引用本文： 廖筱梅, 罗兴前, 代蕾, 黄海峻, 郭杏. 脂肪间充质干细胞-壳聚糖凝胶复合物治疗大鼠深Ⅱ度烫伤创面实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(1): 101-109. doi: 10.7507/1002-1892.201804109 复制
深度烧伤后皮肤屏障及再生功能常遭受破坏，如何快速且高效地修复深度烧伤创面，是烧伤整形科医生面临的巨大挑战[1-2]。目前的治疗方法主要有两种：一是早期行创面削痂植皮，去除坏死组织，减少烧伤创面感染因素，缩短愈合时间，但面临皮源不足、手术创伤大、费用较高等问题[3-4]；另一种方法是运用医用敷料覆盖创面，可以维持内环境稳定，促进残存上皮再生，加速创面愈合。近年来，壳聚糖及其衍生物因具有良好的组织相容性、生物可降解性、广谱抗菌性、止血防黏性等特点，被越来越多研究者运用于烧伤创面敷料的研究。特别是温敏氯化壳聚糖（chitosan chloride，CSCl）凝胶，其三维立体多孔结构有利于促进细胞黏附和增殖，能够有效阻止细菌感染，促进创面愈合[5-7]。而脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）免疫原性低，能自我更新、稳定增殖、多向分化，是组织工程种子细胞的研究热点[8-9]。其分泌的细胞因子能促进表皮细胞、成纤维细胞增殖及微血管生成，被广泛应用于烧伤创面修复研究[10-11]。因此本实验结合两者特点，制备 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物，将其运用于大鼠深Ⅱ度烫伤创面，观察其对烫伤创面修复的可行性，旨在为深度烫伤创面修复提供一种新型的组织工程修复方式。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF 级 6 周龄雄性 SD 大鼠 2 只，体质量 150～200 g；SPF 级 8 周龄雄性 SD 大鼠 72 只，体质量 200～250 g；均由西南医科大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2018-065。所有动物实验获得西南医科大学实验动物伦理委员会批准（20171211021）。
CSCl（浙江金壳生物化学有限公司）；β-甘油磷酸钠、Ⅰ型胶原酶及流式抗体 CD29、CD31、CD34、CD45、CD90（Sigma 公司，美国）；羟乙基纤维素（Fluka 公司，瑞士）；DMEM/F12 培养基（HyClone 公司，美国）；青-链霉素溶液、0.25% 胰蛋白酶（ScienCell 公司，美国）；FBS（杭州天杭生物科技股份公司）；成脂诱导液、成骨诱导液（BD 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁化学公司，日本）；Live/Dead 染色试剂盒（Molecular probe 公司，美国）；硫化钠（成都科龙化工试剂厂）。
生物安全柜（Telstar 公司，西班牙）；CO2 恒温培养箱（Thermo 公司，美国）；普通高速离心机（Bio-Rad 公司，美国）；倒置相差显微镜、荧光倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；流式细胞仪（BD 公司，德国）；低温离心机（Eppendorff 公司，德国）；分光光度计（Leica 公司，德国）。
1.2 ADSCs 提取、传代及鉴定
1.2.1 ADSCs 提取及传代
取 SPF 级 6 周龄雄性 SD 大鼠脱颈处死，乙醇浸泡后，无菌提取腹股沟处皮下脂肪组织，PBS 反复冲洗，剔除筋膜和血管，剪至糊状；加入 2～3 倍体积 0.1%Ⅰ型胶原酶 37℃ 恒温消化 60 min，等量完全培养基（含 10%FBS 的 DMEM 培养基）终止消化，以 700×g 离心 10 min；去除上清液和上层脂肪，以等量完全培养基重悬混匀；70 μm 滤网过滤后完全培养基重悬混匀，以 180×g 离心 5 min；去上清液，PBS 吹打混匀，再次以 180×g 离心 5 min 后去上清液，完全培养基重悬混匀，接种入 25 cm2培养瓶中，37℃、5%CO2 培养箱中培养；24 h 后全量换液；每 3 天更换培养基，至细胞达 80%～90% 融合时，以 0.25% 胰蛋白酶消化传代。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。
1.2.2 细胞鉴定
① 免疫表型鉴定：取第 3 代 ADSCs 用 0.25% 胰蛋白酶消化后制成密度为 1×106个/mL 的单细胞悬液，每管 100 μL 分装于 1.5 mL EP 管中，分别加入流式抗体 CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90，设立阴性对照，室温避光孵育 30 min 后流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。② 成脂、成骨分化鉴定：取第 3 代 ADSCs 用 0.25% 胰蛋白酶消化后，按 2×105个/孔密度接种于 6 孔板中，待细胞达 100% 融合时分别更换成脂诱导液和成骨诱导液。成脂诱导 2 周后油红 O 染色观察成脂分化效果，成骨诱导 4 周后茜素红染色观察成骨分化效果。
1.3 温敏 CSCl 凝胶制备及相关观测
1.3.1 温敏 CSCl 凝胶的制备
