引用本文： 潘枢, 刘星辰, 史宏灿. 脱细胞气管基质材料的免疫原性及生物相容性研究. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(4): 441-447. doi: 10.7507/1002-1892.201710007 复制
气管病变主要由先天狭窄、感染、创伤、肿瘤等引起，气管切除并端端吻合是其治疗“金标准”，但若病变切除范围超过成人气管总长度的 1/2 或儿童的 1/3，则需要替代物来重建气道的连续性[1]。理想的气管替代物应具有密封性、无免疫原性、利于细胞贴附生长等性能[2]。近年来，利用组织工程学原理和技术体外构建出具有生物活性及一定生理功能的仿生材料，作为移植物修复气管缺损逐渐成为研究热点[3]。脱细胞技术目前被广泛应用于组织工程气管基质材料的制备[4]。然而，传统脱细胞方法由于去除了大部分气管软骨细胞，使其生物学性能发生改变，导致移植术后发生移植物塌陷而狭窄[5]。同时，有关研究表明软骨细胞对维持气管的三维管状结构具有重要意义[6]。
高氯酸盐离子是一种常用的活性氧化剂，常作为一个电解液介质，可用于 DNA 提取和分子生物学领域的杂交反应。高氯酸钠（NaClO4）作为一种温和的脱细胞方法，可以保留基质内的软骨细胞[7-8]。本实验通过评估经 NaClO4 制备的脱细胞气管基质材料的生物相容性及其免疫原性，为组织工程同种异体气管移植研究提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2 月龄健康新西兰兔 3 只，雌雄不限，体质量 200～300 g；6 月龄成年健康新西兰兔 20 只，雌雄不限，体质量 2.0～2.5 kg；均由扬州大学实验动物中心提供。
NaClO4（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；HE 染液、MTT 试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；戊巴比妥（Sigma 公司，美国）；低分子肝素钠（深圳天道医药有限公司）；DMEM-F12、0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA（HyClone 公司，美国）；FBS（北京全球康生物科技公司）；4% 多聚甲醛、Giemsa 染料（北京索莱宝科技有限公司）；青霉素、链霉素、两性霉素 B（上海生工生物工程有限公司）；NaCl、KCl、K2HPO4、Na2HPO4（天津科密欧化学试剂公司）。
正置显微镜（Olympus 公司，日本）；Leica CM-1990 冷冻切片机（Leica 公司，德国）；正置免疫荧光显微镜、TS100 倒置显微镜（Nikon 公司，日本）；酶标仪（BioTAK 公司，美国）；S-4800 场发射扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；CO2 培养箱、台式离心机（Hereaus 公司，德国）；恒温震荡培养箱（太仓市实验设备厂）；CA-1480-2 垂直层流洁净工作台（上海上净净化设备有限公司）；MP200A 型电子天平（上海第二平衡器厂）；MILi-Qso 型纯水器（MiliPore 公司，美国）；压力蒸汽灭菌（嘉兴中新医疗器械公司）。
1.2 BMSCs 分离、培养及传代
取 2 月龄新西兰兔，空气栓塞法处死。用 18 号骨髓穿刺针于胫骨平台处进行穿刺，用经肝素冲洗过的注射器抽取骨髓约 1 mL。按本研究小组既往的实验方法[9]，采用全骨髓贴壁筛选法进行 BMSCs 的分离、培养及传代。取生长状态良好的第 4 代 BMSCs 用于后续实验。
1.3 气管支架制备及相关检测
1.3.1 实验分组及气管支架制备
取 10 只 6 月龄成年新西兰兔，空气栓塞法处死，在外科标准无菌操作下获取气管。随机分为 2 组，每组 5 只。对照组（A1 组）仅剥离气管外表面疏松结缔组织。实验组（B1 组）在剥离气管外表面疏松结缔组织基础上，参照本研究小组改良的 NaClO4 浸泡法[10]对气管进行脱细胞处理：将气管置于 4℃ 蒸馏水渗透溶解 48 h，然后以 5%NaClO4 浸泡 72 h，置于含 1% 双抗的 PBS 缓冲液中 4℃ 保存待测。
1.3.2 浸提液细胞毒性实验
