引用本文： 朱立帆, 周建新, 曾金才, 张晓剑, 沈鹏程, 翁峰标. S100 钙结合蛋白 B 在骨性关节炎软骨损伤修复中的作用及机制研究. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(11): 1429-1434. doi: 10.7507/1002-1892.201804060 复制
骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种由于关节软骨变性、骨质增生而引起的慢性进行性骨关节疾病，其发病机制尚不明确[1]。流行病学研究显示[2]，55 岁以上人群发病率为 44%～70%，65 岁以上人群发病率高达 60%～70%。我国目前约有 1.5 亿 OA 患者，其中 50%～70% 患者急需治疗。所以有关 OA 发病机制的研究对于疾病的临床防治具有十分重要的意义。有研究认为滑膜炎性反应是 OA 发病的早期阶段，滑膜炎性反应时关节液中的炎性因子，如 IL-1β、TNF-α 等，能够引起软骨细胞肥大和细胞外基质降解，最终导致软骨破坏[3-4]；同时，滑膜成纤维细胞（synovial fibroblasts，SF）也被激活，其能够通过释放 FGF-2 与 FGF 受体 1（FGF receptor 1，FGFR1）相互作用，来激活多种信号通路，调节滑膜炎性反应，从而影响软骨损伤修复[5-6]。S100 钙结合蛋白 B（S100B）是 S100 钙结合蛋白家族成员之一，研究认为其与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关[7]。近年来有关 S100 家族分子与滑膜炎和 OA 之间的关系越来越多地被关注，但有关 S100B 在 OA 发生发展中作用的研究尚不多见。本研究拟通过在家兔软骨损伤诱发 OA 模型中检测 S100B、FGF-2 和 FGFR1 通路分子的蛋白和基因表达水平变化，明确是否 S100B、FGF-2 和 FGFR1 参与到软骨损伤的病理过程中，并在人 SF 中过表达和干扰 S100B 表达并拮抗 FGFR1，观察 S100B 对 IL-1β 和 TNF-α 表达水平及 FGFR1 分子表达水平的影响，以探讨 S100B 在 OA 软骨损伤修复中的作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康 4 月龄雌性新西兰兔 20 只，体质量 3.2～3.8 kg，购自上海中科院实验动物中心。
慢病毒细胞株（上海汉恒生物科技有限公司）；ELISA 检测试剂盒（R&D 公司，美国）；PrimeScript RT 试剂盒（Promega 公司，美国）；SYBR Premix Ex Taq（Takara 公司，日本）；蛋白裂解液（南通碧云天生物技术研究所）；anti-S100、anti-FGF-2 及 anti-FGFR1 单克隆抗体（Abcam 公司，美国）。ABI 7500 扩增仪（ABI 公司，美国）；倒置相差显微镜（Leica 公司，德国）。
1.2 体内实验评价兔OA炎症状态及FGF-2/FGFR1信号通路变化
1.2.1 兔软骨损伤模型制备及分组
取 20 只新西兰兔随机分为对照组和模型组，每组 10 只。模型组兔右膝关节管型石膏制动 4 周，对照组不作任何处理。4 周后分别取两组膝关节软骨组织及关节液用于后续检测。
1.2.2 ELISA法检测关节液IL-1β、TNF-α水平
通过在膝关节中注射 0.5 mL 生理盐水后抽吸获得两组关节液，共重复 3 次抽吸过程，随后将关节液以 2 200×g 离心 10 min 去除残留细胞。将获得的关节液参照 ELISA 试剂盒说明书方法检测 IL-1β 和 TNF-α 表达水平。
1.2.3 实时荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测软骨组织中S100B、FGF-2、FGFR1基因表达
从内侧股骨髁中间区域取两组软骨组织，经液氮研磨后，采用 Trizol 试剂抽提总 RNA，用 PrimeScript RT 试剂盒进行逆转录。PCR 反应条件：94℃、4 min，94℃、40 s，52℃、40 s，72℃、40 s，40 个循环。采用 SYBR Premix Ex Taq 在 ABI 7500 扩增仪上进行定量 PCR，PCR 结果采用 2-ΔΔCt法进行分析。引物序列见表 1。
表1
qRT-PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes in qRT-PCR test
1.2.4 Western blot检测软骨组织S100B、FGF-2、FGFR1蛋白表达
同上法取软骨组织经液氮研磨后，采用蛋白裂解液进行蛋白裂解，用 SDS-PAGE 电泳进行分析并转移至聚偏氟乙烯膜上，5% 脱脂牛奶封闭后，采用 anti-S100、anti-FGF-2 及 anti-FGFR1 单克隆抗体进行孵育，以 GAPDH 单克隆抗体作为内参。蛋白采用化学发光法进行检测，将获得的蛋白条带采用 Image J 软件进行定量分析。
1.3 体外实验评价细胞炎症状态及FGF-2/FGFR1信号通路的变化
1.3.1 人SF的分离培养
