引用本文： 戎梦瑶, 昌震, 欧佳伟, 赵松川, 曾文, 刘琦. 包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球制备及其相关性能研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(1): 102-108. doi: 10.7507/1002-1892.201905074 复制
周围神经损伤是临床常见的神经损伤类型，常导致患者出现感觉和运动功能障碍，严重影响患者生活质量。周围神经损伤后的再生能力有限，主要与神经元的内在生长能力以及再生微环境相关[1-2]。为了修复神经损伤，一个重要的治疗策略是在受损局部给予外源性神经营养因子[3-4]。神经营养因子主要包括 NGF、脑源性神经营养因子以及胶质细胞源性神经营养因子等[5-6]。NGF 不仅可以促进感觉神经元的存活，还可以促进神经损伤后的运动恢复[7-8]。然而，NGF 的生物半衰期短，易失去生物活性，不能长期有效地促进神经再生。因此，寻找一种安全有效的药物缓释载体至关重要。
近年来，微球类药物缓释载体受到学者的广泛关注。以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］制备的 PLGA 微球具有良好的生物相容性和低毒性等优点，在生物医学领域受到广泛应用[9]。然而，PLGA 微球具有高突释性能，不利于神经损伤后的再生[10]。为了克服 PLGA 微球的上述缺点，有学者应用高分子生物材料对 PLGA 微球表面进行包埋与修饰。壳聚糖是一种天然多聚物材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在医疗领域得到广泛应用[11]；有学者报道壳聚糖的降解产物可促进神经元的分化和轴突延长[12]。因此，应用壳聚糖材料包埋 PLGA 微球，具有降低 PLGA 微球高突释性能的潜力，但目前尚未见相关研究。
本研究制备了一种包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球，该微球具有双壁结构，壳聚糖为外壁，PLGA 微球为内壁。我们假设这种双壁微球可显著降低 PLGA 微球的高突释率，同时可保护 NGF 的生物活性，促进神经再生。为了验证这一假设是否成立，我们应用光镜、扫描电镜、激光共聚焦显微镜、红外光谱分析、降解率以及缓释性能等方法检测双壁微球的基本性能；此外，通过评估体外大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的生物活性，进一步验证双壁微球缓释的 NGF 是否具有生物活性。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
PC12 细胞（ATCC 公司，美国）。PLGA、壳聚糖、重组大鼠 NGF、三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate，TPP）、尼罗红及 FITC 荧光染料（Sigma 公司，美国）；NGF-ELISA 试剂盒（Promega 公司，美国）；液体石蜡油、石油醚及异丙醇等常用化学试剂（国药集团化学试剂有限公司）。激光共聚焦显微镜（Nikon 公司，日本）；S-4800 扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；激光粒径分析仪（Malvern 公司，英国）；红外光谱分析仪（Shimadzu 公司，日本）；超声细胞粉碎仪（Sonics 公司，美国）。
1.2 包埋 NGF 的 PLGA 微球及壳聚糖-PLGA 双壁微球制备
1.2.1 包埋 NGF 的 PLGA 微球
取 50 μg NGF 和 300 mg 牛血清白蛋白溶解于 50 μL PBS 溶液，200 mg PLGA 溶解于 10 mL 二氯甲烷溶液。将上述两种溶液混合后，使用超声细胞粉碎仪超声分散 3 次（2 mm 探针头、时间 20 s、40% 功率），得到初乳液；将初乳液加入由 Tween80 和水溶液混合的溶液中，继续使用超声细胞粉碎仪超声分散 3 次（2 mm 探针头、时间 20 s、40% 功率），得到终乳液；随后经过磁力搅拌 30 min、过滤、离心（离心半径 6 cm，10 000 r/min，10 min）、干燥，得到包埋 NGF 的 PLGA 微球。同法制备未包埋 NGF 的 PLGA 微球。
1.2.2 包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球
取 200 mg 壳聚糖与 200 mL 冰醋酸溶液混合溶解；将包埋 NGF 的 PLGA 微球与上述壳聚糖溶液混合均匀后，缓慢加入液体石蜡油中，机械搅拌 1 h；分别将浓度为 1%、3%、10%（W/V）的 TPP 溶液缓慢加入液体石蜡油中，充分交联微球 1 h；依次使用石油醚、异丙醇反复清洗后，得到包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球，冰冻干燥后备用。同法制备未包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球。
1.3 观测指标
1.3.1 包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球的基本特点
