引用本文： 吴冰, 丘志河, 李盛, 梁达强, 许鉴, 钟名金, 陆伟, 王大平, 柳海峰, 朱伟民, 欧阳侃, 李皓. 自体腘绳肌腱移植重建前交叉韧带后移植物的组织学研究. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(7): 873-879. doi: 10.7507/1002-1892.201802001 复制
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）撕裂是常见的膝关节运动损伤，临床常用关节镜下自体腘绳肌腱移植重建手术进行治疗[1-4]。但文献报道该手术中长期失败率高达 5%～16%，二次损伤发生率达 3%～19%[5-9]。肌腱移植物在关节内通过一系列复杂变化转变成与正常 ACL 相似的组织结构，该过程被定义为 ACL 移植物塑形或韧带化[10-11]。根据移植物形态学变化特点，移植物塑形过程分为塑形早期、塑形期、塑形成熟期、塑形静止期 4 个阶段。其中，文献报道的塑形稳定期（包括塑形成熟期与静止期）时间为术后 9～36 个月，此时肌腱移植物组织学不会再发生明显改变[12-15]。研究发现，移植物塑形结果直接决定其生物力学特性，进而影响膝关节稳定性及运动功能[16-17]。术后 MRI 和二次关节镜探查可以为移植物塑形提供影像学和形态学的大体判断，但移植物在塑形稳定期的组织学特点仍然是判定移植物最终转归结果及关节功能恢复的金标准。
目前，大量研究主要从时间维度上对移植物组织学不同塑形阶段过程进行了纵向对比研究，根据不同塑形结果的人体 ACL 移植物组织学的横向对比研究较少，尤其是术后 4 年以上的远期随访病例。为此，经深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）医学伦理委员会批准，我们在关节镜下对塑形稳定期移植物进行评估，对评估为塑形良好（good remodeling group, GRG）与塑形不良（poor remodeling group，PRG）患者进行组织学对比研究，探索关节镜下不同评分状态的移植物的组织学结构特点，总结 ACL 移植物转归的组织学规律。
1 临床资料
1.1 研究对象选择及分组标准
以关节镜下应用自体腘绳肌腱单束重建 ACL 术后，为移除胫骨端内固定物于 2017 年 3 月—12 月行二次关节镜探查患者作为研究对象，患者均知情同意。纳入标准：① 关节镜下应用自体腘绳肌腱单束解剖位或过顶位重建 ACL 术后 4 年以上，腘绳肌腱编织为 4～8 股，两端高强线编织 2～3 cm，移植物直径 7.5～9.0 mm，长度 7～10 cm；股骨端带袢钛板（1.5～2.5 cm；Smith&Nephew 公司，美国）悬吊固定，胫骨端骨道内羟基磷灰石生物界面螺钉（Smith&Nephew 公司，美国）、骨道外门形钉双重固定。② 手术均由同一组医生完成，术后采用相同康复训练。③ 二次关节镜探查前，KT2000（MED metric 公司，美国）检查双侧膝关节前向位移差异≤5 mm；患膝关节 MRI 检查证实移植物连续性完整、无移植物缺失。④ 二次关节镜探查证实关节内移植物连续性完整且容量缺损≤30%。排除标准：① ACL 翻修者；② 单独使用或加用同种异体肌腱重建 ACL 者；③ 膝关节痛风性关节炎、类风湿性关节炎、结核性关节炎等慢性代谢或传染性关节病变。
二次关节镜手术时，由 2 位未参与 ACL 重建术的高年资医生分别对纳入研究患者的移植物进行评分。评分标准[18-19]：① 移植物滑膜及血管覆盖。A 级：移植物全部被滑膜覆盖，滑膜中有大量血管；B 级：移植物部分区域无滑膜覆盖，血管覆盖较少；C 级：移植物大部分或全部无滑膜覆盖，血管覆盖极少或缺失。② 移植物张力。A 级：移植物张力良好，从屈膝 0～90° 之间张力类似正常 ACL；B 级：轻度松弛，较正常 ACL 张力减小且部分区域存在移植物迂曲、松散表现；C 级：明显松弛，张力较正常 ACL 明显降低。③ 移植物容量及纤维再撕裂情况，反映移植物撞击情况。术中测量移植物绝对直径，并与重建手术时移植物直径进行对比，评估移植物容量减小比例。A 级：移植物无撕裂纤维，容量≥80%；B 级：移植物表面部分撕裂，移植物容量 30%～80%；C 级：移植物大部分撕裂，剩余纤维容量≤30%。以上 3 个指标中，A 级 2 分，B 级 1 分，C 级 0 分；其中移植物容量及再撕裂评分评定为 C 级者直接排除研究。总分为 4～6 分者归为 GRG，1～3 分者归为 PRG。