无菌操作下将 A1 组和 B1 组气管支架组织剪成 2 mm×2 mm 大小。按 10 mL/cm2 表面积加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养液，37℃ 震荡 24 h；混悬液以离心半径 15 cm、500 r/min 离心 10 min，将上清液移至离心管中保存。同时以含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养液为阴性对照组（C1 组），以含 50 g/L 苯酚、10%FBS 的 DMEM/F12 培养基为阳性对照组（D1 组）。取第 4 代 BMSCs，达 80% 融合时消化计数；然后将约含 5×103个细胞的细胞悬液（200 μL）接种至 96 孔板中，置于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养 24 h 后，更换为上述各组浸提液，之后每 48 小时换液。培养 1、3、5、7 d 后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/mL，用 PBS 配制，pH7.4）10 μL，利用酶标仪测定各孔 490 nm 处吸光度（A）值，绘制细胞生长曲线。
1.3.3 免疫组织化学染色观察主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）类抗原表达
将 A1 组和 B1 组气管标本行 4 μm 厚冰冻切片，多聚甲醛固定后，正常山羊血清工作液封闭，加一抗（鼠抗兔 MHC-Ⅰ和Ⅱ抗体，稀释浓度 1∶200）4℃ 过夜，滴加二抗（山羊抗鼠 IgG）后 DAB 显色，苏木素复染，二甲苯透明后封片，正置显微镜下观察材料 MHC-Ⅰ和Ⅱ抗原的表达。
1.4 细胞-气管支架复合物的制备及相关观测
1.4.1 细胞-气管支架复合物制备及细胞活性观察
将 A1 组和 B1 组气管支架在无菌环境中修剪成 0.5 cm×0.5 cm 大小的片状组织，然后贴于 24 孔板底中央，气管外壁朝上；吸走周围 PBS 液，置于超净台中干燥 2 h，向组织片中滴加含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养基直至覆盖组织片，滴加过程避免组织片漂浮。将 24 孔培养板移至细胞培养箱，37℃、5%CO2、饱和湿度下孵育 24 h 后，吸去培养基。取生长状态良好的第 4 代 BMSCs，达 80% 融合时消化计数，然后将含有 2.5×104个细胞的细胞悬液接种至两组气管组织片的外壁上，置于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养。48 h 后取出行 Giemsa 染色，倒置显微镜下观察，根据细胞生长形态及状况判断材料毒性。
1.4.2 扫描电镜观察
两组细胞-气管支架复合物组织片培养 7、14 d 后取出，2.5% 戊二醛溶液固定 24 h；PBS 漂洗，梯度乙醇脱水，加入乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）及纯戊酯各 30 min，干燥后喷金，扫描电镜观察支架外表面的细胞状态。
1.5 同种异体动物体内实验
1.5.1 气管支架手术埋植
取 6 月龄成年新西兰兔 10 只，随机分为 2 组，每组 5 只。以戊巴比妥钠（3 mg/mL）耳缘静脉注射麻醉，颈背部备皮切开，游离皮下浅筋膜，分离脊柱一侧，形成皮囊。对照组（A2 组）植入新鲜气管支架，实验组（B2 组）植入脱细胞气管支架，随后常规缝合。术后观察实验动物炎性反应、排斥反应和一般健康状态（包括饮食、体质量、活动等情况）。
1.5.2 血液免疫球蛋白动态分析
术后 5、10、15、20、25、30 d，于耳缘静脉处采血留取标本，采用 ELISA 法评估受体血清免疫球蛋白 IgM 和 IgG 含量的动态变化。
1.5.3 HE 染色观察
术后 30 d 空气栓塞法处死两组动物，获取气管支架材料。室温下 10% 中性甲醛固定 24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，行常规 HE 染色观察。
1.6 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 气管支架相关观测
2.1.1 浸提液细胞毒性实验
各时间点 D1 组细胞均无成活。与 C1 组比较，虽然 A1 组和 B1 组细胞增殖稍低，但各时间点 3 组间 A 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 1。