取 3%TPP 交联的包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球，用于检测双壁微球的基本特点。① 表面形态观察：取上述双壁微球分散于水溶液中，光镜下观察。另将上述双壁微球均匀分散于金属圆柱体上，喷金后真空干燥，扫描电镜下观察。② 内部形态观察：在制备双壁微球过程中，分别使用 FITC 和尼罗红染色壳聚糖和 PLGA 进行荧光标记，然后将其分散于水溶液中，激光共聚焦显微镜下观察 PLGA 微球在双壁微球内的分布情况。③ 微球粒径分析：将上述双壁微球均匀分散于水溶液中，采用粒径分析仪检测其粒径分布和粒径大小。④ 物理-化学特性评价：分别取壳聚糖、PLGA 及未包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球，压成薄片后，采用红外光谱分析仪分析其物理-化学特性。
1.3.2 体外微球降解率测定
分别将 10 mg 包埋 NGF 的 PLGA 微球和 1%、3%、10%TPP 交联的包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球（分别设为 A、B、C、D 组）溶解于 10 mL PBS 溶液（pH7.4）中，充分混合均匀并磁力搅拌（100 r/min）。分别于 0～12 周每周以离心半径 6 cm、10 000 r/min 离心 5 min，取出微球后真空干燥并称重。按以下公式计算微球降解率：（W0–W1/W0）×100%，其中 W0 表示微球的初始质量，W1 表示降解后的微球质量。实验重复 3 次，取均值。
1.3.3 体外微球中 NGF 缓释检测
分别将 10 mg 包埋 NGF 的 PLGA 微球和 1%、3%、10%TPP 交联的包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球（分别设为 A、B、C、D 组）溶解于 5 mL PBS 溶液（pH7.4）中，放置于恒温摇床上匀速摇动。分别于 0～12 周每周以离心半径 6 cm、10 000 r/min 离心 10 min，提取上清液，使用 NGF-ELISA 试剂盒测定 NGF 含量。按以下公式计算 NGF 的总缓释率：R1/R0×100%，其中 R0 表示最初包埋 NGF 总量，R1 表示缓释液中 NGF 实际含量。
1.3.4 体外微球缓释液中 NGF 的生物活性评估
取 PC12 细胞以 1×105个/孔密度接种于含 2 mL 细胞培养液（含 5%FBS、10% 马血清及 1% 青链霉素的 RPMI1640 培养液）的 24 孔培养板中培养。取未包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球以及 1%、3%、10%TPP 交联的包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球（分别设为 A1、B、C、D 组），同 1.3.3 方法，于 7、28、56、84 d 分别从缓释液中吸取 300 μL 上清液，加入上述 24 孔培养板内，放入 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养 3 d。随机选择 24 孔培养板内的 100 个 PC12 细胞计数，当细胞有 1 个或多个突起，且突起长度超过胞体长度则被认为是具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞。按以下公式计算具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞百分比：P1/P0×100%，其中 P0 表示最初随机选择的 100 个 PC12 细胞，P1 表示具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞数量。
1.4 统计学方法
采用 PRISM（GraphPad 软件）统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Student t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球的基本特点
① 表面形态观察：光镜和扫描电镜观察示，双壁微球呈球形结构，大小不等，分散较好，外表面相对粗糙，有很多小的球形凸起。见图 1。② 内部形态观察：激光共聚焦显微镜观察示，双壁微球的外壳为绿色（FITC 标记的壳聚糖），内核为红色（尼罗红标记的 PLGA 微球），PLGA 微球均匀分布于双壁微球内。见图 2。通过激光共聚焦显微镜结果，可以推出扫描电镜双壁微球外表面的凸起为 PLGA 微球，进一步说明该双壁微球制备成功。③ 微球粒径分析：双壁微球的粒径分布范围为 18.5～42.7 μm，平均 29.3 μm。见图 3。④ 物理-化学特性评价：红外光谱分析结果示，未包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球在 3 432 cm−1处的吸收峰增宽，为壳聚糖基质中的-NH2 基团拉伸振动所致，表明双壁微球在制备过程中保存了活性基团-NH2。与壳聚糖相比，双壁微球在 1 640 cm−1处的吸收峰移动至 1 632 cm−1处，说明壳聚糖的氨基与 TPP 中的磷酸基发生了静电反应。见图 4。