另取同期行人工全膝关节置换术且年龄<60 岁患者的正常 ACL 标本作为对照组。排除标准：60 岁以上老年严重骨关节炎患者、ACL 损伤患者、类风湿性膝关节炎、膝关节感染性疾病。
1.2 组织学观察
1.2.1 移植物取材
关节镜下使用 3 mm 篮钳从移植物关节内部分的中央区域纵向钳取移植物，移植物大小约 3 mm（厚度）×8 mm（长度），注意避开移植物撕裂或磨损区域，取样前先用探钩拉开移植物表面滑膜，并用射频切开部分滑膜，避免钳取滑膜组织。另外，用同样方法从人工全膝关节置换患者正常 ACL 钳取样本。样本分为 4 份，透射电镜送检样品 2 份，纵切面与横切面各 1 份，大小分别约 1 mm（厚度）×2 mm（长度）、2 mm（厚度）×1 mm（长度）；光镜送检样品 2 份，均是纵切片，大小 3 mm（厚度）×3 mm（长度）。
1.2.2 HE 染色观察
取样本经 10% 中性甲醛固定、乙醇脱水、三氯甲烷透明化处理后石蜡包埋，制备 5 μm 厚纵切片，HE 染色后光镜下观察。光镜下评估指标[20-21]：① 血管分布。0 分，丰富的血管分布，类似新鲜肉芽组织；1 分，肥厚性炎性血管增生；2 分：中等程度血管增生；3 分，少量血管分布；4 分：无血管分布。② 细胞形态。200 倍镜下，0 分，标本大部分或绝大部分为圆形细胞核；1 分，纺锤形细胞核为主，其次为圆形细胞核；2 分，纺锤形细胞核为主，其次为椭圆形细胞核；3 分，纺锤形细胞核为主，其次为线形细胞核；4 分，线形细胞核为主。
1.2.3 透射电镜观察
取标本固定于预冷的 4℃ 电镜固定液（2.5% 中性戊二醛），然后固定于 1.0% 四氧化锇固定液中，经乙醇脱水、丙酮浸透、树脂包埋。先行 5 μm 层厚组织切片及甲苯胺蓝染色，光镜下定位目标观测区域，然后再行 70 nm 层厚序贯切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色后，透射电镜观察。透射电镜下评估指标[12]：① 细胞合成代谢，反应胶原及其他蛋白合成代谢水平。0 分，细胞核体积远大于细胞质，核质比≥4，没有或有极少量细胞器；1 分，少量细胞质及细胞器，核质比为 2～4；2 分，中等量细胞质及细胞器，核质比为 1～2；3 分，较多的细胞质及细胞器，核质比为 0.5～1.0；4 分，大量细胞质及细胞器，核质比<0.5。② 胶原纤维分布：0 分，无大直径（≥100 nm）胶原纤维存在，小直径（≤100 nm）胶原纤维单峰分布；1 分，偶有少量大直径胶原纤维焦点状分布于小直径胶原纤维中；2 分，大直径胶原纤维局灶性分布，大、小胶原纤维混合呈双峰分布；3 分，同一视野下各区域均有较多大直径胶原纤维存在，大直径胶原纤维不均匀排列，大、小胶原纤维混合呈双峰分布；4 分，大量大直径胶原纤维规律地分布于小直径胶原纤维中，大、小胶原纤维混合呈双峰分布。
1.3 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用 LSD 检验，方差不齐时采用 Dunnett t 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验。计数资料组间比较采用 χ2 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 分组情况
共 18 例二次关节镜探查患者符合选择标准纳入研究，关节镜下移植物评分为 2～6 分，平均 4.7 分；其中 GRG 组 11 例、PRG 组 7 例。见图 1。GRG 组与 PRG 组患者年龄、性别、受伤至 ACL 重建术时间、ACL 重建术至二次关节镜手术时间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；国际膝关节文献委员会（IKDC）评分、胫骨前向位移双侧差异比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。对照组 9 例，男 6 例、女 3 例；年龄 48～59 岁，平均 54.6 岁。
表1
GRG 组及 PRG 组患者一般资料比较（
）
Table1.