关节镜下取正常人外伤后膝关节滑膜组织，无菌条件下剪碎，0.25% 胰蛋白酶消化 5 min；FBS 终止消化，以 2 220×g 离心 5 min，弃上层液体，加入含 10%FBS 的 DMEM 培养液，100 目筛网过滤；调整细胞密度至 4×108个/L，转移至细胞培养瓶，37℃、5%CO2 培养箱中培养。隔 3 d 换液1 次，倒置相差显微镜下观察可见细胞呈均一贴壁样生长。当细胞生长至 85% 融合时，采用 0.25% 胰蛋白酶消化、传代。根据文献[8]方法，采用 Western blot 法检测细胞中 CD55 分子的表达，鉴定培养细胞为人 SF。将细胞进行传代实现 SF 的纯化，收集第 3～5 代细胞用于后续实验。
1.3.2 过表达或干扰S100B对人SF炎性因子表达及FGF-2/FGFR1信号通路的影响
将实验分为 4 组：A 组，人 SF 不作任何处理；B 组，采用对照病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L 脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激；C 组，采用 S100 过表达病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；D 组，采用 S100 干扰病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激。
操作步骤：取第 3～5 代人 SF，以每孔 1×105个细胞接种至 6 孔板，并在转染前 1 d 生长至融合度达 30%。将上述培养细胞按分组采用慢病毒转染实现 S100B 的过表达和干扰，具体转染方法参照上海汉恒生物科技有限公司说明书方法进行。各组培养 48 h 后，同上法采用 ELISA 检测细胞上清中 IL-1β、TNF-α 表达水平，采用 qRT-PCR 和 Western blot 分别检测人 SF 中 FGF-2、FGFR1 基因和蛋白表达。实验均重复 5 次，取均值。
1.3.3 拮抗FGFR1对人SF炎性因子表达及FGF-2/FGFR1信号通路的影响
将实验分为 4 组：A1 组，人 SF 不作任何处理；B1 组，采用对照病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；C1 组，采用 S100 过表达病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；D1 组：采用 S100 过表达及 FGFR1 干扰病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激。
操作步骤：取第 3～5 代人 SF，以每孔 1×105个细胞接种至 6 孔板，并在转染前 1 d 生长至融合度达 30%。将上述培养细胞按分组采用慢病毒转染实现 S100B 的过表达和 FGFR1 干扰，具体转染方法参照上海汉恒生物科技有限公司说明书方法进行。各组培养 48 h 后，同上法采用 ELISA 检测细胞上清中 IL-1β、TNF-α 表达水平，采用 qRT-PCR 和 Western blot 分别检测人 SF 中 FGFR1 基因和蛋白表达。实验均重复 5 次，取均值。
1.4 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 体内实验评价兔OA炎症状态及FGF-2/FGFR1信号通路变化
ELISA 检测示对照组和模型组兔关节液中 IL-1β 表达水平分别为（18.3±2.4）、（55.7±6.1）pg/mL，TNF-α 表达水平分别为（105.6±23.1）、（385.4±56.9）pg/mL，两组比较差异均有统计学意义（t=18.042，P=0.000；t=14.408，P=0.000）。
qRT-PCR 和 Western blot 检测示，模型组兔软骨组织 S100B、FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表达量均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 1。
图1
qRT-PCR和Western blot检测两组兔软骨组织各基因和蛋白表达
a. qRT-PCR 检测；b. Western blot 检测 1：对照组 2：模型组
Figure1. The expressions of genes and proteins in cartilage tissues of two groups of rabbits detected by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Control group 2: Model group
2.2 体外实验评价细胞炎症状态及FGF-2/FGFR1信号通路的变化
2.2.1 过表达或干扰S100B对人SF炎性因子分泌及FGF-2/FGFR1信号通路的影响
ELISA 检测示，B、C 组 IL-1β、TNF-α 表达水平显著高于 A、D 组，C 组高于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
ELISA检测各组IL-1β、TNF-α表达（n=5，pg/mL，
）
Table2.