取 0.2 g 无菌 CSCl 粉末溶于 10 mL 无菌超纯水，制成 2%CSCl 溶液；1.15 g β-甘油磷酸钠溶于 10 mL H-DMEM 中，制成 11.5%β-甘油磷酸钠溶液；0.25 g 羟乙基纤维素溶于 10 mL H-DMEM 中，制成 2.5% 羟乙基纤维素溶液。将 CSCl、β-甘油磷酸钠、羟乙基纤维素于 0.22 μm 滤菌器过滤后，依次按 8∶2∶2.5 的比例混匀，置于 37℃、5%CO2 孵箱中，15 min 后形成凝胶。
1.3.2 ADSCs 与温敏 CSCl 凝胶的相容性
取 5 mL 温敏 CSCl 凝胶与 1×107个 ADSCs 混合，制成密度为 2×106个/mL 的 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物，加入 24 孔板，每孔 1 mL，培养 72 h。配制 Live/Dead 染液，将 2 μL EthdD-1 避光加入 1 mL PBS 中，混匀后再加入 0.5 μL 钙黄绿素，混合后加入上述 24 孔板中，37℃ 避光孵育 30 min，倒置荧光显微镜下观察。
1.3.3 ADSCs 在温敏 CSCl 凝胶中的增殖情况
取 5 mL 温敏 CSCl 凝胶与 1×107个 ADSCs 混合，制成密度为 2×106个/mL 的 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物，为实验组；ADSCs 组为对照组。均加入 96 孔板，每孔 50 μL，共 20 孔。放入 37℃ 孵箱待实验组成凝胶后，每孔加入 0.1 mL 完全培养基。于培养 1、3、5、7 d 两组分别取 5 孔，全量换液后，添加 10 μL CCK-8 原液；37℃ 孵育 4 h，分光光度计于 450 nm 处测其吸光度（A）值，并绘制细胞增殖曲线。
1.4 动物实验
1.4.1 大鼠深Ⅱ度烫伤创面造模及处理
取 SPF 级 8 周龄雄性 SD 大鼠 72 只，2% 戊巴比妥（2 mL/kg）腹腔注射麻醉后，8% 硫化钠脱去大鼠背部毛发，自制烫伤模具紧贴大鼠背部脱毛区域；将 10 mL 沸水迅速倒入模具中，10 s 后快速倒出沸水，制成一直径约 2.5 cm 的圆形深Ⅱ度烫伤模型，行病理切片 HE 染色鉴定造模是否成功。造模后将大鼠单笼饲养，随机分为 3 组，每组 24 只。烫伤后创面无菌纱布保护创面，每天更换纱布，3 d 后削痂，A 组为空白对照组，以凡士林纱布加无菌纱布覆盖创面；B 组用 1 mL 温敏 CSCl 凝胶，涂抹创面后凡士林纱布覆盖；C 组以 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物（ADSCs 密度为 2×106个/mL）1 mL 涂抹创面后，凡士林纱布覆盖。然后包扎固定，3 组均隔天换药。
1.4.2 创面大体观察
观察大鼠创面闭合情况。术后 3、7、14、21 d 每组取 6 只大鼠，麻醉后无菌塑料薄膜覆盖创面并用铅笔描绘其大小，将绘制好的薄膜扫描入电脑，用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件对轮廓大小进行分析，按以下公式计算创面闭合率：（烧伤创面面积−治疗后创面面积）/烧伤创面面积×100%。
1.4.3 HE 染色观察
术后 3、7、14、21 d 每组取 6 只大鼠，麻醉后处死，取创面全层皮肤置于 10% 中性甲醛浸泡固定 24 h，石蜡包埋并进行切片，片厚 4 μm，脱蜡后行 HE 染色。术后 7 d 随机取近表面视野，先于低倍视野内（10×10）选择炎性细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞）数目较多的区域，再于高倍视野内（10×40）取 5 个视野，观察并计数视野内炎性细胞数量，取均值。术后 21 d 随机取近表面视野，先于低倍视野内（10×10）选择表皮厚度较均匀的区域，再于高倍视野内（10×40）取 5 个视野，检测新生表皮厚度，取均值。
1.4.4 CD31 免疫组织化学染色观察
取术后第 7 天组织标本蜡块，二甲苯脱蜡，乙醇脱水、抗原修复和血清封闭后，切片加入兔抗 CD31 多克隆抗体标记血管内皮细胞，先于低倍视野内（10×10）选择 3 个 CD31 标记微血管密度高的区域，然后于高倍视野内（10×20）每个区域计数 5 个视野内的微血管密度[12]，取均值。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 ADSCs 形态学观察及鉴定
2.1.1 ADSCs 形态学观察
原代细胞接种 24 h 后大部分贴壁，呈长梭形、三角形或多角形；7 d 细胞进入对数生长期，快速增殖；传代培养后细胞生长增殖速度加快，形态均一，呈鱼群状、旋涡状生长。见图 1。
图1
ADSCs 形态学观察（倒置相差显微镜×40）
a. 原代细胞接种 48 h；b. 原代细胞接种 7 d；c. 第 1 代细胞；d. 第 3 代细胞
Figure1. Morphology observation of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×40)a. Primary cells after 24 hours inoculation; b. Primary cells after 7 days inoculation; c. The first generaration cells; d. The third generaration cells
2.1.2 细胞表型鉴定