2.1.2 免疫组织化学染色观察 MHC 类抗原表达
A1 组气管支架中，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗原在上皮层、黏膜层及黏膜下层细胞表达呈强阳性，在软骨膜部表达呈阳性，而在软骨细胞及细胞外基质结构均呈阴性；而 B1 组气管支架中，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗原在细胞外基质表达均呈阴性，仅在软骨细胞核表达呈阳性。见图 2。
2.2 细胞-气管支架复合物相关观测
2.2.1 细胞活性观察
培养 48 h 后 Giemsa 染色示，A1 组材料周围的细胞贴壁生长、增殖良好，未见悬浮细胞；B1 组材料周围的细胞在形态和密度上与 A 组比较无明显差别。见图 3。
2.2.2 扫描电镜观察
培养 7、14 d，细胞在 A1 组气管支架材料外壁上贴附良好，呈扁平的圆形、椭圆形，细胞排列紧密，成簇分布；细胞在 B1 组气管支架材料外壁上呈单片状生长，形态与 A1 组相似，生长趋势较 A1 组好。见图 4。
2.3 同种异体动物体内实验
2.3.1 大体观察
所有实验动物术后 30 d 内表现健康，体质量有所增加；伤口均愈合良好。30 d 时 A2 组气管支架周围包绕炎性结缔组织，并与受植床粘连，不易剥离；囊状的新鲜气管内有大量脓液积聚，破坏了正常气管的解剖结构。而 B2 组气管支架周围包绕的结缔组织较薄，无明显排斥反应迹象；气管支架表面有新生血管形成。见图 5。
2.3.2 血液免疫球蛋白动态分析
术后两组 IgM 及 IgG 表达均逐渐增加，分别于 15 d 和 20 d 达峰值，后逐渐下降，符合体液免疫应答抗体产生的规律。术后各时间点 A2 组 IgM 和 IgG 含量均显著高于 B2 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 6。
2.3.3 HE 染色观察
术后 30 d A2 组支架材料外表面炎性细胞浸润较多，腺体结构缺失，软骨组织皆不同程度被破坏；B2 组未见炎性细胞深层渗透或破坏气管结构，软骨细胞形态无异常，未见钙化、排斥等不良反应。见图 7。
图1
MTT 法检测各时间点各组浸提液中细胞活性
Figure1.
The cell activity in the leach liquor in each group at diffe rent time points detected by MTT assay
图2
免疫组织化学染色观察两组气管支架材料 MHC 类抗原表达（正置显微镜×200）
a. A1 组 MHC-Ⅰ抗原表达；b. B1 组 MHC-Ⅰ抗原表达；c. A1 组 MHC-Ⅱ抗原表达；d. B1 组 MHC-Ⅱ抗原表达
Figure2. Expression of MHC antigen in tracheal matrixs in 2 groups by immunohistochemical staining observation (Upright microscope×200)a. Expression of MHC-Ⅰ antigen in group A1; b. Expression of MHC-Ⅰ antigen in group B1; c. Expression of MHC-Ⅱ antigen in group A1; d. Expression of MHC-Ⅱ antigen in group B1
图3
两组细胞-气管支架复合物培养 48 h 后 Giemsa 染色观察（倒置显微镜×100）
a. A1 组；b. B1 组
Figure3. Giemsa staining observation of cell-trachea scaffold complex in 2 groups after cultured for 48 hours (Inverted microscope×100)a. Group A1; b. Group B1
图4
培养各时间点两组细胞-气管支架材料扫描电镜观察（×5 000）
a. A1 组培养 7 d；b. A1 组培养 14 d；c. B1 组培养 7 d；d. B1 组培养 14 d