图1
包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球表面形态特点
a. 光镜观察（×10）；b. 扫描电镜观察（×50）
Figure1. Surface characteristics of NGF loaded chitosan-PLGA double-walled microspheresa. Light microscopy observation (×10); b. Scanning electron microscopy observation (×50)
图2
包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球内部形态（激光共聚焦显微镜×50）
a. 经 FITC 染色的壳聚糖微球；b. 经尼罗红染色的 PLGA 微球；c. 经 FITC 和尼罗红染色的包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球
Figure2. Inner characteristics of NGF loaded chitosan-PLGA double-walled microspheres (Confocal laser scanning microscopy×50)a. FITC-stained chitosan microspheres; b. Nile red-stained PLGA microspheres; c. NGF loaded chitosan-PLGA double-walled microspheres stained by FITC and Nile red
图3
包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球粒径分析
Figure3.
Size distribution of NGF loaded chitosan-PLGA double- walled microspheres
图4
壳聚糖、PLGA 及未包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微 球红外光谱分析
Figure4.
FT-IR spectra of chitosan, PLGA, and chitosan-PLGA double-walled microspheres
2.2 体外微球降解率测定
A 组：0～4 周微球降解速度逐渐增快，5～12 周降解速度较前减慢，12 周时微球降解率为 38.2%±2.8%。与 A 组相比，B、C、D 组双壁微球降解速度明显增快，并随着 TPP 浓度的增加而逐渐减慢，12 周时 B、C、D 组双壁微球的降解率分别达 62.3%±1.9%、53.0±2.8% 和 47.7%±2.1%。培养各时间点各组间微球降解率比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
各组微球的体外降解率比较
Figure5.
In vitro degradation ratio in each microspheres group
2.3 体外微球中 NGF 缓释检测
A 组 PLGA 微球缓释 NGF 存在“突释”现象，第 1 天 NGF 总缓释率高达 43.6%±1.8%，随后以相对较慢的速度缓释 NGF，84 d 时 NGF 的总缓释率达 81.2%±1.3%。与 A 组 PLGA 微球相比，B、C、D 组双壁微球以相对较慢的速度缓释 NGF，除 84 d 外，各时间点 B、C、D 组 NGF 总缓释率均显著低于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C、D 组 NGF 的缓释速度随 TPP 浓度增加而减慢，除 84 d 外，各时间点 B、C、D 组间比较 NGF 总缓释率差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6。
图6
各组微球的体外 NGF 缓释率比较
Figure6.
In vitro NGF sustained release ratio in each microspheres group
2.4 体外微球缓释液中 NGF 的生物活性评估
培养各时间点，B、C、D 组缓释液中具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞百分比均显著高于 A1 组，差异有统计学意义（P<0.05）。培养 7、28 d，B、C、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；56、84 d 时，C、D 组缓释液中具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞百分比显著高于 B 组，差异有统计学意义（P<0.05），C、D 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 7。
图7
各组微球缓释液中具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞 百分比比较
Figure7.
