引用本文： 葛礼豪, 于德水, 苏瑞超, 曹阳. 缺氧诱导因子 1α 对人羊膜间充质干细胞耐受缺氧能力影响的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(3): 264-269. doi: 10.7507/1002-1892.201710104 复制
人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）移植能促进脊髓损伤神经功能恢复，既往研究发现其主要通过提高 VEGF 和 BDNF 表达，促进血管和神经再生来改善脊髓损伤后神经功能的恢复[1]。近年研究发现，脊髓损伤动物模型体内移植 hAMSCs 后，hAMSCs 具有明显的耐受缺氧能力，同时能显著减少脊髓组织梗死和继发性神经元的损伤[2-3]。这为采用 hAMSCs 移植治疗脊髓损伤提供了新的理论依据。然而如何提高 hAMSCs 耐受缺氧的能力，目前少有报道。缺氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）是目前发现的唯一一个高度特异性的、在缺氧条件下能够发挥活性的核转录因子，是专一调节氧稳态的重要介质，同时参与调控 MSCs 增殖、凋亡和耐受缺氧等作用[4]。研究发现，HIF-1α 可提高 BMSCs 耐受缺氧的能力[5]。我们分析 HIF-1α 可能是调节 hAMSCs 耐受缺氧能力的重要转录因子之一。本研究通过转染 HIF-1α 基因，观察缺氧处理后 hAMSCs 的成活与凋亡情况，以探讨 HIF-1α 基因对 hAMSCs 耐受缺氧能力的影响。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂、仪器
羊膜组织取自锦州医科大学附属第一医院 10 例健康剖宫产产妇，经医院伦理委员会批准使用，产妇均知情同意。
胶原酶Ⅳ（Sigma 公司，美国）；兔抗人 HIF-1α 单克隆抗体（Abcam 公司，英国）；兔抗人 B 细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bax、活化型半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3，C-Caspase-3）多克隆抗体（Absci 公司，美国）；质粒（上海吉玛制药技术有限公司）；LipofectamineTM3000（Invitrogen 公司，美国）；实时荧光定量 PCR 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）试剂盒（Dojindo 公司，日本）；AnnexinV-PE-7AAD 试剂盒（天津三箭生物技术股份有限公司）。CO2 培养箱（Thermo Fisher 公司，美国）；CKX-31 倒置相差显微镜、IX-71 倒置荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；Tecan Infinite M200 多功能酶标仪（Tecan 公司，瑞士）；实时荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）；流式细胞仪（Roche 公司，瑞士）。
1.2 hAMSCs 分离、培养及鉴定
参照文献[6]报道的 hAMSCs 分离方法并加以改进。取羊膜组织，剪碎至约 1 mm×1 mm 大小，0.25% 胰蛋白酶消化 10 min 后，200 目细胞筛过滤，加入 1 mg/mL 胶原酶Ⅳ，37℃ 消化 1 h；再次过滤，滤液以离心半径 25 cm、1 500 r/min 离心 5 min，重复 2 次，收集细胞。加入含 10%FBS、1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F12 培养基，37℃、5%CO2 孵箱培养。3 d 后换液，之后隔天换液，约 10 d 细胞密度达 80%～90% 时进行传代培养。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。取第 3 代 hAMSCs，参照文献[7]方法采用免疫荧光法检测干细胞标志物 OCT-4、NANOG 的表达。
1.3 实验分组及方法
实验分为 5 组：A 组为 hAMSCs 空白组，不进行任何处理；B 组为 pcDNA3.1 阴性对照组，细胞转染 pcDNA3.1 过表达空载质粒；C 组为 shRNA 阴性对照组，细胞转染 shRNA 干扰空载质粒；D 组为 shRNA-HIF-1α 干扰组，细胞转染 shRNA-HIF-1α 干扰质粒；E 组为 pcDNA3.1-HIF-1α 过表达组，细胞转染 pcDNA3.1-HIF-1α 过表达质粒。具体操作：参照文献[8]方法，取第 3 代 hAMSCs，经 200 μmol/L CoCl2 缺氧处理 12、24、48 h 后，按以上分组瞬时转染相应质粒，将质粒和 LipofectamineTM3000 复合物轻轻吹打混匀，均匀缓慢加入培养皿中，37℃、5%CO2 孵育 10 min，备用。