Expressions of IL-1β and TNF-α tested by ELISA (n=5, pg/mL,
)
qRT-PCR 和 Western blot 检测示，B、C 组 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表达量均显著高于 A、D 组，C 组高于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；而 A、D 组FGF-2、 FGFR1 mRNA 和蛋白表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
图2
qRT-PCR和Western blot检测过表达或干扰S100B对人SF各基因和蛋白表达的影响
a. qRT-PCR 检测；b. Western blot 检测 1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组
Figure2. The effects of S100B overexpression or knockdown on human SF gene and protein expressions detectd by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
2.2.2 拮抗FGFR1对人SF炎性因子分泌及FGF-2/FGFR1信号通路的影响
ELISA 检测示，B1、C1 组 IL-1β、TNF-α 表达水平显著高于 A1、D1 组，C1 组高于 B1 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A1、D1 组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 3。
表3
ELISA检测各组IL-1β、TNF-α表达（n=5，pg/mL，
）
Table3.
Expressions of IL-1β and TNF-α detected by ELISA (n=5, pg/mL,
)
qRT-PCR 和 Western blot 检测示，B1、C1 组 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表达量均显著高于 A1、D1 组，C1 组高于 B1 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；D1 组 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表达量均显著低于 A1 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
qRT-PCR和Western blot检测拮抗FGFR1对人SF各基因和蛋白表达的影响
a. qRT-PCR 检测；b. Western blot 检测 1：A1 组 2：B1 组 3：C1 组 4：D1 组
Figure3. The effects of FGFR1 knockdown on human SF gene and protein expressions detected by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Group A1 2: Group B1 3: Group C1 4: Group D1
3 讨论
OA 临床上主要表现为关节疼痛、活动受限和畸形，致残率较高，严重影响患者生活质量。镇痛、抗炎药物是目前临床治疗 OA 的主要手段，然而这些药物仅能减轻患者痛苦，在延缓疾病进展上作用不大。晚期 OA 患者需行关节置换术。因此，探索 OA 的发病机制，寻找延缓或阻止其发生、发展的治疗靶点，对于疾病的早期防治至关重要。从解剖学特点来看，关节软骨内无血管、淋巴管和神经支配，主要靠关节腔内的滑膜液维持营养，所以损伤后较难修复。关节软骨机械磨损后启动了炎性介质介导的关节组织异常重建过程是导致 OA 的主要原因，该过程主要包括关节软骨细胞肥大和细胞外基质降解两方面[9]。S100B 是 S100 钙结合蛋白家族成员之一，在细胞的增殖、分化、凋亡中发挥重要作用。目前已有研究[10]表明 S100 家族的 S100A4、S100A8 和 S100A11 等参与了关节软骨损伤修复过程。