Figure4. Scanning electron microscope observation of cell-trachea scaffold complex in 2 groups after cultured for different time points (×5 000)a. Group A1 at 7 days; b. Group A1 at 14 days; c. Group B1 at 7 days; d. Group B1 at 14 days
图5
术后 30 d 两组气管支架大体观察
a. A2 组；b. B2 组
Figure5. Macroscopic observation of the tracheal scaffolds at 30 days after operationa. Group A2; b. Group B2
图6
术后各时间点两组血液免疫球蛋白动态分析
a. IgM；b. IgG
Figure6. Dynamic analysis of the blood immunoglobulin at each time point after operationa. IgM; b. IgG
图7
术后 30 d 两组 HE 染色观察（×200）
a. A2 组；b. B2 组
Figure7. HE staining observation of 2 groups at 30 days after operation (×200)a. Group A2; b. Group B2
3 讨论
细胞外基质是组织工程的重要组成部分，研究证实细胞外基质会影响细胞增殖、迁移、分化，最终促进组织再生和重塑[11-12]。脱细胞基质材料含有天然的细胞外基质成分，不会释放有毒的可降解产物或引起炎性反应[13]。由于细胞外基质对于组织再生起着至关重要的作用，所以选择合适的脱细胞方案尤为重要[14]。目前临床应用的脱氧胆酸钠联合酶法对人、猪、鼠气管分别需要 25、17、5 个循环，才能获得低免疫原性的脱细胞基质[15]，该方法所需时间长，程序繁琐，也增加了基质感染的风险[16]。
要成为可应用于临床的组织工程气管支架材料，必须能支持种子细胞生长、分化。本实验将 BMSCs 接种至脱细胞气管支架外壁上进行体外培养，并观察细胞的黏附、生长情况。结果显示，BMSCs 在脱细胞气管支架外壁上贴附良好，细胞呈扁平的圆形、椭圆形，排列紧密，成簇分布。因此我们推断 NaClO4 脱细胞基质能为 BMSCs 提供一个良好的黏附界面，同时也能支持细胞的生长。脱细胞使用的 NaClO4 作为一种化学试剂，如果其在支架材料中残存浓度较高，对接种的细胞或宿主也会造成一定程度影响。本实验发现脱细胞气管支架浸提液中的细胞增殖情况与基础培养液相比，差异无统计学意义，说明支架材料中没有引起细胞活性降低的成分，提示此材料对细胞无明显毒性。
众所周知，同种异体移植后若不使用免疫抑制剂，往往发生排斥反应。同种异体移植排斥反应的细胞学基础是移植物 MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ抗原的表达，以激活宿主 CD4+T 细胞和 CTL 细胞。相关研究证明 MHC 类抗原的分布主要集中于黏膜表面的上皮、黏膜下腺和软骨膜，而不是在软骨细胞或软骨基质，表明黏膜、黏膜下腺、软骨膜是主要引起移植排斥反应的抗原结构[15, 17-19]。细胞外基质通过扩散来营养其中的软骨细胞，而且由于软骨细胞的新陈代谢需求低，可以在宿主体内存活[20]。同时，有研究提出软骨作为一种“免疫豁免”组织，可逐渐被宿主自身的软骨细胞替代[21]。Delaere 等[22]研究也发现位于软骨陷窝内的软骨细胞，由于缺乏直接血管，并且周围基质中包裹有胶原-蛋白质-多糖的细胞外基质作为物理隔离，从而使软骨细胞不被宿主的免疫系统识别。基于这些研究结果，我们提出了这种保留软骨细胞的结构完整、低免疫原性的优化脱细胞方案。与传统方法相比，该方法处理周期快，且较好地保留了细胞外基质成分，以满足组织工程重建需求。
研究显示，软骨基质内的软骨细胞在合成和分泌软骨基质和胶原纤维中发挥重要作用，而且有活性的软骨细胞对保持气管基质材料的三维结构也是至关重要的[3, 17-19]。脱细胞的概念是为了减少免疫原性细胞的数量，而不是完全消除所有细胞。我们进行了同种异体埋植实验，来验证这种保留软骨细胞基质材料的免疫原特性，并且术后未使用免疫抑制治疗。结果表明本实验的脱细胞方法制备的基质材料并未引起移植物的排斥反应。
综上述，本研究中我们通过将细胞-脱细胞气管支架进行体外培养，初步判断采用改良 NaClO4 脱细胞法获得的脱细胞气管支架具有良好的生物相容性，能够支持种子细胞的黏附和生长；并且在动物体内埋植实验中验证了软骨细胞的“免疫豁免”特性。该方案简化了脱细胞过程并节约了成本和时间，为同种异体气管移植提供了一种新思路。今后需在提高脱细胞材料行体内原位移植的远期效果方面做出更多改进。