Percentage of PC12 cells with positive axonal elongation reaction in the sustained release solution in each microspheres group
3 讨论
周围神经的再生需要一个良好的再生微环境，其中神经营养因子发挥着至关重要的作用。神经营养因子可提供化学营养支持，激活受损神经元的再生活力，促进神经再生。然而，在神经损伤部位的内在神经营养因子不足，需要提供外源性神经营养支持。本研究结果显示，壳聚糖-PLGA 双壁微球可包埋并缓释具有生物活性的 NGF 达 84 d；此外，交联剂 TPP 浓度的增加可影响壳聚糖-PLGA 双壁微球的缓释性能和 NGF 的生物活性。
近年来，微球类缓释载体的迅速发展为临床应用奠定了良好基础。PLGA 微球是最受关注的一种微球缓释系统，在生物医学领域得到了广泛应用。然而，PLGA 微球具有突释性，在短时间内快速缓释包埋的蛋白药物，过量的蛋白药物不利于神经再生早期的负反馈调节作用，从而产生抑制神经再生的作用[13-15]。此外，PLGA 微球的酸性降解产物可破坏包埋蛋白药物的生物活性，降低蛋白药物的药学作用[16]。因此，寻找一种对 PLGA 微球改进的方法具有重要的临床意义。本研究选择壳聚糖修饰 PLGA 微球主要有以下两个原因：首先，壳聚糖是一种天然多聚物材料，具有良好的生物降解性和无毒性，广泛用于生物医药领域；其次，有学者报道壳聚糖的降解产物可促进轴突生长，加快神经再生[17-18]。然而，壳聚糖材料的机械强度较差，容易变形，需要交联剂交联以增强材料的强度。TPP 是一种物理离子交联剂，带负电荷，与带正电荷的壳聚糖通过物理反应交联。与化学交联剂相比，TPP 具有无毒性和良好的生物相容性[19-21]。本研究选用不同浓度的 TPP 物理交联双壁微球，旨在了解交联浓度对双壁微球性能的影响，以选择合适的交联浓度，为后续体内研究奠定良好基础。
体外缓释动力学结果表明，与 PLGA 微球相比，经不同 TPP 浓度交联的壳聚糖-PLGA 双壁微球的 NGF 缓释率均明显降低，以较慢的速度缓释 NGF。这可能是因为双壁微球的壳聚糖外壳和交联剂 TPP 使 NGF 从 PLGA 微球扩散至体外溶液的速度减慢，从而使 NGF 的缓释率降低。此外，TPP 浓度的增加可显著降低双壁微球的突释量，这可能是由于高浓度的 TPP 可以提高双壁微球的机械强度，降低双壁微球在溶液内的膨胀性，从而减慢 NGF 从双壁微球内部向外部扩散的速度，实现持续可控地缓释 NGF。体外微球缓释液中 NGF 的生物活性结果表明，壳聚糖-PLGA 双壁微球可有效保护 NGF 的生物活性，实现可控性缓释具有生物活性的 NGF。我们分析包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球促 PC12 细胞具有阳性轴突延长反应的可能原因有以下几点：首先，双壁微球作为一种良好的缓释载体，可有效保护 NGF 的生物活性免受降解或修饰，而失去生物活性；其次，TPP 浓度增加，可减慢 NGF 的缓释速度，实现长期有效的缓慢释放；最后，壳聚糖和其降解产物与包埋的 NGF 达到协同促进神经再生的作用。
综上述，壳聚糖-PLGA 双壁微球可有效保护 NGF 的生物活性，实现持续可控的缓释，为下一步将其用于体内研究，或与神经支架联合修复周围神经缺损奠定良好的实验基础。
作者贡献：戎梦瑶参与实验设计、微球制备、统计分析及文章撰写；昌震参与微球的相关性能检测和数据收集；欧佳伟、赵松川参与实验数据的统计分析；曾文参与实验数据分析、文章修改；刘琦参与实验设计、实验数据整理，文章的思路设计及修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
周围神经损伤是临床常见的神经损伤类型，常导致患者出现感觉和运动功能障碍，严重影响患者生活质量。周围神经损伤后的再生能力有限，主要与神经元的内在生长能力以及再生微环境相关[1-2]。为了修复神经损伤，一个重要的治疗策略是在受损局部给予外源性神经营养因子[3-4]。神经营养因子主要包括 NGF、脑源性神经营养因子以及胶质细胞源性神经营养因子等[5-6]。NGF 不仅可以促进感觉神经元的存活，还可以促进神经损伤后的运动恢复[7-8]。然而，NGF 的生物半衰期短，易失去生物活性，不能长期有效地促进神经再生。因此，寻找一种安全有效的药物缓释载体至关重要。