Comparison of general data between GRG and PRG groups (
)
图1
不同塑形结果移植物关节镜二次探查及 MRI 检查
从左至右分别为关节镜及 MRI T1、T2 加权像图片 a. GRG 组；b. PRG 组
Figure1. The results of second-look arthroscopy and MRI of ACL grafts with different remodeling outcomesFrom left to right for arthroscopic image, and T1 and T2 of MRI images a. GRG group; b. PRG group
2.2 HE 染色观察
GRG 组：组织学特点类似于对照组正常 ACL 组织，表现为血管分布较少或无；胶原纤维呈紧密的束状、同向、均匀排列，同向波纹明显；组织以椭圆形纤维细胞为主，成纤维细胞少见，细胞与胶原纤维呈同轴性排列，细胞核以线形或纺锤形为主，椭圆形及圆形细胞核少见。PRG 组：胶原纤维排列较松散、无规律，同向波纹不明显，组织以多角形或星形成纤维细胞为主，细胞核主要呈椭圆形或圆形，线形及纺锤形细胞核少见。见图 2。
PRG 组血管分布及细胞形态评分均明显低于对照组及 GRG 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；GRG 组与对照组血管分布及细胞形态评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
2.3 透射电镜观察
透射电镜观察示，与正常 ACL 类似，所有重建的 ACL 移植物也表现为大直径胶原纤维与小直径胶原纤维双峰混合排列。对照组及 GRG 组大直径胶原纤维多，粗面内质网、线粒体、高尔基体、分泌小泡等细胞器较少；PRG 组小直径胶原纤维多，细胞质及粗面内质网、线粒体、高尔基体、分泌小泡等细胞器含量丰富。见图 3。
PRG 组胶原纤维分布评分明显低于对照组及 GRG 组，但细胞合成代谢评分明显高于对照组及 GRG 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；GRG 组细胞合成代谢评分与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），但胶原纤维分布评分明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
图2
HE 染色观察（×100）
从左至右分别为对照组、GRG 组、PRG 组 a. 血管分布（箭头）；b. 细胞形态
Figure2. Observation of HE staining (×100)From left to right for control group, GRG group and PRG group, respectively a. Graft vascularity (arrow); b. Graft cellular morphology
图3
透射电镜观察
从左至右分别为对照组、GRG 组、PRG 组 a. 细胞合成代谢（×5 000）；b. 胶原纤维分布（×50 k）
Figure3. Representative cellular ultrastructure under transmission electron microscopyFrom left to right for control group, GRG group, and PRG group, respectively a. Cell anabolism (×5 000); b. Collagen fibril distribution (×50 k)
表2
3 组组织学评分比较（
）
Table2.
Comparision of histologic scores between 3 groups (
)
3 讨论
3.1 ACL 移植物塑形与胶原纤维分布