1.4 观测指标
1.4.1 CCK-8 法检测细胞成活率
各组分别于缺氧处理后 12、24、48 h，每孔加入 10 μL CCK-8 细胞计数试剂，37℃、5%CO2 孵育 4 h 后，于 540 nm 波长下测定各孔吸光度（A）值，按以下公式计算各组细胞成活率：各组 A 值/A 组 A 值。比较不同时间点处理后细胞成活率，选择成活率最高的时间点细胞进行流式细胞术以及Western blot检测。
1.4.2 流式细胞术检测细胞凋亡率
参照1.4.1观测结果，各组取对应时间点细胞，消化、收集后调整细胞密度为 1×105个/mL，常规采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。
1.4.3 Western blot 检测 HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Bax、C-Caspase-3 蛋白表达
参照1.4.1观测结果，各组取对应时间点细胞消化、收集，冰上裂解、匀浆、离心、取上清弃沉淀、测定蛋白含量。等量蛋白（10 μg）样本上样，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，湿转法至聚偏氟乙烯膜上，5% 牛血清白蛋白封闭 1 h；加入兔抗人 HIF-1α（1∶1 000）抗体，兔抗人 VEGF、Bcl-2、Bax、C-Caspase-3 抗体（1∶500），4℃ 孵育过夜，TBST 洗 3 次；加入山羊抗兔 IgG 二抗（1∶5 000）室温孵育 2 h，TBST 漂洗；化学发光试剂 ECL 发光，显影。以内参 β-actin 为对照，Gel-Pro Analyzer 软件分析 HIF-1α 与 β-actin 的积分吸光度（IA）值的比值，表示 HIF-1α 蛋白相对表达量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hAMSCs 形态观察及鉴定
培养 3 d，倒置相差显微镜下可见少量 hAMSCs 贴壁，呈长梭形，其中混杂有椭圆形人羊膜上皮细胞；7 d 后细胞开始增殖并形成细胞集落，呈放射状或漩涡状分布；14 d 后细胞达 80%～90% 融合。传代后，细胞增殖速度加快，2～3 d 即可长满培养瓶底；随着传代代数增加，细胞形态较一致，并呈漩涡状或放射状排列生长。见图 1。
细胞免疫荧光法检测示，细胞核中可见 OCT-4、NANOG 表达，提示所培养细胞为 hAMSCs。见图 2。
2.2 hAMSCs 缺氧处理后相关观测
2.2.1 CCK-8 法检测细胞成活率
缺氧处理后 12、24、48 h，与 A、C 组比较，D 组细胞成活率明显降低；与 A、B 组比较，E 组细胞成活率明显升高；其中 24 h 时组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。E 组组内比较，与 12、48 h 比较，24 h 时细胞成活率明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），12、48 h 间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。根据比较结果，选择缺氧处理后 24 h 细胞进行下一步检测。
2.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡率
缺氧处理后 24 h，A～E 组细胞凋亡率分别为 2.80%±0.28%、3.75%±0.35%、3.60%±0.26%、8.56%±0.94%、1.90%±0.14%。与 A、C 组比较，D 组细胞凋亡率显著升高，与 A、B 组比较，E 组细胞凋亡率显著下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
2.2.3 Western blot 检测细胞各蛋白表达
缺氧处理后 24 h，与 A、C 组比较，D 组细胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表达明显减少，Bax、C-Caspase-3 蛋白表达明显增加，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；而 E 组结果相反，与 A、B 组比较，E 组细胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表达明显增加，Bax、C-Caspase-3 蛋白表达明显减少，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5、6。
图1
第 3 代 hAMSCs 形态观察（倒置相差显微镜×10）
Figure1.