近年来，微球类药物缓释载体受到学者的广泛关注。以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］制备的 PLGA 微球具有良好的生物相容性和低毒性等优点，在生物医学领域受到广泛应用[9]。然而，PLGA 微球具有高突释性能，不利于神经损伤后的再生[10]。为了克服 PLGA 微球的上述缺点，有学者应用高分子生物材料对 PLGA 微球表面进行包埋与修饰。壳聚糖是一种天然多聚物材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在医疗领域得到广泛应用[11]；有学者报道壳聚糖的降解产物可促进神经元的分化和轴突延长[12]。因此，应用壳聚糖材料包埋 PLGA 微球，具有降低 PLGA 微球高突释性能的潜力，但目前尚未见相关研究。
本研究制备了一种包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球，该微球具有双壁结构，壳聚糖为外壁，PLGA 微球为内壁。我们假设这种双壁微球可显著降低 PLGA 微球的高突释率，同时可保护 NGF 的生物活性，促进神经再生。为了验证这一假设是否成立，我们应用光镜、扫描电镜、激光共聚焦显微镜、红外光谱分析、降解率以及缓释性能等方法检测双壁微球的基本性能；此外，通过评估体外大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的生物活性，进一步验证双壁微球缓释的 NGF 是否具有生物活性。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
PC12 细胞（ATCC 公司，美国）。PLGA、壳聚糖、重组大鼠 NGF、三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate，TPP）、尼罗红及 FITC 荧光染料（Sigma 公司，美国）；NGF-ELISA 试剂盒（Promega 公司，美国）；液体石蜡油、石油醚及异丙醇等常用化学试剂（国药集团化学试剂有限公司）。激光共聚焦显微镜（Nikon 公司，日本）；S-4800 扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；激光粒径分析仪（Malvern 公司，英国）；红外光谱分析仪（Shimadzu 公司，日本）；超声细胞粉碎仪（Sonics 公司，美国）。
1.2 包埋 NGF 的 PLGA 微球及壳聚糖-PLGA 双壁微球制备
1.2.1 包埋 NGF 的 PLGA 微球
取 50 μg NGF 和 300 mg 牛血清白蛋白溶解于 50 μL PBS 溶液，200 mg PLGA 溶解于 10 mL 二氯甲烷溶液。将上述两种溶液混合后，使用超声细胞粉碎仪超声分散 3 次（2 mm 探针头、时间 20 s、40% 功率），得到初乳液；将初乳液加入由 Tween80 和水溶液混合的溶液中，继续使用超声细胞粉碎仪超声分散 3 次（2 mm 探针头、时间 20 s、40% 功率），得到终乳液；随后经过磁力搅拌 30 min、过滤、离心（离心半径 6 cm，10 000 r/min，10 min）、干燥，得到包埋 NGF 的 PLGA 微球。同法制备未包埋 NGF 的 PLGA 微球。
1.2.2 包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球
取 200 mg 壳聚糖与 200 mL 冰醋酸溶液混合溶解；将包埋 NGF 的 PLGA 微球与上述壳聚糖溶液混合均匀后，缓慢加入液体石蜡油中，机械搅拌 1 h；分别将浓度为 1%、3%、10%（W/V）的 TPP 溶液缓慢加入液体石蜡油中，充分交联微球 1 h；依次使用石油醚、异丙醇反复清洗后，得到包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球，冰冻干燥后备用。同法制备未包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球。
1.3 观测指标
1.3.1 包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球的基本特点
取 3%TPP 交联的包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球，用于检测双壁微球的基本特点。① 表面形态观察：取上述双壁微球分散于水溶液中，光镜下观察。另将上述双壁微球均匀分散于金属圆柱体上，喷金后真空干燥，扫描电镜下观察。② 内部形态观察：在制备双壁微球过程中，分别使用 FITC 和尼罗红染色壳聚糖和 PLGA 进行荧光标记，然后将其分散于水溶液中，激光共聚焦显微镜下观察 PLGA 微球在双壁微球内的分布情况。③ 微球粒径分析：将上述双壁微球均匀分散于水溶液中，采用粒径分析仪检测其粒径分布和粒径大小。④ 物理-化学特性评价：分别取壳聚糖、PLGA 及未包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球，压成薄片后，采用红外光谱分析仪分析其物理-化学特性。