自体腘绳肌腱因形态学、组织学及生物力学方面的优势，已成为最常用的 ACL 重建移植物来源[1-4, 22]。目前，各研究对移植物塑形成熟时间描述不尽相同，从术后 9 个月到术后 36 个月不等。虽然在塑形成熟的时间上，目前仍存在较大分歧，但绝大多数研究认为游离的移植肌腱不可能塑形成为正常 ACL 组织[12, 23-24]。本研究的透射电镜观察也得到类似结果，虽然在细胞合成代谢方面，GRG 组 ACL 组织与正常 ACL 无明显差异，但在胶原纤维分布特点上仍与正常 ACL 明显不同，表现为大直径胶原纤维颗粒的数量及比例明显低于正常 ACL。
既往研究发现，正常韧带与肌腱组织由大直径与小直径两种类型的胶原纤维组成，形成大、小直径胶原纤维双峰态分布模式，而大直径胶原纤维数量与移植物抗张力强度有直接关系[12, 22-27]。移植物塑形过程中，大直径胶原纤维会逐渐减少，最终 ACL 移植物中只有小直径胶原纤维呈单峰模式分布，而无大直径胶原纤维的存在[12, 22, 24]。本研究发现，GRG 组及 PRG 组移植物均存在大直径胶原纤维的分布，塑形成熟度越高的移植物组织，大直径胶原纤维含量越丰富，且分布越均匀，这与 Dong 等[21]的研究结果一致。
3.2 不同塑形结果的移植物细胞形态及细胞代谢差异
正常肌腱与韧带组织主要由椭圆形纤维细胞为主，较少多角形或星形成纤维细胞[12-15]。本研究发现，在塑形不良的移植物中，代谢活跃的成纤维细胞含量明显多于处于成熟的纤维细胞，而塑形良好的移植物组织类似于正常肌腱和韧带，以处于相对静止状态的纤维细胞数量为主。塑形不良的移植物组织中，胶原合成代谢明显高于正常 ACL 及塑形良好的移植物组织，这可能与炎性血管增生所导致的一系列炎性因子及生长因子的刺激有关[13, 21]，表现为细胞质与细胞核比率明显增高，线粒体、粗面内质网、高尔基体、分泌小泡等细胞器数量增多。
3.3 ACL 移植物塑形的“Wolf 定律”
本研究发现，塑形良好的移植物细胞合成代谢水平与正常 ACL 无明显差异，但此时大直径移植物胶原纤维含量仍低于正常 ACL。这从一个角度说明，移植物仍然无法塑形成为超微结构与正常 ACL 组织完全相同的结构。我们分析该现象可以从骨结构改建的 Wolf 定律加以解释：ACL 重建术后，由于重建的 ACL 与正常 ACL 的解剖学差异、膝关节运动方式的改变、ACL 移植物关节内撞击等因素，导致 ACL 移植物的局部生物力学环境较正常 ACL 发生改变，组织为适应这些差异表现出了不一样的生物学特性，比如与抗张力强度直接相关的大直径胶原纤维数量与分布方式的改变[26]。处于塑形成熟期或静止期的 ACL 移植物已经适应目前的膝关节生物力学环境，而维持相对稳定的组织学特性，但当移植物内部生物力学环境改变，比如膝关节运动方式改变引起移植物内部张力增高，甚至出现少部分纤维撕裂时，移植物可以改变目前的组织学“静止”状态而再次进入塑形阶段，类似于之前各阶段的塑形过程。这种组织学塑形改变的程度与由周围滑膜、脂肪垫等组织进入移植物的成纤维细胞及炎症血管数量及细胞代谢的活跃程度有关[10, 16]。因此，关节镜下移植物滑膜及血管组织覆盖为移植物塑形的再血管化及胶原代谢及改建提供了基础[12, 23]。但是该结论需要进一步的纵向长期研究进一步证实。
3.4 关节镜与光镜下移植物血管化评分差异
关节镜下移植物滑膜及血管组织覆盖程度低的组织往往被评估为移植物塑形不良[23-24]，但这与光镜下血管分布（移植物再血管化）结果不一致，因为既往研究及本研究均发现移植物内部再血管化程度与炎性反应程度成正相关，而炎性反应是移植物塑形过程具有代表性组织学变化之一，血管分布越广泛，表明移植物炎性反应程度越高，移植物组织塑形成熟度越低[13]。结合关节镜探查与光镜下血管分布结果，我们分析这种差异可能与移植物局部的生物学环境有关。由于骨道位置不合理、移植物撞击、康复锻炼激进等因素的影响，移植物局部纤维反复遭受微小撕裂创伤，对应的组织修复反应也越明显，而表现为移植物内部过度肥厚增生的血管组织。但由于移植物外部受到移植物解剖学位置的反复变动（骨道位置位置不正确）或周边其他结构的反复机械撞击（移植物撞击），塑形不良的移植物无法像处于解剖、生物力学环境相对稳定的塑形良好的组织一样，表面形成大量、稳定的滑膜及血管包绕，而在关节镜下表现为移植物表面滑膜及血管覆盖较少，但移植物表面这些滑膜已经足够为移植物内部的炎性反应提供充足的血管及细胞来源。
3.5 本研究不足