FGFs 家族包含 23 种，在胚胎发育和维持体内稳态平衡中起重要作用。其中 FGF-2 在多个组织中表达，既往研究认为 FGF-2 具有促进软骨细胞增殖和促进软骨修复的作用[11-12]。然而也有研究认为，FGF-2 的促细胞分裂作用并未致力于软骨细胞的再生，反而是参加了软骨基质的降解。Wang 等[13]发现 FGF-2 可通过 MEK/ERK 信号通路激活 RUNX2，从而上调 OA 患者关节软骨细胞金属基质蛋白酶 13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）的表达，促进细胞外基质降解。Schmal 等[14]发现 FGF-2 可降低关节软骨细胞中Ⅱ型胶原含量，导致软骨细胞纤维化。此外，FGF-2 还能通过 ERK1/2、p38、JNK 或 NF-κb/Elk-1 途径刺激关节软骨细胞 MMP-13 高表达[15-16]。FGFRs 属于酪氨酸蛋白激酶家族，是 FGFs 的受体。一般认为，FGFR1 和 FGFR3 是调节关节软骨代谢的关键受体。FGFR1 和 FGFR3 均能被 FGF-2 激活，Yan 等[17]认为 FGFR3 信号主要是促进关节软骨合成，而 FGFR1 信号主要是促进其降解。
鉴于以上结果，我们推测 S100B 可能在 OA 的发病过程中发挥重要作用，其可能作用机制是诱导 SF 分泌 FGF、IL-1β、TNF-α 等细胞因子，调节炎性反应而影响软骨损伤修复。因此，我们设想通过调节 SF 中 S100B 的表达，观察其对 FGF、FGFR1、IL-1β、TNF-α 等的影响，探讨其在关节软骨损伤修复中的作用。本研究结果发现，软骨损伤模型兔关节组织中 S100B、FGF-2、FGFR1 表达明显增加，关节液中 IL-1β、TNF-α 水平明显增加。提示 S100B、FGF-2、FGFR1、IL-1β、TNF-α 可能参与了 OA 软骨损伤修复的过程。推测其可能的作用机制是 S100B 诱导 SF 分泌 FGF 等细胞因子，与 FGFR1 受体结合并激活多种信号通路，调节 IL-1β、TNF-α 等炎性细胞因子的表达，调节滑膜炎性反应，从而参与 OA 软骨损伤修复。为进一步证实我们的推测，本研究体外培养人 SF，通过过表达、干扰 S100B 表达和拮抗 FGFR1 表达，观察其对关节软骨损伤修复的影响。结果显示，过表达 S100B 会使 FGFR1 表达增加，IL-1β、TNF-α 水平增加；干扰 S100B 表达，则 FGFR1 表达以及 IL-1β、TNF-α 水平均降低。过表达 S100B，同时拮抗 FGFR1 表达时，IL-1β、TNF-α 表达均降低。说明 S100B 是通过激活 FGF-2/FGFR1 信号通路而上调 IL-1β、TNF-α，从而加剧软骨损伤。所以，干扰 S100B 或拮抗 FGFR1 表达能够促进关节软骨损伤修复。
综上述，S100B 能够调节人 SF 炎性反应，进而影响 OA 软骨损伤修复，其机制可能与激活 FGF-2/FGFR1 信号通路有关。但本研究还存在一些局限性，实验样本局限于动物模型及细胞，未从软骨损伤患者中收集相关样本验证 S100B 的表达水平以及对 FGF-2/FGFR1 信号通路的影响。因此，需要进一步收集临床样本对本研究结果进行进一步确认。
骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种由于关节软骨变性、骨质增生而引起的慢性进行性骨关节疾病，其发病机制尚不明确[1]。流行病学研究显示[2]，55 岁以上人群发病率为 44%～70%，65 岁以上人群发病率高达 60%～70%。我国目前约有 1.5 亿 OA 患者，其中 50%～70% 患者急需治疗。所以有关 OA 发病机制的研究对于疾病的临床防治具有十分重要的意义。有研究认为滑膜炎性反应是 OA 发病的早期阶段，滑膜炎性反应时关节液中的炎性因子，如 IL-1β、TNF-α 等，能够引起软骨细胞肥大和细胞外基质降解，最终导致软骨破坏[3-4]；同时，滑膜成纤维细胞（synovial fibroblasts，SF）也被激活，其能够通过释放 FGF-2 与 FGF 受体 1（FGF receptor 1，FGFR1）相互作用，来激活多种信号通路，调节滑膜炎性反应，从而影响软骨损伤修复[5-6]。S100 钙结合蛋白 B（S100B）是 S100 钙结合蛋白家族成员之一，研究认为其与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关[7]。近年来有关 S100 家族分子与滑膜炎和 OA 之间的关系越来越多地被关注，但有关 S100B 在 OA 发生发展中作用的研究尚不多见。本研究拟通过在家兔软骨损伤诱发 OA 模型中检测 S100B、FGF-2 和 FGFR1 通路分子的蛋白和基因表达水平变化，明确是否 S100B、FGF-2 和 FGFR1 参与到软骨损伤的病理过程中，并在人 SF 中过表达和干扰 S100B 表达并拮抗 FGFR1，观察 S100B 对 IL-1β 和 TNF-α 表达水平及 FGFR1 分子表达水平的影响，以探讨 S100B 在 OA 软骨损伤修复中的作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康 4 月龄雌性新西兰兔 20 只，体质量 3.2～3.8 kg，购自上海中科院实验动物中心。