1.3.2 体外微球降解率测定
分别将 10 mg 包埋 NGF 的 PLGA 微球和 1%、3%、10%TPP 交联的包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球（分别设为 A、B、C、D 组）溶解于 10 mL PBS 溶液（pH7.4）中，充分混合均匀并磁力搅拌（100 r/min）。分别于 0～12 周每周以离心半径 6 cm、10 000 r/min 离心 5 min，取出微球后真空干燥并称重。按以下公式计算微球降解率：（W0–W1/W0）×100%，其中 W0 表示微球的初始质量，W1 表示降解后的微球质量。实验重复 3 次，取均值。
1.3.3 体外微球中 NGF 缓释检测
分别将 10 mg 包埋 NGF 的 PLGA 微球和 1%、3%、10%TPP 交联的包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球（分别设为 A、B、C、D 组）溶解于 5 mL PBS 溶液（pH7.4）中，放置于恒温摇床上匀速摇动。分别于 0～12 周每周以离心半径 6 cm、10 000 r/min 离心 10 min，提取上清液，使用 NGF-ELISA 试剂盒测定 NGF 含量。按以下公式计算 NGF 的总缓释率：R1/R0×100%，其中 R0 表示最初包埋 NGF 总量，R1 表示缓释液中 NGF 实际含量。
1.3.4 体外微球缓释液中 NGF 的生物活性评估
取 PC12 细胞以 1×105个/孔密度接种于含 2 mL 细胞培养液（含 5%FBS、10% 马血清及 1% 青链霉素的 RPMI1640 培养液）的 24 孔培养板中培养。取未包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球以及 1%、3%、10%TPP 交联的包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球（分别设为 A1、B、C、D 组），同 1.3.3 方法，于 7、28、56、84 d 分别从缓释液中吸取 300 μL 上清液，加入上述 24 孔培养板内，放入 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养 3 d。随机选择 24 孔培养板内的 100 个 PC12 细胞计数，当细胞有 1 个或多个突起，且突起长度超过胞体长度则被认为是具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞。按以下公式计算具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞百分比：P1/P0×100%，其中 P0 表示最初随机选择的 100 个 PC12 细胞，P1 表示具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞数量。
1.4 统计学方法
采用 PRISM（GraphPad 软件）统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 Student t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球的基本特点
① 表面形态观察：光镜和扫描电镜观察示，双壁微球呈球形结构，大小不等，分散较好，外表面相对粗糙，有很多小的球形凸起。见图 1。② 内部形态观察：激光共聚焦显微镜观察示，双壁微球的外壳为绿色（FITC 标记的壳聚糖），内核为红色（尼罗红标记的 PLGA 微球），PLGA 微球均匀分布于双壁微球内。见图 2。通过激光共聚焦显微镜结果，可以推出扫描电镜双壁微球外表面的凸起为 PLGA 微球，进一步说明该双壁微球制备成功。③ 微球粒径分析：双壁微球的粒径分布范围为 18.5～42.7 μm，平均 29.3 μm。见图 3。④ 物理-化学特性评价：红外光谱分析结果示，未包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球在 3 432 cm−1处的吸收峰增宽，为壳聚糖基质中的-NH2 基团拉伸振动所致，表明双壁微球在制备过程中保存了活性基团-NH2。与壳聚糖相比，双壁微球在 1 640 cm−1处的吸收峰移动至 1 632 cm−1处，说明壳聚糖的氨基与 TPP 中的磷酸基发生了静电反应。见图 4。
图1
包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球表面形态特点
a. 光镜观察（×10）；b. 扫描电镜观察（×50）