气管病变主要由先天狭窄、感染、创伤、肿瘤等引起，气管切除并端端吻合是其治疗“金标准”，但若病变切除范围超过成人气管总长度的 1/2 或儿童的 1/3，则需要替代物来重建气道的连续性[1]。理想的气管替代物应具有密封性、无免疫原性、利于细胞贴附生长等性能[2]。近年来，利用组织工程学原理和技术体外构建出具有生物活性及一定生理功能的仿生材料，作为移植物修复气管缺损逐渐成为研究热点[3]。脱细胞技术目前被广泛应用于组织工程气管基质材料的制备[4]。然而，传统脱细胞方法由于去除了大部分气管软骨细胞，使其生物学性能发生改变，导致移植术后发生移植物塌陷而狭窄[5]。同时，有关研究表明软骨细胞对维持气管的三维管状结构具有重要意义[6]。
高氯酸盐离子是一种常用的活性氧化剂，常作为一个电解液介质，可用于 DNA 提取和分子生物学领域的杂交反应。高氯酸钠（NaClO4）作为一种温和的脱细胞方法，可以保留基质内的软骨细胞[7-8]。本实验通过评估经 NaClO4 制备的脱细胞气管基质材料的生物相容性及其免疫原性，为组织工程同种异体气管移植研究提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2 月龄健康新西兰兔 3 只，雌雄不限，体质量 200～300 g；6 月龄成年健康新西兰兔 20 只，雌雄不限，体质量 2.0～2.5 kg；均由扬州大学实验动物中心提供。
NaClO4（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；HE 染液、MTT 试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；戊巴比妥（Sigma 公司，美国）；低分子肝素钠（深圳天道医药有限公司）；DMEM-F12、0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA（HyClone 公司，美国）；FBS（北京全球康生物科技公司）；4% 多聚甲醛、Giemsa 染料（北京索莱宝科技有限公司）；青霉素、链霉素、两性霉素 B（上海生工生物工程有限公司）；NaCl、KCl、K2HPO4、Na2HPO4（天津科密欧化学试剂公司）。
正置显微镜（Olympus 公司，日本）；Leica CM-1990 冷冻切片机（Leica 公司，德国）；正置免疫荧光显微镜、TS100 倒置显微镜（Nikon 公司，日本）；酶标仪（BioTAK 公司，美国）；S-4800 场发射扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；CO2 培养箱、台式离心机（Hereaus 公司，德国）；恒温震荡培养箱（太仓市实验设备厂）；CA-1480-2 垂直层流洁净工作台（上海上净净化设备有限公司）；MP200A 型电子天平（上海第二平衡器厂）；MILi-Qso 型纯水器（MiliPore 公司，美国）；压力蒸汽灭菌（嘉兴中新医疗器械公司）。
1.2 BMSCs 分离、培养及传代
取 2 月龄新西兰兔，空气栓塞法处死。用 18 号骨髓穿刺针于胫骨平台处进行穿刺，用经肝素冲洗过的注射器抽取骨髓约 1 mL。按本研究小组既往的实验方法[9]，采用全骨髓贴壁筛选法进行 BMSCs 的分离、培养及传代。取生长状态良好的第 4 代 BMSCs 用于后续实验。
1.3 气管支架制备及相关检测
1.3.1 实验分组及气管支架制备
取 10 只 6 月龄成年新西兰兔，空气栓塞法处死，在外科标准无菌操作下获取气管。随机分为 2 组，每组 5 只。对照组（A1 组）仅剥离气管外表面疏松结缔组织。实验组（B1 组）在剥离气管外表面疏松结缔组织基础上，参照本研究小组改良的 NaClO4 浸泡法[10]对气管进行脱细胞处理：将气管置于 4℃ 蒸馏水渗透溶解 48 h，然后以 5%NaClO4 浸泡 72 h，置于含 1% 双抗的 PBS 缓冲液中 4℃ 保存待测。
1.3.2 浸提液细胞毒性实验