慢病毒细胞株（上海汉恒生物科技有限公司）；ELISA 检测试剂盒（R&D 公司，美国）；PrimeScript RT 试剂盒（Promega 公司，美国）；SYBR Premix Ex Taq（Takara 公司，日本）；蛋白裂解液（南通碧云天生物技术研究所）；anti-S100、anti-FGF-2 及 anti-FGFR1 单克隆抗体（Abcam 公司，美国）。ABI 7500 扩增仪（ABI 公司，美国）；倒置相差显微镜（Leica 公司，德国）。
1.2 体内实验评价兔OA炎症状态及FGF-2/FGFR1信号通路变化
1.2.1 兔软骨损伤模型制备及分组
取 20 只新西兰兔随机分为对照组和模型组，每组 10 只。模型组兔右膝关节管型石膏制动 4 周，对照组不作任何处理。4 周后分别取两组膝关节软骨组织及关节液用于后续检测。
1.2.2 ELISA法检测关节液IL-1β、TNF-α水平
通过在膝关节中注射 0.5 mL 生理盐水后抽吸获得两组关节液，共重复 3 次抽吸过程，随后将关节液以 2 200×g 离心 10 min 去除残留细胞。将获得的关节液参照 ELISA 试剂盒说明书方法检测 IL-1β 和 TNF-α 表达水平。
1.2.3 实时荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）检测软骨组织中S100B、FGF-2、FGFR1基因表达
从内侧股骨髁中间区域取两组软骨组织，经液氮研磨后，采用 Trizol 试剂抽提总 RNA，用 PrimeScript RT 试剂盒进行逆转录。PCR 反应条件：94℃、4 min，94℃、40 s，52℃、40 s，72℃、40 s，40 个循环。采用 SYBR Premix Ex Taq 在 ABI 7500 扩增仪上进行定量 PCR，PCR 结果采用 2-ΔΔCt法进行分析。引物序列见表 1。
表1
qRT-PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes in qRT-PCR test
1.2.4 Western blot检测软骨组织S100B、FGF-2、FGFR1蛋白表达
同上法取软骨组织经液氮研磨后，采用蛋白裂解液进行蛋白裂解，用 SDS-PAGE 电泳进行分析并转移至聚偏氟乙烯膜上，5% 脱脂牛奶封闭后，采用 anti-S100、anti-FGF-2 及 anti-FGFR1 单克隆抗体进行孵育，以 GAPDH 单克隆抗体作为内参。蛋白采用化学发光法进行检测，将获得的蛋白条带采用 Image J 软件进行定量分析。
1.3 体外实验评价细胞炎症状态及FGF-2/FGFR1信号通路的变化
1.3.1 人SF的分离培养
关节镜下取正常人外伤后膝关节滑膜组织，无菌条件下剪碎，0.25% 胰蛋白酶消化 5 min；FBS 终止消化，以 2 220×g 离心 5 min，弃上层液体，加入含 10%FBS 的 DMEM 培养液，100 目筛网过滤；调整细胞密度至 4×108个/L，转移至细胞培养瓶，37℃、5%CO2 培养箱中培养。隔 3 d 换液1 次，倒置相差显微镜下观察可见细胞呈均一贴壁样生长。当细胞生长至 85% 融合时，采用 0.25% 胰蛋白酶消化、传代。根据文献[8]方法，采用 Western blot 法检测细胞中 CD55 分子的表达，鉴定培养细胞为人 SF。将细胞进行传代实现 SF 的纯化，收集第 3～5 代细胞用于后续实验。
1.3.2 过表达或干扰S100B对人SF炎性因子表达及FGF-2/FGFR1信号通路的影响
将实验分为 4 组：A 组，人 SF 不作任何处理；B 组，采用对照病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L 脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激；C 组，采用 S100 过表达病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；D 组，采用 S100 干扰病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激。
操作步骤：取第 3～5 代人 SF，以每孔 1×105个细胞接种至 6 孔板，并在转染前 1 d 生长至融合度达 30%。将上述培养细胞按分组采用慢病毒转染实现 S100B 的过表达和干扰，具体转染方法参照上海汉恒生物科技有限公司说明书方法进行。各组培养 48 h 后，同上法采用 ELISA 检测细胞上清中 IL-1β、TNF-α 表达水平，采用 qRT-PCR 和 Western blot 分别检测人 SF 中 FGF-2、FGFR1 基因和蛋白表达。实验均重复 5 次，取均值。
1.3.3 拮抗FGFR1对人SF炎性因子表达及FGF-2/FGFR1信号通路的影响