Morphological observation of the third generation hAMSCs (Inverted phase contrast microscope×10)
图2
免疫荧光法鉴定 OCT-4、NANOG 在 hAMSCs 中的表达（荧光显微镜×20）
从左至右依次为 DAPI、FITC、二者重叠 a. OCT-4；b. NANOG
Figure2. Expressions of OCT-4 and NANOG in hAMSCs by immunofluorescence assay (Fluorescence microscope×20)From left to right for DAPI, FITC, and merge, respectively a. OCT-4; b. NANOG
图3
CCK-8 法检测各时间点各组细胞成活率
Figure3.
The survival rate of each group at different time points detected by CCK-8 method
图4
流式细胞仪检测各组缺氧处理后 24 h 细胞凋亡率
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure4. The apoptosis rate of cells at 24 hours after hypoxia treatment by flow cytometrya. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D;e. Group E
图5
Western blot 检测各组缺氧处理后 24 h 各蛋白表达
Mr：相对分子质量 1: A组 2：B组 3：C组 4：D组 5：E组 a. HIF-1α、VEGF；b. Bcl-2、Bax 和 C-Caspase-3
Figure5. Protein expressions of each group at 24 hours after hypoxia treatment by Western blotMr:Relative molecular mass1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group Ea. HIF-1α and VEGF; b. Bcl-2, Bax, and C-Caspase-3
图6
Western blot 检测各组缺氧处理后 24 h 各蛋白相对表达量
Figure6.
The relative expression of protein in each group at 24 hours after hypoxia treatment by Western blot
3 讨论
hAMSCs 移植治疗脊髓损伤成为近年研究热点，主要原因是 hAMSCs 属于多能干细胞，能调节机体免疫功能、避免同种异体移植的免疫排斥反应[9]，且其不具有成瘤性，安全性好[10]；同时，hAMSCs 在缺氧条件下具有更强的繁殖能力，在损伤的脊髓组织中能长期存活[11]。而 hAMSCs 繁殖和存活能力是治疗脊髓损伤的关键因素之一。hAMSCs 繁殖和存活能力主要与 MSCs 的耐受缺氧能力相关[12]。研究证实在缺氧条件下，MSCs 氧自由基减少，对细胞的破坏作用降低或减弱，同时持续 HIF-1α 的表达并诱导相关生长因子表达，促进缺氧区域新生血管形成，增加细胞对缺氧的耐受能力[13]。
HIF-1α 是调控缺氧效应的一类极为重要的转录因子，其分布和作用十分广泛，可通过调控下游靶基因来增强 MSCs 对缺氧的耐受性[14]。VEGF 是目前最强的促血管生成因子，也是 HIF-1α 重要的靶基因。已有研究证实 VEGF 具有抗凋亡和促进血管新生的作用[15]。在脑缺血动物模型中发现，缺血区 HIF-1α 表达上调的同时 VEGF 表达亦增加，从而促进血管生成来对抗缺血缺氧性损伤；而通过实验干预减少 HIF-1α 的降解，则能诱导 VEGF 表达上调，减少神经细胞凋亡，促进新生血管形成，增强细胞耐受缺氧能力[16-17]。本实验对 hAMSCs 缺氧处理后检测各组细胞成活率，发现 A 组高于 B、C 组，这可能与 B、C 组 hAMSCs 受损程度及 HIF-1α 未明显表达有关。E 组 HIF-1α 高表达时 hAMSCs 成活率明显升高，而 D 组 hAMSCs 成活率明显下降，提示 HIF-1α 基因参与调控 hAMSCs 的成活能力。实验结果还显示，hAMSCs 成活率有时间依赖性，24 h 时明显高于其他时间点，提示缺氧时间对 hAMSCs 成活率有干预作用。Western blot 结果显示，在 E 组中 HIF-1α 和 VEGF 蛋白表达水平同步增加，而 D 组同步减少。表明 HIF-1α 表达上调的同时 VEGF 表达增多，促进新生血管生成，参与了 hAMSCs 成活能力的调节作用。