流式细胞术检测示，第 3 代 ADSCs 表面标志物 CD29、CD90 表达率分别为 99.91%、99.23%，呈阳性表达；CD31、CD34、CD44、CD45 表达率分别为 0.02%、0.01%、0.06%、3.65%，呈阴性表达。见图 2。
图2
流式细胞仪检测第 3 代 ADSCs 表面标志物
a. CD29；b. CD90；c. CD31；d. CD34；e. CD45；f. CD44
Figure2. Detection of surface markers of the third generation ADSCs by flow cytometrya. CD29; b. CD90; c. CD31; d. CD34; e. CD45; f. CD44
2.1.3 成脂、成骨诱导鉴定
成脂诱导 2 周，细胞质内出现形态各异的脂滴，油红 O 染色呈阳性；成骨诱导 4 周，细胞形态变得模糊，呈多形性，镜下观察细胞间形成钙结节，茜素红染色呈阳性。见图 3。
图3
ADSCs 成脂、成骨分化鉴定（倒置相差显微镜×200）
a. 成脂诱导 2 周油红 O 染色；b. 成骨诱导 4 周茜素红染色
Figure3. Identification of adipogenic and osteogenic differentiation of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×200)a. Oil red staining after 2 weeks of adipogenic induction; b. Alizarin red staining after 4 weeks of osteogenic induction
2.2 温敏 CSCl 凝胶相关观测
2.2.1 大体观察
刚配制的温敏 CSCl 凝胶 4℃ 呈液态、淡黄色，较黏稠；37℃ 恒温孵箱放置 15 min 后成凝胶。见图 4。
图4
温敏 CSCl 凝胶大体观察
a. 液态；b. 凝胶状
Figure4. General observation of thermosensitive CSCl gela. Liquid state; b. Gelatinous
2.2.2 ADSCs 与温敏 CSCl 凝胶的相容性
体外培养 72 h 后 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物行 Live/Dead 染色，倒置荧光显微镜观察示细胞分布较均匀，大部分细胞被染成绿色，表示细胞存活；少部分细胞呈红色，表示细胞死亡。见图 5。
图5
ADSCs-温敏 CSCl 凝胶复合物培养 72 h 后 Live/Dead 染 色观察（倒置荧光显微镜×200）
Figure5.
Live/Dead staining of ADSCs-thermosensitive CSCl gel composites cultured for 72 hours (Inverted fluorescence microscope×200)
2.2.3 ADSCs 在温敏 CSCl 凝胶中的增殖情况
CCK-8 法检测示，培养 1、3、5、7 d 实验组 A 值均低于对照组。第 1 天两组 A 值差异无统计学意义（P>0.05）；对照组 A 值从第 3 天开始呈下降趋势，而实验组 A 值继续上升，两组 3、5、7 d 时比较差异均有统计学意义（P<0.01）。见图 6。
图6
CCK-8 法检测 ADSCs 在温敏 CSCl 凝胶中的增殖情况
Figure6.
The proliferation of ADSCs in thermosensitive CSCl gel detected by CCK-8 method
2.3 动物实验
2.3.1 创面大体观察
烫伤后大鼠背部创面即刻出现肿胀，与周围正常皮肤形成明显界限；HE 染色示皮肤表皮和部分真皮层结构消失，形成凝固性坏死，并有大量炎性细胞浸润。见图 7。3 组大鼠均存活至实验结束，实验期间除 A 组有 1 只大鼠创面创缘红肿外，余均未见创面感染。3 组大鼠创面均随时间推移而缩小，术后 3 d，B、C 组创面闭合速度快于 A 组；7、14 d，3 组创面闭合速度减慢，C 组创面闭合率高于 A、B 组；21 d，各组大鼠创面均可见新生上皮覆盖，但均未完全闭合，已闭合部位毛发长出，未闭合部位形状不规则。术后各时间点 B、C 组创面闭合率均大于 A 组，C 组大于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.01）。见图 8、9。
图7
烫伤 3 d 后大鼠皮肤组织 HE 染色观察（倒置相差显微 镜×40）
Figure7.
HE staining observation of rats skin tissue at 3 days after burn (Inverted phase contrast microscope×40)
图8
术后各时间点各组大鼠创面闭合情况比较
从左至右依次为术后 3、7、14、21 d a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure8. Comparison of wound closure in each group at different time points after operationFrom left to right for the time at 3, 7, 14, and 21 days after operation a. Group A; b. Group B; c. Group C
图9
术后各时间点各组大鼠创面闭合率比较
Figure9.