① 本研究是活体人体组织标本研究，受到标本取样量的限制，不能取整个韧带进行多处病理检查。因此，实验结果可能受取材部位差异的影响。② 对照组取材于人工全膝关节置换患者的正常 ACL，但这类患者年龄往往偏大，而 ACL 重建患者多为青壮年。因此，对照组结果可能不能完全反映人正常的 ACL 结构。③ 未考虑不同观察者之间的观察结果统计学差异。
前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）撕裂是常见的膝关节运动损伤，临床常用关节镜下自体腘绳肌腱移植重建手术进行治疗[1-4]。但文献报道该手术中长期失败率高达 5%～16%，二次损伤发生率达 3%～19%[5-9]。肌腱移植物在关节内通过一系列复杂变化转变成与正常 ACL 相似的组织结构，该过程被定义为 ACL 移植物塑形或韧带化[10-11]。根据移植物形态学变化特点，移植物塑形过程分为塑形早期、塑形期、塑形成熟期、塑形静止期 4 个阶段。其中，文献报道的塑形稳定期（包括塑形成熟期与静止期）时间为术后 9～36 个月，此时肌腱移植物组织学不会再发生明显改变[12-15]。研究发现，移植物塑形结果直接决定其生物力学特性，进而影响膝关节稳定性及运动功能[16-17]。术后 MRI 和二次关节镜探查可以为移植物塑形提供影像学和形态学的大体判断，但移植物在塑形稳定期的组织学特点仍然是判定移植物最终转归结果及关节功能恢复的金标准。
目前，大量研究主要从时间维度上对移植物组织学不同塑形阶段过程进行了纵向对比研究，根据不同塑形结果的人体 ACL 移植物组织学的横向对比研究较少，尤其是术后 4 年以上的远期随访病例。为此，经深圳大学第一附属医院（深圳市第二人民医院）医学伦理委员会批准，我们在关节镜下对塑形稳定期移植物进行评估，对评估为塑形良好（good remodeling group, GRG）与塑形不良（poor remodeling group，PRG）患者进行组织学对比研究，探索关节镜下不同评分状态的移植物的组织学结构特点，总结 ACL 移植物转归的组织学规律。
1 临床资料
1.1 研究对象选择及分组标准
以关节镜下应用自体腘绳肌腱单束重建 ACL 术后，为移除胫骨端内固定物于 2017 年 3 月—12 月行二次关节镜探查患者作为研究对象，患者均知情同意。纳入标准：① 关节镜下应用自体腘绳肌腱单束解剖位或过顶位重建 ACL 术后 4 年以上，腘绳肌腱编织为 4～8 股，两端高强线编织 2～3 cm，移植物直径 7.5～9.0 mm，长度 7～10 cm；股骨端带袢钛板（1.5～2.5 cm；Smith&Nephew 公司，美国）悬吊固定，胫骨端骨道内羟基磷灰石生物界面螺钉（Smith&Nephew 公司，美国）、骨道外门形钉双重固定。② 手术均由同一组医生完成，术后采用相同康复训练。③ 二次关节镜探查前，KT2000（MED metric 公司，美国）检查双侧膝关节前向位移差异≤5 mm；患膝关节 MRI 检查证实移植物连续性完整、无移植物缺失。④ 二次关节镜探查证实关节内移植物连续性完整且容量缺损≤30%。排除标准：① ACL 翻修者；② 单独使用或加用同种异体肌腱重建 ACL 者；③ 膝关节痛风性关节炎、类风湿性关节炎、结核性关节炎等慢性代谢或传染性关节病变。
二次关节镜手术时，由 2 位未参与 ACL 重建术的高年资医生分别对纳入研究患者的移植物进行评分。评分标准[18-19]：① 移植物滑膜及血管覆盖。A 级：移植物全部被滑膜覆盖，滑膜中有大量血管；B 级：移植物部分区域无滑膜覆盖，血管覆盖较少；C 级：移植物大部分或全部无滑膜覆盖，血管覆盖极少或缺失。② 移植物张力。A 级：移植物张力良好，从屈膝 0～90° 之间张力类似正常 ACL；B 级：轻度松弛，较正常 ACL 张力减小且部分区域存在移植物迂曲、松散表现；C 级：明显松弛，张力较正常 ACL 明显降低。③ 移植物容量及纤维再撕裂情况，反映移植物撞击情况。术中测量移植物绝对直径，并与重建手术时移植物直径进行对比，评估移植物容量减小比例。A 级：移植物无撕裂纤维，容量≥80%；B 级：移植物表面部分撕裂，移植物容量 30%～80%；C 级：移植物大部分撕裂，剩余纤维容量≤30%。以上 3 个指标中，A 级 2 分，B 级 1 分，C 级 0 分；其中移植物容量及再撕裂评分评定为 C 级者直接排除研究。总分为 4～6 分者归为 GRG，1～3 分者归为 PRG。
