与血小板回收率降低。因此，该方法要求操作者具有更高的精细化操作能力和容错率，不利于临床进一步推广，同时也导致不同制备者的成品 L-PRP 质量（血小板回收率和富集系数）和效果可能存在参差不齐的现象。鉴于此，我们拟进一步优化 L-PRP 离心方案，以提高 L-PRP 的可推广性。
1 材料与方法
1.1 实验对象选择标准
取 76 例成年健康志愿者的外周血 45.0 mL/例。男 35 例，女 41 例；年龄 18～70 岁，平均 45.4 岁。志愿者纳入标准：① 符合《中华人民共和国献血法》和中华人民共和国卫生部颁布的《献血体格检查标准》，血红蛋白：男性≥120 g/L，女性≥110 g/L；血小板计数≥100×109/L［正常值（100～300）×109/L］。② 采血前 7 d 内未服用影响血小板功能和凝血系统的药物。③ 无传染性疾病、相关血液疾病、恶性肿瘤、严重心脑血管疾病及感染等。
1.2 主要试剂与仪器
输血用枸橼酸钠注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；一次性使用采血针（浙江康德莱医疗器械股份有限公司，0.8×28TW 或 1.2×28TW）；PRP 制备套装、离心机、WG-YLJ-1 全自动血液分析仪（山东威高集团医用高分子制品股份有限公司）。
1.3 L-PRP 制备方法
方法：① 用预先装有 5.0 mL 枸橼酸钠注射液的 50 mL 注射器于志愿者的肘正中静脉或大隐静脉处采血 45.0 mL，注意边采血边摇匀，摇匀后共计 50.0 mL 血样。② 将血样注入 PRP 制备套装的 60 mL 无菌离心管中，取 200 μL 血液进行血常规分析。③ 剩余血样通过两次离心法制备 PRP 5.0 mL，操作过程中严格遵循无菌原则。根据两次离心法参数不同将所有血样分为 3 组：实验组 A（12 例，400×g、10 min，1 100×g、10 min）、实验组 B（27 例，800×g、10 min，1 100×g、10 min）及对照组（37 例，1 360×g、10 min，1 360×g、10 min）。④ 第 1 次离心后，全血分为 3 层，上层为上清液，中层为白膜层，下层为红细胞层。用注射器从离心管中心孔抽出红细胞层（保留约 1 mL 下层顶部的红细胞），弃去红细胞，剩余血样进行第 2 次离心；第 2 次离心后，血样也分为 3 层，上层为上清液，中层为白膜层，下层为红细胞层。用注射器连接无菌移液管，从离心管侧孔贴壁抽出上清液，保留下层共计 5.0 mL 分层血样，摇匀，即 L-PRP 5.0 mL。取 200 μL L-PRP 进行血常规分析。
1.4 观测指标
计算并比较各组血小板富集系数和回收率、白细胞富集系数。公式：血小板富集系数=L-PRP 中血小板浓度/全血中血小板浓度；血小板回收率=（L-PRP 体积×L-PRP 中血小板浓度）/（全血体积×全血中血小板浓度）×100%；白细胞富集系数=L-PRP 中白细胞浓度/全血中白细胞浓度。
1.5 统计学方法
采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；若数据不符合正态分布或方差齐性，组间比较采用 Kruskal-Wallis 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
76 例志愿者中，14 例血样的血小板回收率>100%，其中实验组 A 2 例，实验组 B 4 例，对照组 8 例；7 例血样的 L-PRP 在第 2 次离心后，出现透明斑块（血小板激活、聚集）导致血小板计数低于相应血样的全血血小板计数，其中实验组 B 2 例，对照组 5 例。将上述异常血样剔除后剩余 55 例，其中实验组 A 10 例，实验组 B 21 例，对照组 24 例。实验组 B 血小板富集系数和血小板回收率显著高于实验组 A 及对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；实验组 A 和对照组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。实验组 A、B 和对照组的白细胞富集系数差异无统计学意义（P>0.05）。见表 1。
表1
各组 L-PRP 的血小板回收率及血小板和白细胞富集系数比较（）
Table1.