HIF-1α 还参与了细胞凋亡的调控，其机制主要是缺氧条件下促进 HIF-1α 表达，从而使 VEGF 上调，激活 PI3K-Akt 通路，增加细胞活性及血管通透性，降低细胞凋亡[18]。其中 PI3K-Akt-HIF 通路的激活促进抗凋亡因子（如 Bcl-2）表达，同时抑制促凋亡因子（如 Bax）的表达[19]。Bcl-2 和 Bax 是调节细胞凋亡的两个重要相关基因，它们通过激活一系列下游基因在细胞凋亡中发挥作用。研究表明[20]在脑缺血再灌注损伤中，Bcl-2 过表达能抑制细胞凋亡，Bax 过表达可通过抑制 Bcl-2 的作用而促使细胞凋亡。Bcl-2/Bax 蛋白表达比例也是决定细胞凋亡的关键，当比例增大时细胞凋亡受抑制，反之则促进凋亡[21]。本实验 Western blot 结果显示，E 组 HIF-1α 蛋白表达增加的同时 Bcl-2 蛋白表达增加，Bax 蛋白表达降低，Bcl-2/Bax 比例变大，提示 HIF-1α 过表达对 hAMSCs 的 Bcl-2 和 Bax 表达水平具有明显调节作用。干预 C-Caspase-3 的激活，可有效抑制细胞凋亡的发生[22]。E 组 HIF-1α 蛋白表达增加而 C-Caspase-3 蛋白表达降低，活性减弱，提示 HIF-1α 过表达对 C-Caspase-3 蛋白的表达水平具有调节作用。流式细胞仪检测结果示，E 组 hAMSCs 凋亡率明显降低，提示 HIF-1α 基因高表达可降低 hAMSCs 凋亡。上述结果表明，HIF-1α 表达上调同时 VEGF 表达也增多，可促进 Bcl-2 表达并抑制 Bax 表达，降低 C-Caspase-3 活性，从而增强 hAMSCs 抗凋亡能力。
综上述，hAMSCs 缺氧处理后 HIF-1α 基因过表达可提高其细胞成活及抗凋亡能力，改善 hAMSCs 耐受缺氧的能力，其可能机制与上调 VEGF 和相关凋亡基因 Bcl-2 表达及下调 Bax 和 C-Caspase-3 表达作用相关。
人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）移植能促进脊髓损伤神经功能恢复，既往研究发现其主要通过提高 VEGF 和 BDNF 表达，促进血管和神经再生来改善脊髓损伤后神经功能的恢复[1]。近年研究发现，脊髓损伤动物模型体内移植 hAMSCs 后，hAMSCs 具有明显的耐受缺氧能力，同时能显著减少脊髓组织梗死和继发性神经元的损伤[2-3]。这为采用 hAMSCs 移植治疗脊髓损伤提供了新的理论依据。然而如何提高 hAMSCs 耐受缺氧的能力，目前少有报道。缺氧诱导因子 1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）是目前发现的唯一一个高度特异性的、在缺氧条件下能够发挥活性的核转录因子，是专一调节氧稳态的重要介质，同时参与调控 MSCs 增殖、凋亡和耐受缺氧等作用[4]。研究发现，HIF-1α 可提高 BMSCs 耐受缺氧的能力[5]。我们分析 HIF-1α 可能是调节 hAMSCs 耐受缺氧能力的重要转录因子之一。本研究通过转染 HIF-1α 基因，观察缺氧处理后 hAMSCs 的成活与凋亡情况，以探讨 HIF-1α 基因对 hAMSCs 耐受缺氧能力的影响。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂、仪器
羊膜组织取自锦州医科大学附属第一医院 10 例健康剖宫产产妇，经医院伦理委员会批准使用，产妇均知情同意。
胶原酶Ⅳ（Sigma 公司，美国）；兔抗人 HIF-1α 单克隆抗体（Abcam 公司，英国）；兔抗人 B 细胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bax、活化型半胱天冬酶-3（cleaved Caspase-3，C-Caspase-3）多克隆抗体（Absci 公司，美国）；质粒（上海吉玛制药技术有限公司）；LipofectamineTM3000（Invitrogen 公司，美国）；实时荧光定量 PCR 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）试剂盒（Dojindo 公司，日本）；AnnexinV-PE-7AAD 试剂盒（天津三箭生物技术股份有限公司）。CO2 培养箱（Thermo Fisher 公司，美国）；CKX-31 倒置相差显微镜、IX-71 倒置荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；Tecan Infinite M200 多功能酶标仪（Tecan 公司，瑞士）；实时荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）；流式细胞仪（Roche 公司，瑞士）。