无菌操作下将 A1 组和 B1 组气管支架组织剪成 2 mm×2 mm 大小。按 10 mL/cm2 表面积加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养液，37℃ 震荡 24 h；混悬液以离心半径 15 cm、500 r/min 离心 10 min，将上清液移至离心管中保存。同时以含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养液为阴性对照组（C1 组），以含 50 g/L 苯酚、10%FBS 的 DMEM/F12 培养基为阳性对照组（D1 组）。取第 4 代 BMSCs，达 80% 融合时消化计数；然后将约含 5×103个细胞的细胞悬液（200 μL）接种至 96 孔板中，置于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养 24 h 后，更换为上述各组浸提液，之后每 48 小时换液。培养 1、3、5、7 d 后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/mL，用 PBS 配制，pH7.4）10 μL，利用酶标仪测定各孔 490 nm 处吸光度（A）值，绘制细胞生长曲线。
1.3.3 免疫组织化学染色观察主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）类抗原表达
将 A1 组和 B1 组气管标本行 4 μm 厚冰冻切片，多聚甲醛固定后，正常山羊血清工作液封闭，加一抗（鼠抗兔 MHC-Ⅰ和Ⅱ抗体，稀释浓度 1∶200）4℃ 过夜，滴加二抗（山羊抗鼠 IgG）后 DAB 显色，苏木素复染，二甲苯透明后封片，正置显微镜下观察材料 MHC-Ⅰ和Ⅱ抗原的表达。
1.4 细胞-气管支架复合物的制备及相关观测
1.4.1 细胞-气管支架复合物制备及细胞活性观察
将 A1 组和 B1 组气管支架在无菌环境中修剪成 0.5 cm×0.5 cm 大小的片状组织，然后贴于 24 孔板底中央，气管外壁朝上；吸走周围 PBS 液，置于超净台中干燥 2 h，向组织片中滴加含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养基直至覆盖组织片，滴加过程避免组织片漂浮。将 24 孔培养板移至细胞培养箱，37℃、5%CO2、饱和湿度下孵育 24 h 后，吸去培养基。取生长状态良好的第 4 代 BMSCs，达 80% 融合时消化计数，然后将含有 2.5×104个细胞的细胞悬液接种至两组气管组织片的外壁上，置于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养。48 h 后取出行 Giemsa 染色，倒置显微镜下观察，根据细胞生长形态及状况判断材料毒性。
1.4.2 扫描电镜观察
两组细胞-气管支架复合物组织片培养 7、14 d 后取出，2.5% 戊二醛溶液固定 24 h；PBS 漂洗，梯度乙醇脱水，加入乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）及纯戊酯各 30 min，干燥后喷金，扫描电镜观察支架外表面的细胞状态。
1.5 同种异体动物体内实验
1.5.1 气管支架手术埋植
取 6 月龄成年新西兰兔 10 只，随机分为 2 组，每组 5 只。以戊巴比妥钠（3 mg/mL）耳缘静脉注射麻醉，颈背部备皮切开，游离皮下浅筋膜，分离脊柱一侧，形成皮囊。对照组（A2 组）植入新鲜气管支架，实验组（B2 组）植入脱细胞气管支架，随后常规缝合。术后观察实验动物炎性反应、排斥反应和一般健康状态（包括饮食、体质量、活动等情况）。
1.5.2 血液免疫球蛋白动态分析
术后 5、10、15、20、25、30 d，于耳缘静脉处采血留取标本，采用 ELISA 法评估受体血清免疫球蛋白 IgM 和 IgG 含量的动态变化。
1.5.3 HE 染色观察
术后 30 d 空气栓塞法处死两组动物，获取气管支架材料。室温下 10% 中性甲醛固定 24 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，二甲苯脱蜡，行常规 HE 染色观察。
1.6 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 气管支架相关观测
2.1.1 浸提液细胞毒性实验
各时间点 D1 组细胞均无成活。与 C1 组比较，虽然 A1 组和 B1 组细胞增殖稍低，但各时间点 3 组间 A 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 1。
2.1.2 免疫组织化学染色观察 MHC 类抗原表达