Comparison of platelet recovery rate and platelet and leukocyte enrichment coefficient of L-PRP in each group ()
3 讨论
PRP 是含有数倍于血小板生理浓度的血小板浓缩物，通常认为，PRP 中的血小板计数达到全血 3～6 倍以上才能达到有效的治疗浓度[20]。本研究中，各组制备的 L-PRP 血小板浓度均在全血的 6 倍以上。在剔除异常血样后，只有 2 个血样制备的 L-PRP 血小板浓度未达全血的 3 倍，其中实验组 A 和对照组各 1 例；而实验组 B 中所有 L-PRP 的血小板浓度均在全血的 5 倍以上。无论采用上述哪种离心条件，均可制备出满足临床要求、合格的 PRP。因此我们认为，除了离心力及离心时间，可能还有其他重要因素影响 L-PRP 的制备质量、稳定性和推广性。
3.1 全血离心后血小板与白细胞的分布情况
离心条件设置是影响 PRP 制备质量的重要因素。全血一次离心后分为 3 层，即上清液、白膜层和红细胞层。Piao 等[21]认为，血液离心后，红细胞在离心管中的分布将呈现上清液（α=0）、延迟沉降区（0<α≤αmax）和填充层（α=αmax），其中 α 为红细胞的浓度，且随着离心力增大或离心时间增加，延迟沉降区的红细胞将完全沉降至填充层。本研究的预实验中，我们对第 1 次离心后红细胞层与第 2 次离心后上清液进行分层采样，即根据深度将红细胞层和上清液自上而下分为四等分，在四等分点采集血样，并对白膜层进行取样分析。我们观察到，第一次离心后的细胞层各深度的血小板与白细胞计数基本相似，且远低于全血血小板及白细胞计数，并且第 2 次离心（1 100×g、10 min）后的上清液中仅含有极少量细胞成分，白膜层的血小板计数比全血基线浓度高 20～40 倍以上，白细胞计数也远高于其余各层。即两次离心后，血小板和白细胞的浓度在分层血样中并非呈现随深度递增的梯度分布。据此，我们推测，在填充层中，当红细胞浓度达到最大时，血小板与白细胞将因空间被挤压而离开填充层，并与因离心而沉降的血小板及白细胞聚集，形成白膜层（图 1）；在白膜层中，血小板和白细胞浓度最高，向上（上清层）或向下（红细胞层）血小板浓度急剧降低，且在不同深度血小板的浓度较为相近。因此，我们认为，在避免抽吸到白膜层的前提下，可确保血小板及白细胞的回收率和富集系数，并通过改变最终 L-PRP 的体积（即减少上清和红细胞层）来提高 L-PRP 中血小板的富集系数。
图1
当填充层中红细胞浓度达最大后，白细胞将因空间被挤压而离开填充层
红色圆形示红细胞，白色圆形示白细胞及血小板，F 示离心力及其方向
Figure1. When the concentration of erythrocytes in the filling layer reaches the maximum, the leukocytes will be crushed out of the filling layerRed circles represented erythrocytes, white circles represented leukocytes and platelets, and F represented the centrifugal force and its direction
3.2 影响 PRP 成品质量的重要因素
在 Piao 等[21]建立的 PRP 中血小板和白细胞的回收率预测模型中，全血体积和离心时间固定时，血小板与白细胞的回收率将随离心力的增加而增加，并逐渐达到峰值；此后，随着离心力逐渐增大，血小板与白细胞的回收率将趋于稳定，并逐渐下降（全血的体积越大，下降趋势越不明显）；并且在一定离心力区间内，血小板回收率与第 1 次离心上清获取率成正相关。本研究预实验观察到，小离心力组［（400～600）×g］第 1 次离心后血液分层效果不满意（离心后上清液体积<40%）的情况较多，按照上述 PRP 制备操作步骤易出现低浓度的血小板。其原因可能是过小的离心力无法使血液有效分层，不能有效地使血小板从上清液中沉降至白膜层，或较多血小板混杂在红细胞层，进而导致 PRP 制备质量不理想。超过一定离心力和离心时间后，PRP 中血小板回收率开始逐渐下降，这种回收率下降的趋势可能与过大的离心力造成血小板与白细胞破坏有关[17-18]。此外，L-PRP 制备过程的手工操作也非常重要。在血液样本第 1 次离心后移除红细胞层时，注射器应缓慢抽吸，避免抽吸过猛而抽出过多的白膜层；第 2 次离心后，移液管口应时刻紧贴离心管内壁，贴近液面（图 2），从上至下缓慢抽吸。整个操作过程须严格遵守无菌原则。
图2
血液离心后移除红细胞和上清液时，移液管口应时刻 紧贴液面
Figure2.