另取同期行人工全膝关节置换术且年龄<60 岁患者的正常 ACL 标本作为对照组。排除标准：60 岁以上老年严重骨关节炎患者、ACL 损伤患者、类风湿性膝关节炎、膝关节感染性疾病。
1.2 组织学观察
1.2.1 移植物取材
关节镜下使用 3 mm 篮钳从移植物关节内部分的中央区域纵向钳取移植物，移植物大小约 3 mm（厚度）×8 mm（长度），注意避开移植物撕裂或磨损区域，取样前先用探钩拉开移植物表面滑膜，并用射频切开部分滑膜，避免钳取滑膜组织。另外，用同样方法从人工全膝关节置换患者正常 ACL 钳取样本。样本分为 4 份，透射电镜送检样品 2 份，纵切面与横切面各 1 份，大小分别约 1 mm（厚度）×2 mm（长度）、2 mm（厚度）×1 mm（长度）；光镜送检样品 2 份，均是纵切片，大小 3 mm（厚度）×3 mm（长度）。
1.2.2 HE 染色观察
取样本经 10% 中性甲醛固定、乙醇脱水、三氯甲烷透明化处理后石蜡包埋，制备 5 μm 厚纵切片，HE 染色后光镜下观察。光镜下评估指标[20-21]：① 血管分布。0 分，丰富的血管分布，类似新鲜肉芽组织；1 分，肥厚性炎性血管增生；2 分：中等程度血管增生；3 分，少量血管分布；4 分：无血管分布。② 细胞形态。200 倍镜下，0 分，标本大部分或绝大部分为圆形细胞核；1 分，纺锤形细胞核为主，其次为圆形细胞核；2 分，纺锤形细胞核为主，其次为椭圆形细胞核；3 分，纺锤形细胞核为主，其次为线形细胞核；4 分，线形细胞核为主。
1.2.3 透射电镜观察
取标本固定于预冷的 4℃ 电镜固定液（2.5% 中性戊二醛），然后固定于 1.0% 四氧化锇固定液中，经乙醇脱水、丙酮浸透、树脂包埋。先行 5 μm 层厚组织切片及甲苯胺蓝染色，光镜下定位目标观测区域，然后再行 70 nm 层厚序贯切片，醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色后，透射电镜观察。透射电镜下评估指标[12]：① 细胞合成代谢，反应胶原及其他蛋白合成代谢水平。0 分，细胞核体积远大于细胞质，核质比≥4，没有或有极少量细胞器；1 分，少量细胞质及细胞器，核质比为 2～4；2 分，中等量细胞质及细胞器，核质比为 1～2；3 分，较多的细胞质及细胞器，核质比为 0.5～1.0；4 分，大量细胞质及细胞器，核质比<0.5。② 胶原纤维分布：0 分，无大直径（≥100 nm）胶原纤维存在，小直径（≤100 nm）胶原纤维单峰分布；1 分，偶有少量大直径胶原纤维焦点状分布于小直径胶原纤维中；2 分，大直径胶原纤维局灶性分布，大、小胶原纤维混合呈双峰分布；3 分，同一视野下各区域均有较多大直径胶原纤维存在，大直径胶原纤维不均匀排列，大、小胶原纤维混合呈双峰分布；4 分，大量大直径胶原纤维规律地分布于小直径胶原纤维中，大、小胶原纤维混合呈双峰分布。
1.3 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较采用 LSD 检验，方差不齐时采用 Dunnett t 检验；两组间比较采用独立样本 t 检验。计数资料组间比较采用 χ2 检验。检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 分组情况
共 18 例二次关节镜探查患者符合选择标准纳入研究，关节镜下移植物评分为 2～6 分，平均 4.7 分；其中 GRG 组 11 例、PRG 组 7 例。见图 1。GRG 组与 PRG 组患者年龄、性别、受伤至 ACL 重建术时间、ACL 重建术至二次关节镜手术时间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；国际膝关节文献委员会（IKDC）评分、胫骨前向位移双侧差异比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。对照组 9 例，男 6 例、女 3 例；年龄 48～59 岁，平均 54.6 岁。
表1
GRG 组及 PRG 组患者一般资料比较（
）
Table1.