Figure1. Surface characteristics of NGF loaded chitosan-PLGA double-walled microspheresa. Light microscopy observation (×10); b. Scanning electron microscopy observation (×50)
图2
包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球内部形态（激光共聚焦显微镜×50）
a. 经 FITC 染色的壳聚糖微球；b. 经尼罗红染色的 PLGA 微球；c. 经 FITC 和尼罗红染色的包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球
Figure2. Inner characteristics of NGF loaded chitosan-PLGA double-walled microspheres (Confocal laser scanning microscopy×50)a. FITC-stained chitosan microspheres; b. Nile red-stained PLGA microspheres; c. NGF loaded chitosan-PLGA double-walled microspheres stained by FITC and Nile red
图3
包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球粒径分析
Figure3.
Size distribution of NGF loaded chitosan-PLGA double- walled microspheres
图4
壳聚糖、PLGA 及未包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微 球红外光谱分析
Figure4.
FT-IR spectra of chitosan, PLGA, and chitosan-PLGA double-walled microspheres
2.2 体外微球降解率测定
A 组：0～4 周微球降解速度逐渐增快，5～12 周降解速度较前减慢，12 周时微球降解率为 38.2%±2.8%。与 A 组相比，B、C、D 组双壁微球降解速度明显增快，并随着 TPP 浓度的增加而逐渐减慢，12 周时 B、C、D 组双壁微球的降解率分别达 62.3%±1.9%、53.0±2.8% 和 47.7%±2.1%。培养各时间点各组间微球降解率比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
各组微球的体外降解率比较
Figure5.
In vitro degradation ratio in each microspheres group
2.3 体外微球中 NGF 缓释检测
A 组 PLGA 微球缓释 NGF 存在“突释”现象，第 1 天 NGF 总缓释率高达 43.6%±1.8%，随后以相对较慢的速度缓释 NGF，84 d 时 NGF 的总缓释率达 81.2%±1.3%。与 A 组 PLGA 微球相比，B、C、D 组双壁微球以相对较慢的速度缓释 NGF，除 84 d 外，各时间点 B、C、D 组 NGF 总缓释率均显著低于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C、D 组 NGF 的缓释速度随 TPP 浓度增加而减慢，除 84 d 外，各时间点 B、C、D 组间比较 NGF 总缓释率差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6。
图6
各组微球的体外 NGF 缓释率比较
Figure6.
In vitro NGF sustained release ratio in each microspheres group
2.4 体外微球缓释液中 NGF 的生物活性评估
培养各时间点，B、C、D 组缓释液中具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞百分比均显著高于 A1 组，差异有统计学意义（P<0.05）。培养 7、28 d，B、C、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；56、84 d 时，C、D 组缓释液中具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞百分比显著高于 B 组，差异有统计学意义（P<0.05），C、D 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 7。
图7
各组微球缓释液中具有阳性轴突延长反应的 PC12 细胞 百分比比较
Figure7.