Wound closure rate of rats at each time point after operation
2.3.2 HE 染色观察创面修复情况
术后 3 d，3 组大鼠创面均可见大量中性粒细胞浸润，成纤维细胞数量较少。术后 7 d，3 组大鼠创面修复进入纤维增生期，各组可见胶原沉积，真皮层可见炎性细胞浸润，A、B、C 组炎性细胞数分别为（29.61±2.99）、（22.89±1.71）、（16.61±2.15）个/视野，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.01）。术后 14 d，3 组大鼠创面出现大量纤维结缔组织，可见新生表皮，C 组新生表皮较致密。术后 21 d，与正常皮肤组织相比，B、C 组新生上皮排列整齐，真皮层纤维结缔组织排列整齐，可见成纤维细胞及新生毛细血管，A 组亦可见新生表皮覆盖，但真皮层纤维结缔组织排列较紊乱，见零星毛细血管。A、B、C 组新生表皮厚度分别为（65.87±1.13）、（107.20±3.35）、（123.96±4.20）μm，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.01）。见图 10、11。
图10
HE 染色观察术后 7 d 各组炎性细胞（倒置相差显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure10. HE staining observation of inflammatory cells in each group at 7 days after operation (Inverted phase contrast microscope×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C
图11
HE 染色观察术后 21 d 各组新生表皮厚度 （倒置相差显微镜 ×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure11. HE staining observation of epidermal thickness in each group at 21 days after operation (Inverted phase contrast microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C2.3.3 CD31 免疫组织化学染色观察
术后 7 d，CD31 免疫组织化学染色示各组均可见新生微血管。A、B、C 组大鼠创面新生微血管数分别为（21.64±5.36）、（48.14±5.33）、（71.63±8.03）个/视野，C 组显著高于 A、B 组，B 组高于 A 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 12。
图12
术后 7 d 各组 CD31 免疫组织化学染色观察（倒置相差显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure12. CD31 immunohistochemical staining observation in each group at 7 days after operation (Inverted phase contrast microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C3 讨论
MSCs 能够自我更新、稳定增殖、多向分化，被广泛运用于再生医学及皮肤组织工程[13]。MSCs 可以通过分化、自我增殖及分泌生长因子等方式促进受损皮肤再生、胶原沉积、微血管生成。研究证实其创面修复过程主要是在趋化因子作用下迁移至受损部位，分化为特定的细胞，调节免疫反应增加创面血管生成，同时能分泌抗菌因子直接杀灭细菌[14]。ADSCs 同 BMSCs 有着相似的细胞表型和分化潜能，但 ADSCs 来源更丰富、获取更方便，数量更多。将 ADSCs 连续培养至第 11 代，发现其细胞形态无明显变化，证明其具有强大增殖能力，可稳定传代[15]。将 ADSCs 悬液运用于放射性损伤后大鼠创面和缺血再灌注损伤后的皮肤创面发现，ADSCs 可以通过增加皮瓣血液供应及创面血管数量，提高皮瓣存活率[16-17]；将 ADSCs 悬液注射入经紫外线诱导后的裸鼠皮肤老化模型中，发现其促进真皮层胶原合成，增加真皮厚度[18]。本研究使用酶原消化并差速贴壁的方式获取 ADSCs 并培养传代，通过检测其表面标志物提示本实验提取所得细胞为 ADSCs，且细胞纯度较高；通过对第 3 代 ADSCs 进行成脂、成骨诱导分化实验，油红 O 染色可见细胞质内有大小不一的脂滴形成，茜素红染色可见钙结节，提示 ADSCs 具有成骨、成脂分化潜能。
然而，直接运用 ADSCs 悬液进行相关研究面临着细胞存活率低、移植效率不高等问题，寻找合适的 ADSCs 支架材料，可以增加其存活率及利用率。有研究将 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物运用于大鼠心肌梗死模型治疗中，发现温敏 CSCl 凝胶作为 ADSCs 载体，为 ADSCs 提供了适宜的生存环境，改变心肌梗死部位微环境，增加 ADSCs 残留及存活数，通过检测心肌标志物的表达发现 ADSCs 加速向心肌细胞转化，梗死部位微血管密度较高，新生血管生成加快，胶原合成减少[19]。温敏 CSCl 凝胶作为 ADSCs 支架，在急性肾损伤治疗研究中发现肾细胞增殖加快、凋亡减少，肾脏微血管数目增加和肾小管细胞再生加快[12, 20]。在皮肤组织工程研究中，将三维培养的 ADSCs 运用于糖尿病大鼠创面修复实验中，通过 CD31 及 Ki67 免疫组织化学染色法，发现创面血管生成增加，细胞自我增殖加快，同时创面闭合速率也大幅度提升[12]。本实验采用三维培养的 ADSCs 对烧伤创面进行修复。既往研究证实温敏 CSCl 凝胶具有温度敏感性，4℃ 下有流动性，呈液态，37℃ 成凝胶后镜下观察强度较高，内部具有均匀、连续的多孔通道，具备细胞生长所需的三维空间结构，将细胞包埋于凝胶中后，细胞生长良好，增殖加快，凋亡减慢，具有良好的组织相容性[21]。软骨组织工程研究中也发现温敏 CSCl 凝胶细胞毒性较小，具有良好的组织相容性，包埋于其中的种子细胞能够存活并稳定增殖，修复软骨组织缺损的同时具有良好的可降解性[22]。本研究体外实验阶段通过 Live/Dead 染色和 CCK-8 法观察 ADSCs 在温敏 CSCl 凝胶的存活和增殖情况，发现 ADSCs 在温敏 CSCl 凝胶中生长良好，虽增殖速率较二维培养慢，但是研究期间一直保持稳定增殖率持续生长。为探究 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物对烫伤创面的修复情况，本研究通过开水接触烫伤法成功制备大鼠深Ⅱ度烫伤模型，将 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物运用于大鼠深Ⅱ度烫伤创面，观察其对创面修复的影响。结果显示其显著加速 SD 大鼠烫伤创面闭合；组织学观察示，相对于温敏 CSCl 凝胶组和对照组，ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物组创面上皮化加快、炎性细胞浸润较少；免疫组织化学染色法检测创面 CD31 表达，观察创面新生微血管密度，与既往研究结果相似，发现 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物组 CD31 阳性表达细胞数明显高于其他两组，表明 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物可以通过增加大鼠深Ⅱ度烧伤皮肤微血管数量来加速创面修复。至于 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物是通过分泌细胞因子还是诱导表皮细胞、血管内皮细胞分化来加速创面修复，有待后期进一步研究。