A1 组气管支架中，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗原在上皮层、黏膜层及黏膜下层细胞表达呈强阳性，在软骨膜部表达呈阳性，而在软骨细胞及细胞外基质结构均呈阴性；而 B1 组气管支架中，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗原在细胞外基质表达均呈阴性，仅在软骨细胞核表达呈阳性。见图 2。
2.2 细胞-气管支架复合物相关观测
2.2.1 细胞活性观察
培养 48 h 后 Giemsa 染色示，A1 组材料周围的细胞贴壁生长、增殖良好，未见悬浮细胞；B1 组材料周围的细胞在形态和密度上与 A 组比较无明显差别。见图 3。
2.2.2 扫描电镜观察
培养 7、14 d，细胞在 A1 组气管支架材料外壁上贴附良好，呈扁平的圆形、椭圆形，细胞排列紧密，成簇分布；细胞在 B1 组气管支架材料外壁上呈单片状生长，形态与 A1 组相似，生长趋势较 A1 组好。见图 4。
2.3 同种异体动物体内实验
2.3.1 大体观察
所有实验动物术后 30 d 内表现健康，体质量有所增加；伤口均愈合良好。30 d 时 A2 组气管支架周围包绕炎性结缔组织，并与受植床粘连，不易剥离；囊状的新鲜气管内有大量脓液积聚，破坏了正常气管的解剖结构。而 B2 组气管支架周围包绕的结缔组织较薄，无明显排斥反应迹象；气管支架表面有新生血管形成。见图 5。
2.3.2 血液免疫球蛋白动态分析
术后两组 IgM 及 IgG 表达均逐渐增加，分别于 15 d 和 20 d 达峰值，后逐渐下降，符合体液免疫应答抗体产生的规律。术后各时间点 A2 组 IgM 和 IgG 含量均显著高于 B2 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 6。
2.3.3 HE 染色观察
术后 30 d A2 组支架材料外表面炎性细胞浸润较多，腺体结构缺失，软骨组织皆不同程度被破坏；B2 组未见炎性细胞深层渗透或破坏气管结构，软骨细胞形态无异常，未见钙化、排斥等不良反应。见图 7。
图1
MTT 法检测各时间点各组浸提液中细胞活性
Figure1.
The cell activity in the leach liquor in each group at diffe rent time points detected by MTT assay
图2
免疫组织化学染色观察两组气管支架材料 MHC 类抗原表达（正置显微镜×200）
a. A1 组 MHC-Ⅰ抗原表达；b. B1 组 MHC-Ⅰ抗原表达；c. A1 组 MHC-Ⅱ抗原表达；d. B1 组 MHC-Ⅱ抗原表达
Figure2. Expression of MHC antigen in tracheal matrixs in 2 groups by immunohistochemical staining observation (Upright microscope×200)a. Expression of MHC-Ⅰ antigen in group A1; b. Expression of MHC-Ⅰ antigen in group B1; c. Expression of MHC-Ⅱ antigen in group A1; d. Expression of MHC-Ⅱ antigen in group B1
图3
两组细胞-气管支架复合物培养 48 h 后 Giemsa 染色观察（倒置显微镜×100）
a. A1 组；b. B1 组
Figure3. Giemsa staining observation of cell-trachea scaffold complex in 2 groups after cultured for 48 hours (Inverted microscope×100)a. Group A1; b. Group B1
图4
培养各时间点两组细胞-气管支架材料扫描电镜观察（×5 000）
a. A1 组培养 7 d；b. A1 组培养 14 d；c. B1 组培养 7 d；d. B1 组培养 14 d
Figure4. Scanning electron microscope observation of cell-trachea scaffold complex in 2 groups after cultured for different time points (×5 000)a. Group A1 at 7 days; b. Group A1 at 14 days; c. Group B1 at 7 days; d. Group B1 at 14 days