Percentage of PC12 cells with positive axonal elongation reaction in the sustained release solution in each microspheres group
3 讨论
周围神经的再生需要一个良好的再生微环境，其中神经营养因子发挥着至关重要的作用。神经营养因子可提供化学营养支持，激活受损神经元的再生活力，促进神经再生。然而，在神经损伤部位的内在神经营养因子不足，需要提供外源性神经营养支持。本研究结果显示，壳聚糖-PLGA 双壁微球可包埋并缓释具有生物活性的 NGF 达 84 d；此外，交联剂 TPP 浓度的增加可影响壳聚糖-PLGA 双壁微球的缓释性能和 NGF 的生物活性。
近年来，微球类缓释载体的迅速发展为临床应用奠定了良好基础。PLGA 微球是最受关注的一种微球缓释系统，在生物医学领域得到了广泛应用。然而，PLGA 微球具有突释性，在短时间内快速缓释包埋的蛋白药物，过量的蛋白药物不利于神经再生早期的负反馈调节作用，从而产生抑制神经再生的作用[13-15]。此外，PLGA 微球的酸性降解产物可破坏包埋蛋白药物的生物活性，降低蛋白药物的药学作用[16]。因此，寻找一种对 PLGA 微球改进的方法具有重要的临床意义。本研究选择壳聚糖修饰 PLGA 微球主要有以下两个原因：首先，壳聚糖是一种天然多聚物材料，具有良好的生物降解性和无毒性，广泛用于生物医药领域；其次，有学者报道壳聚糖的降解产物可促进轴突生长，加快神经再生[17-18]。然而，壳聚糖材料的机械强度较差，容易变形，需要交联剂交联以增强材料的强度。TPP 是一种物理离子交联剂，带负电荷，与带正电荷的壳聚糖通过物理反应交联。与化学交联剂相比，TPP 具有无毒性和良好的生物相容性[19-21]。本研究选用不同浓度的 TPP 物理交联双壁微球，旨在了解交联浓度对双壁微球性能的影响，以选择合适的交联浓度，为后续体内研究奠定良好基础。
体外缓释动力学结果表明，与 PLGA 微球相比，经不同 TPP 浓度交联的壳聚糖-PLGA 双壁微球的 NGF 缓释率均明显降低，以较慢的速度缓释 NGF。这可能是因为双壁微球的壳聚糖外壳和交联剂 TPP 使 NGF 从 PLGA 微球扩散至体外溶液的速度减慢，从而使 NGF 的缓释率降低。此外，TPP 浓度的增加可显著降低双壁微球的突释量，这可能是由于高浓度的 TPP 可以提高双壁微球的机械强度，降低双壁微球在溶液内的膨胀性，从而减慢 NGF 从双壁微球内部向外部扩散的速度，实现持续可控地缓释 NGF。体外微球缓释液中 NGF 的生物活性结果表明，壳聚糖-PLGA 双壁微球可有效保护 NGF 的生物活性，实现可控性缓释具有生物活性的 NGF。我们分析包埋 NGF 的壳聚糖-PLGA 双壁微球促 PC12 细胞具有阳性轴突延长反应的可能原因有以下几点：首先，双壁微球作为一种良好的缓释载体，可有效保护 NGF 的生物活性免受降解或修饰，而失去生物活性；其次，TPP 浓度增加，可减慢 NGF 的缓释速度，实现长期有效的缓慢释放；最后，壳聚糖和其降解产物与包埋的 NGF 达到协同促进神经再生的作用。
综上述，壳聚糖-PLGA 双壁微球可有效保护 NGF 的生物活性，实现持续可控的缓释，为下一步将其用于体内研究，或与神经支架联合修复周围神经缺损奠定良好的实验基础。
作者贡献：戎梦瑶参与实验设计、微球制备、统计分析及文章撰写；昌震参与微球的相关性能检测和数据收集；欧佳伟、赵松川参与实验数据的统计分析；曾文参与实验数据分析、文章修改；刘琦参与实验设计、实验数据整理，文章的思路设计及修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