Comparison of general data between GRG and PRG groups (
)
图1
不同塑形结果移植物关节镜二次探查及 MRI 检查
从左至右分别为关节镜及 MRI T1、T2 加权像图片 a. GRG 组；b. PRG 组
Figure1. The results of second-look arthroscopy and MRI of ACL grafts with different remodeling outcomesFrom left to right for arthroscopic image, and T1 and T2 of MRI images a. GRG group; b. PRG group
2.2 HE 染色观察
GRG 组：组织学特点类似于对照组正常 ACL 组织，表现为血管分布较少或无；胶原纤维呈紧密的束状、同向、均匀排列，同向波纹明显；组织以椭圆形纤维细胞为主，成纤维细胞少见，细胞与胶原纤维呈同轴性排列，细胞核以线形或纺锤形为主，椭圆形及圆形细胞核少见。PRG 组：胶原纤维排列较松散、无规律，同向波纹不明显，组织以多角形或星形成纤维细胞为主，细胞核主要呈椭圆形或圆形，线形及纺锤形细胞核少见。见图 2。
PRG 组血管分布及细胞形态评分均明显低于对照组及 GRG 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；GRG 组与对照组血管分布及细胞形态评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
2.3 透射电镜观察
透射电镜观察示，与正常 ACL 类似，所有重建的 ACL 移植物也表现为大直径胶原纤维与小直径胶原纤维双峰混合排列。对照组及 GRG 组大直径胶原纤维多，粗面内质网、线粒体、高尔基体、分泌小泡等细胞器较少；PRG 组小直径胶原纤维多，细胞质及粗面内质网、线粒体、高尔基体、分泌小泡等细胞器含量丰富。见图 3。
PRG 组胶原纤维分布评分明显低于对照组及 GRG 组，但细胞合成代谢评分明显高于对照组及 GRG 组，差异均有统计学意义（P<0.05）；GRG 组细胞合成代谢评分与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），但胶原纤维分布评分明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
图2
HE 染色观察（×100）
从左至右分别为对照组、GRG 组、PRG 组 a. 血管分布（箭头）；b. 细胞形态
Figure2. Observation of HE staining (×100)From left to right for control group, GRG group and PRG group, respectively a. Graft vascularity (arrow); b. Graft cellular morphology
图3
透射电镜观察
从左至右分别为对照组、GRG 组、PRG 组 a. 细胞合成代谢（×5 000）；b. 胶原纤维分布（×50 k）
Figure3. Representative cellular ultrastructure under transmission electron microscopyFrom left to right for control group, GRG group, and PRG group, respectively a. Cell anabolism (×5 000); b. Collagen fibril distribution (×50 k)
表2
3 组组织学评分比较（
）
Table2.
Comparision of histologic scores between 3 groups (
)
3 讨论
3.1 ACL 移植物塑形与胶原纤维分布
自体腘绳肌腱因形态学、组织学及生物力学方面的优势，已成为最常用的 ACL 重建移植物来源[1-4, 22]。目前，各研究对移植物塑形成熟时间描述不尽相同，从术后 9 个月到术后 36 个月不等。虽然在塑形成熟的时间上，目前仍存在较大分歧，但绝大多数研究认为游离的移植肌腱不可能塑形成为正常 ACL 组织[12, 23-24]。本研究的透射电镜观察也得到类似结果，虽然在细胞合成代谢方面，GRG 组 ACL 组织与正常 ACL 无明显差异，但在胶原纤维分布特点上仍与正常 ACL 明显不同，表现为大直径胶原纤维颗粒的数量及比例明显低于正常 ACL。