1.2 hAMSCs 分离、培养及鉴定
参照文献[6]报道的 hAMSCs 分离方法并加以改进。取羊膜组织，剪碎至约 1 mm×1 mm 大小，0.25% 胰蛋白酶消化 10 min 后，200 目细胞筛过滤，加入 1 mg/mL 胶原酶Ⅳ，37℃ 消化 1 h；再次过滤，滤液以离心半径 25 cm、1 500 r/min 离心 5 min，重复 2 次，收集细胞。加入含 10%FBS、1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F12 培养基，37℃、5%CO2 孵箱培养。3 d 后换液，之后隔天换液，约 10 d 细胞密度达 80%～90% 时进行传代培养。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。取第 3 代 hAMSCs，参照文献[7]方法采用免疫荧光法检测干细胞标志物 OCT-4、NANOG 的表达。
1.3 实验分组及方法
实验分为 5 组：A 组为 hAMSCs 空白组，不进行任何处理；B 组为 pcDNA3.1 阴性对照组，细胞转染 pcDNA3.1 过表达空载质粒；C 组为 shRNA 阴性对照组，细胞转染 shRNA 干扰空载质粒；D 组为 shRNA-HIF-1α 干扰组，细胞转染 shRNA-HIF-1α 干扰质粒；E 组为 pcDNA3.1-HIF-1α 过表达组，细胞转染 pcDNA3.1-HIF-1α 过表达质粒。具体操作：参照文献[8]方法，取第 3 代 hAMSCs，经 200 μmol/L CoCl2 缺氧处理 12、24、48 h 后，按以上分组瞬时转染相应质粒，将质粒和 LipofectamineTM3000 复合物轻轻吹打混匀，均匀缓慢加入培养皿中，37℃、5%CO2 孵育 10 min，备用。
1.4 观测指标
1.4.1 CCK-8 法检测细胞成活率
各组分别于缺氧处理后 12、24、48 h，每孔加入 10 μL CCK-8 细胞计数试剂，37℃、5%CO2 孵育 4 h 后，于 540 nm 波长下测定各孔吸光度（A）值，按以下公式计算各组细胞成活率：各组 A 值/A 组 A 值。比较不同时间点处理后细胞成活率，选择成活率最高的时间点细胞进行流式细胞术以及Western blot检测。
1.4.2 流式细胞术检测细胞凋亡率
参照1.4.1观测结果，各组取对应时间点细胞，消化、收集后调整细胞密度为 1×105个/mL，常规采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。
1.4.3 Western blot 检测 HIF-1α、VEGF、Bcl-2、Bax、C-Caspase-3 蛋白表达
参照1.4.1观测结果，各组取对应时间点细胞消化、收集，冰上裂解、匀浆、离心、取上清弃沉淀、测定蛋白含量。等量蛋白（10 μg）样本上样，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，湿转法至聚偏氟乙烯膜上，5% 牛血清白蛋白封闭 1 h；加入兔抗人 HIF-1α（1∶1 000）抗体，兔抗人 VEGF、Bcl-2、Bax、C-Caspase-3 抗体（1∶500），4℃ 孵育过夜，TBST 洗 3 次；加入山羊抗兔 IgG 二抗（1∶5 000）室温孵育 2 h，TBST 漂洗；化学发光试剂 ECL 发光，显影。以内参 β-actin 为对照，Gel-Pro Analyzer 软件分析 HIF-1α 与 β-actin 的积分吸光度（IA）值的比值，表示 HIF-1α 蛋白相对表达量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hAMSCs 形态观察及鉴定
培养 3 d，倒置相差显微镜下可见少量 hAMSCs 贴壁，呈长梭形，其中混杂有椭圆形人羊膜上皮细胞；7 d 后细胞开始增殖并形成细胞集落，呈放射状或漩涡状分布；14 d 后细胞达 80%～90% 融合。传代后，细胞增殖速度加快，2～3 d 即可长满培养瓶底；随着传代代数增加，细胞形态较一致，并呈漩涡状或放射状排列生长。见图 1。
细胞免疫荧光法检测示，细胞核中可见 OCT-4、NANOG 表达，提示所培养细胞为 hAMSCs。见图 2。
2.2 hAMSCs 缺氧处理后相关观测
2.2.1 CCK-8 法检测细胞成活率