图5
术后 30 d 两组气管支架大体观察
a. A2 组；b. B2 组
Figure5. Macroscopic observation of the tracheal scaffolds at 30 days after operationa. Group A2; b. Group B2
图6
术后各时间点两组血液免疫球蛋白动态分析
a. IgM；b. IgG
Figure6. Dynamic analysis of the blood immunoglobulin at each time point after operationa. IgM; b. IgG
图7
术后 30 d 两组 HE 染色观察（×200）
a. A2 组；b. B2 组
Figure7. HE staining observation of 2 groups at 30 days after operation (×200)a. Group A2; b. Group B2
3 讨论
细胞外基质是组织工程的重要组成部分，研究证实细胞外基质会影响细胞增殖、迁移、分化，最终促进组织再生和重塑[11-12]。脱细胞基质材料含有天然的细胞外基质成分，不会释放有毒的可降解产物或引起炎性反应[13]。由于细胞外基质对于组织再生起着至关重要的作用，所以选择合适的脱细胞方案尤为重要[14]。目前临床应用的脱氧胆酸钠联合酶法对人、猪、鼠气管分别需要 25、17、5 个循环，才能获得低免疫原性的脱细胞基质[15]，该方法所需时间长，程序繁琐，也增加了基质感染的风险[16]。
要成为可应用于临床的组织工程气管支架材料，必须能支持种子细胞生长、分化。本实验将 BMSCs 接种至脱细胞气管支架外壁上进行体外培养，并观察细胞的黏附、生长情况。结果显示，BMSCs 在脱细胞气管支架外壁上贴附良好，细胞呈扁平的圆形、椭圆形，排列紧密，成簇分布。因此我们推断 NaClO4 脱细胞基质能为 BMSCs 提供一个良好的黏附界面，同时也能支持细胞的生长。脱细胞使用的 NaClO4 作为一种化学试剂，如果其在支架材料中残存浓度较高，对接种的细胞或宿主也会造成一定程度影响。本实验发现脱细胞气管支架浸提液中的细胞增殖情况与基础培养液相比，差异无统计学意义，说明支架材料中没有引起细胞活性降低的成分，提示此材料对细胞无明显毒性。
众所周知，同种异体移植后若不使用免疫抑制剂，往往发生排斥反应。同种异体移植排斥反应的细胞学基础是移植物 MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ抗原的表达，以激活宿主 CD4+T 细胞和 CTL 细胞。相关研究证明 MHC 类抗原的分布主要集中于黏膜表面的上皮、黏膜下腺和软骨膜，而不是在软骨细胞或软骨基质，表明黏膜、黏膜下腺、软骨膜是主要引起移植排斥反应的抗原结构[15, 17-19]。细胞外基质通过扩散来营养其中的软骨细胞，而且由于软骨细胞的新陈代谢需求低，可以在宿主体内存活[20]。同时，有研究提出软骨作为一种“免疫豁免”组织，可逐渐被宿主自身的软骨细胞替代[21]。Delaere 等[22]研究也发现位于软骨陷窝内的软骨细胞，由于缺乏直接血管，并且周围基质中包裹有胶原-蛋白质-多糖的细胞外基质作为物理隔离，从而使软骨细胞不被宿主的免疫系统识别。基于这些研究结果，我们提出了这种保留软骨细胞的结构完整、低免疫原性的优化脱细胞方案。与传统方法相比，该方法处理周期快，且较好地保留了细胞外基质成分，以满足组织工程重建需求。
研究显示，软骨基质内的软骨细胞在合成和分泌软骨基质和胶原纤维中发挥重要作用，而且有活性的软骨细胞对保持气管基质材料的三维结构也是至关重要的[3, 17-19]。脱细胞的概念是为了减少免疫原性细胞的数量，而不是完全消除所有细胞。我们进行了同种异体埋植实验，来验证这种保留软骨细胞基质材料的免疫原特性，并且术后未使用免疫抑制治疗。结果表明本实验的脱细胞方法制备的基质材料并未引起移植物的排斥反应。
综上述，本研究中我们通过将细胞-脱细胞气管支架进行体外培养，初步判断采用改良 NaClO4 脱细胞法获得的脱细胞气管支架具有良好的生物相容性，能够支持种子细胞的黏附和生长；并且在动物体内埋植实验中验证了软骨细胞的“免疫豁免”特性。该方案简化了脱细胞过程并节约了成本和时间，为同种异体气管移植提供了一种新思路。今后需在提高脱细胞材料行体内原位移植的远期效果方面做出更多改进。