既往研究发现，正常韧带与肌腱组织由大直径与小直径两种类型的胶原纤维组成，形成大、小直径胶原纤维双峰态分布模式，而大直径胶原纤维数量与移植物抗张力强度有直接关系[12, 22-27]。移植物塑形过程中，大直径胶原纤维会逐渐减少，最终 ACL 移植物中只有小直径胶原纤维呈单峰模式分布，而无大直径胶原纤维的存在[12, 22, 24]。本研究发现，GRG 组及 PRG 组移植物均存在大直径胶原纤维的分布，塑形成熟度越高的移植物组织，大直径胶原纤维含量越丰富，且分布越均匀，这与 Dong 等[21]的研究结果一致。
3.2 不同塑形结果的移植物细胞形态及细胞代谢差异
正常肌腱与韧带组织主要由椭圆形纤维细胞为主，较少多角形或星形成纤维细胞[12-15]。本研究发现，在塑形不良的移植物中，代谢活跃的成纤维细胞含量明显多于处于成熟的纤维细胞，而塑形良好的移植物组织类似于正常肌腱和韧带，以处于相对静止状态的纤维细胞数量为主。塑形不良的移植物组织中，胶原合成代谢明显高于正常 ACL 及塑形良好的移植物组织，这可能与炎性血管增生所导致的一系列炎性因子及生长因子的刺激有关[13, 21]，表现为细胞质与细胞核比率明显增高，线粒体、粗面内质网、高尔基体、分泌小泡等细胞器数量增多。
3.3 ACL 移植物塑形的“Wolf 定律”
本研究发现，塑形良好的移植物细胞合成代谢水平与正常 ACL 无明显差异，但此时大直径移植物胶原纤维含量仍低于正常 ACL。这从一个角度说明，移植物仍然无法塑形成为超微结构与正常 ACL 组织完全相同的结构。我们分析该现象可以从骨结构改建的 Wolf 定律加以解释：ACL 重建术后，由于重建的 ACL 与正常 ACL 的解剖学差异、膝关节运动方式的改变、ACL 移植物关节内撞击等因素，导致 ACL 移植物的局部生物力学环境较正常 ACL 发生改变，组织为适应这些差异表现出了不一样的生物学特性，比如与抗张力强度直接相关的大直径胶原纤维数量与分布方式的改变[26]。处于塑形成熟期或静止期的 ACL 移植物已经适应目前的膝关节生物力学环境，而维持相对稳定的组织学特性，但当移植物内部生物力学环境改变，比如膝关节运动方式改变引起移植物内部张力增高，甚至出现少部分纤维撕裂时，移植物可以改变目前的组织学“静止”状态而再次进入塑形阶段，类似于之前各阶段的塑形过程。这种组织学塑形改变的程度与由周围滑膜、脂肪垫等组织进入移植物的成纤维细胞及炎症血管数量及细胞代谢的活跃程度有关[10, 16]。因此，关节镜下移植物滑膜及血管组织覆盖为移植物塑形的再血管化及胶原代谢及改建提供了基础[12, 23]。但是该结论需要进一步的纵向长期研究进一步证实。
3.4 关节镜与光镜下移植物血管化评分差异
关节镜下移植物滑膜及血管组织覆盖程度低的组织往往被评估为移植物塑形不良[23-24]，但这与光镜下血管分布（移植物再血管化）结果不一致，因为既往研究及本研究均发现移植物内部再血管化程度与炎性反应程度成正相关，而炎性反应是移植物塑形过程具有代表性组织学变化之一，血管分布越广泛，表明移植物炎性反应程度越高，移植物组织塑形成熟度越低[13]。结合关节镜探查与光镜下血管分布结果，我们分析这种差异可能与移植物局部的生物学环境有关。由于骨道位置不合理、移植物撞击、康复锻炼激进等因素的影响，移植物局部纤维反复遭受微小撕裂创伤，对应的组织修复反应也越明显，而表现为移植物内部过度肥厚增生的血管组织。但由于移植物外部受到移植物解剖学位置的反复变动（骨道位置位置不正确）或周边其他结构的反复机械撞击（移植物撞击），塑形不良的移植物无法像处于解剖、生物力学环境相对稳定的塑形良好的组织一样，表面形成大量、稳定的滑膜及血管包绕，而在关节镜下表现为移植物表面滑膜及血管覆盖较少，但移植物表面这些滑膜已经足够为移植物内部的炎性反应提供充足的血管及细胞来源。
3.5 本研究不足
① 本研究是活体人体组织标本研究，受到标本取样量的限制，不能取整个韧带进行多处病理检查。因此，实验结果可能受取材部位差异的影响。② 对照组取材于人工全膝关节置换患者的正常 ACL，但这类患者年龄往往偏大，而 ACL 重建患者多为青壮年。因此，对照组结果可能不能完全反映人正常的 ACL 结构。③ 未考虑不同观察者之间的观察结果统计学差异。