综上述，ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物的成功制备为干细胞和皮肤组织工程研究在烧伤方面的运用提供了新的方向。通过初步探讨其促进烧伤创面修复的情况，发现 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶可以通过加速创面上皮化、减少炎性细胞浸润及增加创面微血管等方式促进大鼠深Ⅱ度烫伤创面修复。
深度烧伤后皮肤屏障及再生功能常遭受破坏，如何快速且高效地修复深度烧伤创面，是烧伤整形科医生面临的巨大挑战[1-2]。目前的治疗方法主要有两种：一是早期行创面削痂植皮，去除坏死组织，减少烧伤创面感染因素，缩短愈合时间，但面临皮源不足、手术创伤大、费用较高等问题[3-4]；另一种方法是运用医用敷料覆盖创面，可以维持内环境稳定，促进残存上皮再生，加速创面愈合。近年来，壳聚糖及其衍生物因具有良好的组织相容性、生物可降解性、广谱抗菌性、止血防黏性等特点，被越来越多研究者运用于烧伤创面敷料的研究。特别是温敏氯化壳聚糖（chitosan chloride，CSCl）凝胶，其三维立体多孔结构有利于促进细胞黏附和增殖，能够有效阻止细菌感染，促进创面愈合[5-7]。而脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）免疫原性低，能自我更新、稳定增殖、多向分化，是组织工程种子细胞的研究热点[8-9]。其分泌的细胞因子能促进表皮细胞、成纤维细胞增殖及微血管生成，被广泛应用于烧伤创面修复研究[10-11]。因此本实验结合两者特点，制备 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物，将其运用于大鼠深Ⅱ度烫伤创面，观察其对烫伤创面修复的可行性，旨在为深度烫伤创面修复提供一种新型的组织工程修复方式。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF 级 6 周龄雄性 SD 大鼠 2 只，体质量 150～200 g；SPF 级 8 周龄雄性 SD 大鼠 72 只，体质量 200～250 g；均由西南医科大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2018-065。所有动物实验获得西南医科大学实验动物伦理委员会批准（20171211021）。
CSCl（浙江金壳生物化学有限公司）；β-甘油磷酸钠、Ⅰ型胶原酶及流式抗体 CD29、CD31、CD34、CD45、CD90（Sigma 公司，美国）；羟乙基纤维素（Fluka 公司，瑞士）；DMEM/F12 培养基（HyClone 公司，美国）；青-链霉素溶液、0.25% 胰蛋白酶（ScienCell 公司，美国）；FBS（杭州天杭生物科技股份公司）；成脂诱导液、成骨诱导液（BD 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁化学公司，日本）；Live/Dead 染色试剂盒（Molecular probe 公司，美国）；硫化钠（成都科龙化工试剂厂）。
生物安全柜（Telstar 公司，西班牙）；CO2 恒温培养箱（Thermo 公司，美国）；普通高速离心机（Bio-Rad 公司，美国）；倒置相差显微镜、荧光倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；流式细胞仪（BD 公司，德国）；低温离心机（Eppendorff 公司，德国）；分光光度计（Leica 公司，德国）。
1.2 ADSCs 提取、传代及鉴定
1.2.1 ADSCs 提取及传代
取 SPF 级 6 周龄雄性 SD 大鼠脱颈处死，乙醇浸泡后，无菌提取腹股沟处皮下脂肪组织，PBS 反复冲洗，剔除筋膜和血管，剪至糊状；加入 2～3 倍体积 0.1%Ⅰ型胶原酶 37℃ 恒温消化 60 min，等量完全培养基（含 10%FBS 的 DMEM 培养基）终止消化，以 700×g 离心 10 min；去除上清液和上层脂肪，以等量完全培养基重悬混匀；70 μm 滤网过滤后完全培养基重悬混匀，以 180×g 离心 5 min；去上清液，PBS 吹打混匀，再次以 180×g 离心 5 min 后去上清液，完全培养基重悬混匀，接种入 25 cm2培养瓶中，37℃、5%CO2 培养箱中培养；24 h 后全量换液；每 3 天更换培养基，至细胞达 80%～90% 融合时，以 0.25% 胰蛋白酶消化传代。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。
1.2.2 细胞鉴定
① 免疫表型鉴定：取第 3 代 ADSCs 用 0.25% 胰蛋白酶消化后制成密度为 1×106个/mL 的单细胞悬液，每管 100 μL 分装于 1.5 mL EP 管中，分别加入流式抗体 CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90，设立阴性对照，室温避光孵育 30 min 后流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。② 成脂、成骨分化鉴定：取第 3 代 ADSCs 用 0.25% 胰蛋白酶消化后，按 2×105个/孔密度接种于 6 孔板中，待细胞达 100% 融合时分别更换成脂诱导液和成骨诱导液。成脂诱导 2 周后油红 O 染色观察成脂分化效果，成骨诱导 4 周后茜素红染色观察成骨分化效果。
1.3 温敏 CSCl 凝胶制备及相关观测
1.3.1 温敏 CSCl 凝胶的制备
取 0.2 g 无菌 CSCl 粉末溶于 10 mL 无菌超纯水，制成 2%CSCl 溶液；1.15 g β-甘油磷酸钠溶于 10 mL H-DMEM 中，制成 11.5%β-甘油磷酸钠溶液；0.25 g 羟乙基纤维素溶于 10 mL H-DMEM 中，制成 2.5% 羟乙基纤维素溶液。将 CSCl、β-甘油磷酸钠、羟乙基纤维素于 0.22 μm 滤菌器过滤后，依次按 8∶2∶2.5 的比例混匀，置于 37℃、5%CO2 孵箱中，15 min 后形成凝胶。
1.3.2 ADSCs 与温敏 CSCl 凝胶的相容性
取 5 mL 温敏 CSCl 凝胶与 1×107个 ADSCs 混合，制成密度为 2×106个/mL 的 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物，加入 24 孔板，每孔 1 mL，培养 72 h。配制 Live/Dead 染液，将 2 μL EthdD-1 避光加入 1 mL PBS 中，混匀后再加入 0.5 μL 钙黄绿素，混合后加入上述 24 孔板中，37℃ 避光孵育 30 min，倒置荧光显微镜下观察。