将实验分为 4 组：A1 组，人 SF 不作任何处理；B1 组，采用对照病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；C1 组，采用 S100 过表达病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激；D1 组：采用 S100 过表达及 FGFR1 干扰病毒处理人 SF 后加入 20 μg/L LPS 刺激。
操作步骤：取第 3～5 代人 SF，以每孔 1×105个细胞接种至 6 孔板，并在转染前 1 d 生长至融合度达 30%。将上述培养细胞按分组采用慢病毒转染实现 S100B 的过表达和 FGFR1 干扰，具体转染方法参照上海汉恒生物科技有限公司说明书方法进行。各组培养 48 h 后，同上法采用 ELISA 检测细胞上清中 IL-1β、TNF-α 表达水平，采用 qRT-PCR 和 Western blot 分别检测人 SF 中 FGFR1 基因和蛋白表达。实验均重复 5 次，取均值。
1.4 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 体内实验评价兔OA炎症状态及FGF-2/FGFR1信号通路变化
ELISA 检测示对照组和模型组兔关节液中 IL-1β 表达水平分别为（18.3±2.4）、（55.7±6.1）pg/mL，TNF-α 表达水平分别为（105.6±23.1）、（385.4±56.9）pg/mL，两组比较差异均有统计学意义（t=18.042，P=0.000；t=14.408，P=0.000）。
qRT-PCR 和 Western blot 检测示，模型组兔软骨组织 S100B、FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表达量均显著高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 1。
图1
qRT-PCR和Western blot检测两组兔软骨组织各基因和蛋白表达
a. qRT-PCR 检测；b. Western blot 检测 1：对照组 2：模型组
Figure1. The expressions of genes and proteins in cartilage tissues of two groups of rabbits detected by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Control group 2: Model group
2.2 体外实验评价细胞炎症状态及FGF-2/FGFR1信号通路的变化
2.2.1 过表达或干扰S100B对人SF炎性因子分泌及FGF-2/FGFR1信号通路的影响
ELISA 检测示，B、C 组 IL-1β、TNF-α 表达水平显著高于 A、D 组，C 组高于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
ELISA检测各组IL-1β、TNF-α表达（n=5，pg/mL，
）
Table2.
Expressions of IL-1β and TNF-α tested by ELISA (n=5, pg/mL,
)
qRT-PCR 和 Western blot 检测示，B、C 组 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表达量均显著高于 A、D 组，C 组高于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；而 A、D 组FGF-2、 FGFR1 mRNA 和蛋白表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
图2
qRT-PCR和Western blot检测过表达或干扰S100B对人SF各基因和蛋白表达的影响
a. qRT-PCR 检测；b. Western blot 检测 1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组
Figure2. The effects of S100B overexpression or knockdown on human SF gene and protein expressions detectd by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
2.2.2 拮抗FGFR1对人SF炎性因子分泌及FGF-2/FGFR1信号通路的影响
ELISA 检测示，B1、C1 组 IL-1β、TNF-α 表达水平显著高于 A1、D1 组，C1 组高于 B1 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；A1、D1 组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表 3。
表3
ELISA检测各组IL-1β、TNF-α表达（n=5，pg/mL，
）
Table3.