缺氧处理后 12、24、48 h，与 A、C 组比较，D 组细胞成活率明显降低；与 A、B 组比较，E 组细胞成活率明显升高；其中 24 h 时组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。E 组组内比较，与 12、48 h 比较，24 h 时细胞成活率明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），12、48 h 间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。根据比较结果，选择缺氧处理后 24 h 细胞进行下一步检测。
2.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡率
缺氧处理后 24 h，A～E 组细胞凋亡率分别为 2.80%±0.28%、3.75%±0.35%、3.60%±0.26%、8.56%±0.94%、1.90%±0.14%。与 A、C 组比较，D 组细胞凋亡率显著升高，与 A、B 组比较，E 组细胞凋亡率显著下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
2.2.3 Western blot 检测细胞各蛋白表达
缺氧处理后 24 h，与 A、C 组比较，D 组细胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表达明显减少，Bax、C-Caspase-3 蛋白表达明显增加，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；而 E 组结果相反，与 A、B 组比较，E 组细胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表达明显增加，Bax、C-Caspase-3 蛋白表达明显减少，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 5、6。
图1
第 3 代 hAMSCs 形态观察（倒置相差显微镜×10）
Figure1.
Morphological observation of the third generation hAMSCs (Inverted phase contrast microscope×10)
图2
免疫荧光法鉴定 OCT-4、NANOG 在 hAMSCs 中的表达（荧光显微镜×20）
从左至右依次为 DAPI、FITC、二者重叠 a. OCT-4；b. NANOG
Figure2. Expressions of OCT-4 and NANOG in hAMSCs by immunofluorescence assay (Fluorescence microscope×20)From left to right for DAPI, FITC, and merge, respectively a. OCT-4; b. NANOG
图3
CCK-8 法检测各时间点各组细胞成活率
Figure3.
The survival rate of each group at different time points detected by CCK-8 method
图4
流式细胞仪检测各组缺氧处理后 24 h 细胞凋亡率
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure4. The apoptosis rate of cells at 24 hours after hypoxia treatment by flow cytometrya. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D;e. Group E
图5
Western blot 检测各组缺氧处理后 24 h 各蛋白表达
Mr：相对分子质量 1: A组 2：B组 3：C组 4：D组 5：E组 a. HIF-1α、VEGF；b. Bcl-2、Bax 和 C-Caspase-3
Figure5. Protein expressions of each group at 24 hours after hypoxia treatment by Western blotMr:Relative molecular mass1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group Ea. HIF-1α and VEGF; b. Bcl-2, Bax, and C-Caspase-3
图6
Western blot 检测各组缺氧处理后 24 h 各蛋白相对表达量
Figure6.