The mouth of pipette should touch the liquid surface close at all times, when erythrocytes and supernatant were removed after centrifugation
3.3 离心条件设定
结合临床实践及调查研究后，我们观察到根据对照组方案制备的 L-PRP 血小板回收率波动性较大，并且制备的 L-PRP 质量对操作者技术的依赖性较强。可能原因是两次离心后白膜层较薄，在移除红细胞和上清液的过程中容易误将白膜层一起移除，因而造成血小板富集系数与血小板回收率降低。为了提高 L-PRP 制备的可操作性、稳定性和制备的容错率，我们根据全血离心后血小板与白细胞的分布情况进行分析，下调了第 1 次离心的离心力；同时，为了更好地减少离心对血小板形态和功能的损害，也下调了第 2 次离心的离心力。实验中我们发现，2 个实验组的白膜层均较对照组厚，更易被操作者观察到，在移除红细胞和上清液过程中，可更好地避免误吸白膜层。既往 Yin 等[16]将 35 mL 血样（包含 3 mL 枸橼酸钠抗凝剂）按离心力 400×g、离心时间 10 min 离心 2 次，制备的 PRP 中血小板富集系数为 5.18±0.59，血小板回收率为 57.87%±6.45%。袁霆等[8]有关 PRP 制备原理的研究发现，Petrungaro 法、Landesberg 法和 Aghaloo 法的血小板回收率高于 Anitua 法，并且 Landesberg 法和 Aghaloo 法的效果最佳，两者的血小板回收率均可达 85% 以上。本研究中，实验组 B 的每一个 L-PRP 样本血小板计数均>5 倍，并且实验组 B 与实验组 A 及对照组的血小板富集系数比较差异有统计学意义，说明实验组 B 的离心参数设置使血小板富集效果更佳。实验组 A、B 与对照组在白细胞富集系数上无统计学意义，可见第 1 次离心力的大小对白细胞富集效果不会产生明显影响。因此，根据实验组 B 离心方案制备的 L-PRP 血小板富集系数和回收率区间更为稳定，且白膜层较厚，容错率较高，便于临床推广。
3.4 影响 PRP 成品质量的其他因素
影响 PRP 成品质量（血小板富集系数和回收率）和准确性的其他因素还包括血样基线、异常白色斑块形成、红细胞破损、血小板激活、温度等。在制备 L-PRP 的过程中我们发现，若第 2 次离心前，保留的红细胞过少或不保留红细胞，离心后可出现白色斑块，PRP 摇匀后白色斑块不溶解（图 3）。当出现白色斑块时，PRP 中的血小板计数将明显下降，低于全血血小板浓度。我们推断，这种白色半透明凝胶状物质可能属于一种白色斑块，主要成分为血小板；由于离心力过大或离心时间过长等诱发血小板激活、聚集，形成白色斑块，因而影响血小板的浓度与功能[16, 22-23]。同时，我们发现当保留红细胞层较少或不保留时，白色斑块形成的例数较多。此外，在血液离心时，如果发生溶血，全血细胞测试仪可能会将红细胞的碎片误认为是血小板，从而导致计数错误，使血小板计数异常偏高。并且，在血常规分析前，未将血样摇匀也将影响血细胞测试仪计数的准确性。本研究中部分样本 PRP 的血小板回收率超过 100% 或远低于预期值均与上述原因有关。制备 PRP 时的环境温度和全血血样保存温度也是影响 PRP 质量的重要因素。Du 等[15]发现，相同体积的同源血样，在 4℃ 下 PRP 分层情况优于室温下以相同离心条件制备的 PRP（对照组），血小板富集系数和回收率均高于对照组。然而，Amable 等[12]认为温度对血小板富集系数和回收率不会产生影响。我们在制备 PRP 时发现，在相同离心条件下，相比于室温（18～25℃）保存，4℃ 保存的全血离心后更易出现难以分层的情况（图 4），进而导致提取困难，血小板回收率下降。因此，温度对 PRP 制备的影响仍然需要更多研究去探索。
图3
白色斑块
Figure3.
White plaque
图4
温度对全血离心后分层的影响
a. 室温（18～25℃）下，以 800×g 离心 10 min 即可得到满意分层；b. 4℃ 时即使增加离心力至 1 100×g 离心 10 min 也难以获得理想分层
Figure4. The effect of temperature on the stratification of whole blood after centrifugationa. Centrifugation with 800×g for 10 minutes can obtain satisfactory stratification at room temperature (18-25℃); b. Even if the centrifugal force is increased to 1 100×g for 10 minutes, it is difficult to obtain ideal stratification at 4℃
综上述，PPR 质量受多种因素影响，包括离心力、离心时间、温度和操作过程等。通过本研究我们认为，两次离心法（800×g、10 min，1 100×g、10 min）是一种较为理想且可行的离心方法，可以获得满意的血小板回收率和富集系数，且两次离心后白膜层较厚，可降低对操作者的精细化要求，具有较高的容错率及可推广性。
作者贡献：张昭远参与实验设计与实施、数据收集整理及统计分析、文章撰写；卫愉轩参与实验设计与实施、数据收集整理及统计分析；袁霆参与实验设计与实施；张长青、袁霆对实验方案和文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经上海市第六人民医院伦理委员会批准（2019-010）。