1.3.3 ADSCs 在温敏 CSCl 凝胶中的增殖情况
取 5 mL 温敏 CSCl 凝胶与 1×107个 ADSCs 混合，制成密度为 2×106个/mL 的 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物，为实验组；ADSCs 组为对照组。均加入 96 孔板，每孔 50 μL，共 20 孔。放入 37℃ 孵箱待实验组成凝胶后，每孔加入 0.1 mL 完全培养基。于培养 1、3、5、7 d 两组分别取 5 孔，全量换液后，添加 10 μL CCK-8 原液；37℃ 孵育 4 h，分光光度计于 450 nm 处测其吸光度（A）值，并绘制细胞增殖曲线。
1.4 动物实验
1.4.1 大鼠深Ⅱ度烫伤创面造模及处理
取 SPF 级 8 周龄雄性 SD 大鼠 72 只，2% 戊巴比妥（2 mL/kg）腹腔注射麻醉后，8% 硫化钠脱去大鼠背部毛发，自制烫伤模具紧贴大鼠背部脱毛区域；将 10 mL 沸水迅速倒入模具中，10 s 后快速倒出沸水，制成一直径约 2.5 cm 的圆形深Ⅱ度烫伤模型，行病理切片 HE 染色鉴定造模是否成功。造模后将大鼠单笼饲养，随机分为 3 组，每组 24 只。烫伤后创面无菌纱布保护创面，每天更换纱布，3 d 后削痂，A 组为空白对照组，以凡士林纱布加无菌纱布覆盖创面；B 组用 1 mL 温敏 CSCl 凝胶，涂抹创面后凡士林纱布覆盖；C 组以 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物（ADSCs 密度为 2×106个/mL）1 mL 涂抹创面后，凡士林纱布覆盖。然后包扎固定，3 组均隔天换药。
1.4.2 创面大体观察
观察大鼠创面闭合情况。术后 3、7、14、21 d 每组取 6 只大鼠，麻醉后无菌塑料薄膜覆盖创面并用铅笔描绘其大小，将绘制好的薄膜扫描入电脑，用 Image-Pro Plus 6.0 图像分析软件对轮廓大小进行分析，按以下公式计算创面闭合率：（烧伤创面面积−治疗后创面面积）/烧伤创面面积×100%。
1.4.3 HE 染色观察
术后 3、7、14、21 d 每组取 6 只大鼠，麻醉后处死，取创面全层皮肤置于 10% 中性甲醛浸泡固定 24 h，石蜡包埋并进行切片，片厚 4 μm，脱蜡后行 HE 染色。术后 7 d 随机取近表面视野，先于低倍视野内（10×10）选择炎性细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞）数目较多的区域，再于高倍视野内（10×40）取 5 个视野，观察并计数视野内炎性细胞数量，取均值。术后 21 d 随机取近表面视野，先于低倍视野内（10×10）选择表皮厚度较均匀的区域，再于高倍视野内（10×40）取 5 个视野，检测新生表皮厚度，取均值。
1.4.4 CD31 免疫组织化学染色观察
取术后第 7 天组织标本蜡块，二甲苯脱蜡，乙醇脱水、抗原修复和血清封闭后，切片加入兔抗 CD31 多克隆抗体标记血管内皮细胞，先于低倍视野内（10×10）选择 3 个 CD31 标记微血管密度高的区域，然后于高倍视野内（10×20）每个区域计数 5 个视野内的微血管密度[12]，取均值。
1.5 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 ADSCs 形态学观察及鉴定
2.1.1 ADSCs 形态学观察
原代细胞接种 24 h 后大部分贴壁，呈长梭形、三角形或多角形；7 d 细胞进入对数生长期，快速增殖；传代培养后细胞生长增殖速度加快，形态均一，呈鱼群状、旋涡状生长。见图 1。
图1
ADSCs 形态学观察（倒置相差显微镜×40）
a. 原代细胞接种 48 h；b. 原代细胞接种 7 d；c. 第 1 代细胞；d. 第 3 代细胞
Figure1. Morphology observation of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×40)a. Primary cells after 24 hours inoculation; b. Primary cells after 7 days inoculation; c. The first generaration cells; d. The third generaration cells
2.1.2 细胞表型鉴定
流式细胞术检测示，第 3 代 ADSCs 表面标志物 CD29、CD90 表达率分别为 99.91%、99.23%，呈阳性表达；CD31、CD34、CD44、CD45 表达率分别为 0.02%、0.01%、0.06%、3.65%，呈阴性表达。见图 2。
图2
流式细胞仪检测第 3 代 ADSCs 表面标志物
a. CD29；b. CD90；c. CD31；d. CD34；e. CD45；f. CD44
Figure2. Detection of surface markers of the third generation ADSCs by flow cytometrya. CD29; b. CD90; c. CD31; d. CD34; e. CD45; f. CD44
2.1.3 成脂、成骨诱导鉴定
成脂诱导 2 周，细胞质内出现形态各异的脂滴，油红 O 染色呈阳性；成骨诱导 4 周，细胞形态变得模糊，呈多形性，镜下观察细胞间形成钙结节，茜素红染色呈阳性。见图 3。
图3
ADSCs 成脂、成骨分化鉴定（倒置相差显微镜×200）
a. 成脂诱导 2 周油红 O 染色；b. 成骨诱导 4 周茜素红染色
Figure3. Identification of adipogenic and osteogenic differentiation of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×200)a. Oil red staining after 2 weeks of adipogenic induction; b. Alizarin red staining after 4 weeks of osteogenic induction
2.2 温敏 CSCl 凝胶相关观测
2.2.1 大体观察
刚配制的温敏 CSCl 凝胶 4℃ 呈液态、淡黄色，较黏稠；37℃ 恒温孵箱放置 15 min 后成凝胶。见图 4。
图4
温敏 CSCl 凝胶大体观察
a. 液态；b. 凝胶状
Figure4. General observation of thermosensitive CSCl gela. Liquid state; b. Gelatinous
2.2.2 ADSCs 与温敏 CSCl 凝胶的相容性
体外培养 72 h 后 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物行 Live/Dead 染色，倒置荧光显微镜观察示细胞分布较均匀，大部分细胞被染成绿色，表示细胞存活；少部分细胞呈红色，表示细胞死亡。见图 5。
图5
ADSCs-温敏 CSCl 凝胶复合物培养 72 h 后 Live/Dead 染 色观察（倒置荧光显微镜×200）
Figure5.