The relative expression of protein in each group at 24 hours after hypoxia treatment by Western blot
3 讨论
hAMSCs 移植治疗脊髓损伤成为近年研究热点，主要原因是 hAMSCs 属于多能干细胞，能调节机体免疫功能、避免同种异体移植的免疫排斥反应[9]，且其不具有成瘤性，安全性好[10]；同时，hAMSCs 在缺氧条件下具有更强的繁殖能力，在损伤的脊髓组织中能长期存活[11]。而 hAMSCs 繁殖和存活能力是治疗脊髓损伤的关键因素之一。hAMSCs 繁殖和存活能力主要与 MSCs 的耐受缺氧能力相关[12]。研究证实在缺氧条件下，MSCs 氧自由基减少，对细胞的破坏作用降低或减弱，同时持续 HIF-1α 的表达并诱导相关生长因子表达，促进缺氧区域新生血管形成，增加细胞对缺氧的耐受能力[13]。
HIF-1α 是调控缺氧效应的一类极为重要的转录因子，其分布和作用十分广泛，可通过调控下游靶基因来增强 MSCs 对缺氧的耐受性[14]。VEGF 是目前最强的促血管生成因子，也是 HIF-1α 重要的靶基因。已有研究证实 VEGF 具有抗凋亡和促进血管新生的作用[15]。在脑缺血动物模型中发现，缺血区 HIF-1α 表达上调的同时 VEGF 表达亦增加，从而促进血管生成来对抗缺血缺氧性损伤；而通过实验干预减少 HIF-1α 的降解，则能诱导 VEGF 表达上调，减少神经细胞凋亡，促进新生血管形成，增强细胞耐受缺氧能力[16-17]。本实验对 hAMSCs 缺氧处理后检测各组细胞成活率，发现 A 组高于 B、C 组，这可能与 B、C 组 hAMSCs 受损程度及 HIF-1α 未明显表达有关。E 组 HIF-1α 高表达时 hAMSCs 成活率明显升高，而 D 组 hAMSCs 成活率明显下降，提示 HIF-1α 基因参与调控 hAMSCs 的成活能力。实验结果还显示，hAMSCs 成活率有时间依赖性，24 h 时明显高于其他时间点，提示缺氧时间对 hAMSCs 成活率有干预作用。Western blot 结果显示，在 E 组中 HIF-1α 和 VEGF 蛋白表达水平同步增加，而 D 组同步减少。表明 HIF-1α 表达上调的同时 VEGF 表达增多，促进新生血管生成，参与了 hAMSCs 成活能力的调节作用。
HIF-1α 还参与了细胞凋亡的调控，其机制主要是缺氧条件下促进 HIF-1α 表达，从而使 VEGF 上调，激活 PI3K-Akt 通路，增加细胞活性及血管通透性，降低细胞凋亡[18]。其中 PI3K-Akt-HIF 通路的激活促进抗凋亡因子（如 Bcl-2）表达，同时抑制促凋亡因子（如 Bax）的表达[19]。Bcl-2 和 Bax 是调节细胞凋亡的两个重要相关基因，它们通过激活一系列下游基因在细胞凋亡中发挥作用。研究表明[20]在脑缺血再灌注损伤中，Bcl-2 过表达能抑制细胞凋亡，Bax 过表达可通过抑制 Bcl-2 的作用而促使细胞凋亡。Bcl-2/Bax 蛋白表达比例也是决定细胞凋亡的关键，当比例增大时细胞凋亡受抑制，反之则促进凋亡[21]。本实验 Western blot 结果显示，E 组 HIF-1α 蛋白表达增加的同时 Bcl-2 蛋白表达增加，Bax 蛋白表达降低，Bcl-2/Bax 比例变大，提示 HIF-1α 过表达对 hAMSCs 的 Bcl-2 和 Bax 表达水平具有明显调节作用。干预 C-Caspase-3 的激活，可有效抑制细胞凋亡的发生[22]。E 组 HIF-1α 蛋白表达增加而 C-Caspase-3 蛋白表达降低，活性减弱，提示 HIF-1α 过表达对 C-Caspase-3 蛋白的表达水平具有调节作用。流式细胞仪检测结果示，E 组 hAMSCs 凋亡率明显降低，提示 HIF-1α 基因高表达可降低 hAMSCs 凋亡。上述结果表明，HIF-1α 表达上调同时 VEGF 表达也增多，可促进 Bcl-2 表达并抑制 Bax 表达，降低 C-Caspase-3 活性，从而增强 hAMSCs 抗凋亡能力。
综上述，hAMSCs 缺氧处理后 HIF-1α 基因过表达可提高其细胞成活及抗凋亡能力，改善 hAMSCs 耐受缺氧的能力，其可能机制与上调 VEGF 和相关凋亡基因 Bcl-2 表达及下调 Bax 和 C-Caspase-3 表达作用相关。