Expressions of IL-1β and TNF-α detected by ELISA (n=5, pg/mL,
)
qRT-PCR 和 Western blot 检测示，B1、C1 组 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表达量均显著高于 A1、D1 组，C1 组高于 B1 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；D1 组 FGF-2、FGFR1 mRNA 和蛋白表达量均显著低于 A1 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
图3
qRT-PCR和Western blot检测拮抗FGFR1对人SF各基因和蛋白表达的影响
a. qRT-PCR 检测；b. Western blot 检测 1：A1 组 2：B1 组 3：C1 组 4：D1 组
Figure3. The effects of FGFR1 knockdown on human SF gene and protein expressions detected by qRT-PCR and Western blot assaya. qRT-PCR detection; b. Western blot detection 1: Group A1 2: Group B1 3: Group C1 4: Group D1
3 讨论
OA 临床上主要表现为关节疼痛、活动受限和畸形，致残率较高，严重影响患者生活质量。镇痛、抗炎药物是目前临床治疗 OA 的主要手段，然而这些药物仅能减轻患者痛苦，在延缓疾病进展上作用不大。晚期 OA 患者需行关节置换术。因此，探索 OA 的发病机制，寻找延缓或阻止其发生、发展的治疗靶点，对于疾病的早期防治至关重要。从解剖学特点来看，关节软骨内无血管、淋巴管和神经支配，主要靠关节腔内的滑膜液维持营养，所以损伤后较难修复。关节软骨机械磨损后启动了炎性介质介导的关节组织异常重建过程是导致 OA 的主要原因，该过程主要包括关节软骨细胞肥大和细胞外基质降解两方面[9]。S100B 是 S100 钙结合蛋白家族成员之一，在细胞的增殖、分化、凋亡中发挥重要作用。目前已有研究[10]表明 S100 家族的 S100A4、S100A8 和 S100A11 等参与了关节软骨损伤修复过程。
FGFs 家族包含 23 种，在胚胎发育和维持体内稳态平衡中起重要作用。其中 FGF-2 在多个组织中表达，既往研究认为 FGF-2 具有促进软骨细胞增殖和促进软骨修复的作用[11-12]。然而也有研究认为，FGF-2 的促细胞分裂作用并未致力于软骨细胞的再生，反而是参加了软骨基质的降解。Wang 等[13]发现 FGF-2 可通过 MEK/ERK 信号通路激活 RUNX2，从而上调 OA 患者关节软骨细胞金属基质蛋白酶 13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）的表达，促进细胞外基质降解。Schmal 等[14]发现 FGF-2 可降低关节软骨细胞中Ⅱ型胶原含量，导致软骨细胞纤维化。此外，FGF-2 还能通过 ERK1/2、p38、JNK 或 NF-κb/Elk-1 途径刺激关节软骨细胞 MMP-13 高表达[15-16]。FGFRs 属于酪氨酸蛋白激酶家族，是 FGFs 的受体。一般认为，FGFR1 和 FGFR3 是调节关节软骨代谢的关键受体。FGFR1 和 FGFR3 均能被 FGF-2 激活，Yan 等[17]认为 FGFR3 信号主要是促进关节软骨合成，而 FGFR1 信号主要是促进其降解。
鉴于以上结果，我们推测 S100B 可能在 OA 的发病过程中发挥重要作用，其可能作用机制是诱导 SF 分泌 FGF、IL-1β、TNF-α 等细胞因子，调节炎性反应而影响软骨损伤修复。因此，我们设想通过调节 SF 中 S100B 的表达，观察其对 FGF、FGFR1、IL-1β、TNF-α 等的影响，探讨其在关节软骨损伤修复中的作用。本研究结果发现，软骨损伤模型兔关节组织中 S100B、FGF-2、FGFR1 表达明显增加，关节液中 IL-1β、TNF-α 水平明显增加。提示 S100B、FGF-2、FGFR1、IL-1β、TNF-α 可能参与了 OA 软骨损伤修复的过程。推测其可能的作用机制是 S100B 诱导 SF 分泌 FGF 等细胞因子，与 FGFR1 受体结合并激活多种信号通路，调节 IL-1β、TNF-α 等炎性细胞因子的表达，调节滑膜炎性反应，从而参与 OA 软骨损伤修复。为进一步证实我们的推测，本研究体外培养人 SF，通过过表达、干扰 S100B 表达和拮抗 FGFR1 表达，观察其对关节软骨损伤修复的影响。结果显示，过表达 S100B 会使 FGFR1 表达增加，IL-1β、TNF-α 水平增加；干扰 S100B 表达，则 FGFR1 表达以及 IL-1β、TNF-α 水平均降低。过表达 S100B，同时拮抗 FGFR1 表达时，IL-1β、TNF-α 表达均降低。说明 S100B 是通过激活 FGF-2/FGFR1 信号通路而上调 IL-1β、TNF-α，从而加剧软骨损伤。所以，干扰 S100B 或拮抗 FGFR1 表达能够促进关节软骨损伤修复。
综上述，S100B 能够调节人 SF 炎性反应，进而影响 OA 软骨损伤修复，其机制可能与激活 FGF-2/FGFR1 信号通路有关。但本研究还存在一些局限性，实验样本局限于动物模型及细胞，未从软骨损伤患者中收集相关样本验证 S100B 的表达水平以及对 FGF-2/FGFR1 信号通路的影响。因此，需要进一步收集临床样本对本研究结果进行进一步确认。