Live/Dead staining of ADSCs-thermosensitive CSCl gel composites cultured for 72 hours (Inverted fluorescence microscope×200)
2.2.3 ADSCs 在温敏 CSCl 凝胶中的增殖情况
CCK-8 法检测示，培养 1、3、5、7 d 实验组 A 值均低于对照组。第 1 天两组 A 值差异无统计学意义（P>0.05）；对照组 A 值从第 3 天开始呈下降趋势，而实验组 A 值继续上升，两组 3、5、7 d 时比较差异均有统计学意义（P<0.01）。见图 6。
图6
CCK-8 法检测 ADSCs 在温敏 CSCl 凝胶中的增殖情况
Figure6.
The proliferation of ADSCs in thermosensitive CSCl gel detected by CCK-8 method
2.3 动物实验
2.3.1 创面大体观察
烫伤后大鼠背部创面即刻出现肿胀，与周围正常皮肤形成明显界限；HE 染色示皮肤表皮和部分真皮层结构消失，形成凝固性坏死，并有大量炎性细胞浸润。见图 7。3 组大鼠均存活至实验结束，实验期间除 A 组有 1 只大鼠创面创缘红肿外，余均未见创面感染。3 组大鼠创面均随时间推移而缩小，术后 3 d，B、C 组创面闭合速度快于 A 组；7、14 d，3 组创面闭合速度减慢，C 组创面闭合率高于 A、B 组；21 d，各组大鼠创面均可见新生上皮覆盖，但均未完全闭合，已闭合部位毛发长出，未闭合部位形状不规则。术后各时间点 B、C 组创面闭合率均大于 A 组，C 组大于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.01）。见图 8、9。
图7
烫伤 3 d 后大鼠皮肤组织 HE 染色观察（倒置相差显微 镜×40）
Figure7.
HE staining observation of rats skin tissue at 3 days after burn (Inverted phase contrast microscope×40)
图8
术后各时间点各组大鼠创面闭合情况比较
从左至右依次为术后 3、7、14、21 d a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure8. Comparison of wound closure in each group at different time points after operationFrom left to right for the time at 3, 7, 14, and 21 days after operation a. Group A; b. Group B; c. Group C
图9
术后各时间点各组大鼠创面闭合率比较
Figure9.
Wound closure rate of rats at each time point after operation
2.3.2 HE 染色观察创面修复情况
术后 3 d，3 组大鼠创面均可见大量中性粒细胞浸润，成纤维细胞数量较少。术后 7 d，3 组大鼠创面修复进入纤维增生期，各组可见胶原沉积，真皮层可见炎性细胞浸润，A、B、C 组炎性细胞数分别为（29.61±2.99）、（22.89±1.71）、（16.61±2.15）个/视野，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.01）。术后 14 d，3 组大鼠创面出现大量纤维结缔组织，可见新生表皮，C 组新生表皮较致密。术后 21 d，与正常皮肤组织相比，B、C 组新生上皮排列整齐，真皮层纤维结缔组织排列整齐，可见成纤维细胞及新生毛细血管，A 组亦可见新生表皮覆盖，但真皮层纤维结缔组织排列较紊乱，见零星毛细血管。A、B、C 组新生表皮厚度分别为（65.87±1.13）、（107.20±3.35）、（123.96±4.20）μm，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.01）。见图 10、11。
图10
HE 染色观察术后 7 d 各组炎性细胞（倒置相差显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure10. HE staining observation of inflammatory cells in each group at 7 days after operation (Inverted phase contrast microscope×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C
图11
HE 染色观察术后 21 d 各组新生表皮厚度 （倒置相差显微镜 ×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure11. HE staining observation of epidermal thickness in each group at 21 days after operation (Inverted phase contrast microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C2.3.3 CD31 免疫组织化学染色观察
术后 7 d，CD31 免疫组织化学染色示各组均可见新生微血管。A、B、C 组大鼠创面新生微血管数分别为（21.64±5.36）、（48.14±5.33）、（71.63±8.03）个/视野，C 组显著高于 A、B 组，B 组高于 A 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 12。
图12
术后 7 d 各组 CD31 免疫组织化学染色观察（倒置相差显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure12. CD31 immunohistochemical staining observation in each group at 7 days after operation (Inverted phase contrast microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C3 讨论
MSCs 能够自我更新、稳定增殖、多向分化，被广泛运用于再生医学及皮肤组织工程[13]。MSCs 可以通过分化、自我增殖及分泌生长因子等方式促进受损皮肤再生、胶原沉积、微血管生成。研究证实其创面修复过程主要是在趋化因子作用下迁移至受损部位，分化为特定的细胞，调节免疫反应增加创面血管生成，同时能分泌抗菌因子直接杀灭细菌[14]。ADSCs 同 BMSCs 有着相似的细胞表型和分化潜能，但 ADSCs 来源更丰富、获取更方便，数量更多。将 ADSCs 连续培养至第 11 代，发现其细胞形态无明显变化，证明其具有强大增殖能力，可稳定传代[15]。将 ADSCs 悬液运用于放射性损伤后大鼠创面和缺血再灌注损伤后的皮肤创面发现，ADSCs 可以通过增加皮瓣血液供应及创面血管数量，提高皮瓣存活率[16-17]；将 ADSCs 悬液注射入经紫外线诱导后的裸鼠皮肤老化模型中，发现其促进真皮层胶原合成，增加真皮厚度[18]。本研究使用酶原消化并差速贴壁的方式获取 ADSCs 并培养传代，通过检测其表面标志物提示本实验提取所得细胞为 ADSCs，且细胞纯度较高；通过对第 3 代 ADSCs 进行成脂、成骨诱导分化实验，油红 O 染色可见细胞质内有大小不一的脂滴形成，茜素红染色可见钙结节，提示 ADSCs 具有成骨、成脂分化潜能。
然而，直接运用 ADSCs 悬液进行相关研究面临着细胞存活率低、移植效率不高等问题，寻找合适的 ADSCs 支架材料，可以增加其存活率及利用率。有研究将 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物运用于大鼠心肌梗死模型治疗中，发现温敏 CSCl 凝胶作为 ADSCs 载体，为 ADSCs 提供了适宜的生存环境，改变心肌梗死部位微环境，增加 ADSCs 残留及存活数，通过检测心肌标志物的表达发现 ADSCs 加速向心肌细胞转化，梗死部位微血管密度较高，新生血管生成加快，胶原合成减少[19]。温敏 CSCl 凝胶作为 ADSCs 支架，在急性肾损伤治疗研究中发现肾细胞增殖加快、凋亡减少，肾脏微血管数目增加和肾小管细胞再生加快[12, 20]。在皮肤组织工程研究中，将三维培养的 ADSCs 运用于糖尿病大鼠创面修复实验中，通过 CD31 及 Ki67 免疫组织化学染色法，发现创面血管生成增加，细胞自我增殖加快，同时创面闭合速率也大幅度提升[12]。本实验采用三维培养的 ADSCs 对烧伤创面进行修复。既往研究证实温敏 CSCl 凝胶具有温度敏感性，4℃ 下有流动性，呈液态，37℃ 成凝胶后镜下观察强度较高，内部具有均匀、连续的多孔通道，具备细胞生长所需的三维空间结构，将细胞包埋于凝胶中后，细胞生长良好，增殖加快，凋亡减慢，具有良好的组织相容性[21]。软骨组织工程研究中也发现温敏 CSCl 凝胶细胞毒性较小，具有良好的组织相容性，包埋于其中的种子细胞能够存活并稳定增殖，修复软骨组织缺损的同时具有良好的可降解性[22]。本研究体外实验阶段通过 Live/Dead 染色和 CCK-8 法观察 ADSCs 在温敏 CSCl 凝胶的存活和增殖情况，发现 ADSCs 在温敏 CSCl 凝胶中生长良好，虽增殖速率较二维培养慢，但是研究期间一直保持稳定增殖率持续生长。为探究 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物对烫伤创面的修复情况，本研究通过开水接触烫伤法成功制备大鼠深Ⅱ度烫伤模型，将 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物运用于大鼠深Ⅱ度烫伤创面，观察其对创面修复的影响。结果显示其显著加速 SD 大鼠烫伤创面闭合；组织学观察示，相对于温敏 CSCl 凝胶组和对照组，ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物组创面上皮化加快、炎性细胞浸润较少；免疫组织化学染色法检测创面 CD31 表达，观察创面新生微血管密度，与既往研究结果相似，发现 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物组 CD31 阳性表达细胞数明显高于其他两组，表明 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物可以通过增加大鼠深Ⅱ度烧伤皮肤微血管数量来加速创面修复。至于 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物是通过分泌细胞因子还是诱导表皮细胞、血管内皮细胞分化来加速创面修复，有待后期进一步研究。
综上述，ADSCs/温敏 CSCl 凝胶复合物的成功制备为干细胞和皮肤组织工程研究在烧伤方面的运用提供了新的方向。通过初步探讨其促进烧伤创面修复的情况，发现 ADSCs/温敏 CSCl 凝胶可以通过加速创面上皮化、减少炎性细胞浸润及增加创面微血管等方式促进大鼠深Ⅱ度烫伤创面修复。
