引用本文： 杨旅军, 吴洪娟, 张明君, 谢思田, 叶丹彦, 唐世杰. 人羊膜活性皮肤替代物修复巨痣切除术后创面的可行性及疗效研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(12): 1495-1499. doi: 10.7507/1002-1892.201707052 复制
目前，对于病损面积较大、自体皮肤可切取面积有限患者，可采用自体皮肤细胞构建活性皮肤替代物（living skin equivalent，LSE）修复创面[1-2]。常用构建方法为在植入真皮成纤维细胞的Ⅰ型胶原凝胶上接种表皮角化细胞，然后气液面培养，进行表皮重层分化[3-5]。这种以Ⅰ型胶原为基质的 LSE 具备真皮基质层和重层化分化良好的表皮层，但是基质层为胶冻状，表皮层和真皮层间连接脆弱[6]。
人羊膜（amniotic membrane，AM）为分娩后的废弃物，易于采集和加工，并具有低免疫原性和抑制炎症的特性，是一种良好的生物辅料[7-9]。前期研究中，我们采用去上皮化人 AM 作为基质，在基质面和上皮面分别接种真皮成纤维细胞和表皮角化细胞构建 LSE（AM-LSE），不仅去除了动物来源的胶原，而且韧性好，耐牵拉、切割、缝合，表皮和真皮间的基底膜发育良好，表皮真皮连接紧密，并成功用于裸鼠背部皮肤缺损修复[10]。经汕头大学医学院第二附属医院伦理委员会批准，2016 年 7 月我们应用 AM-LSE 治疗 1 例颈肩背部先天性巨痣患儿，以探讨其临床应用可行性。报告如下。
1 AM-LSE 的制备
1.1 细胞培养
局麻下，切取患儿腹股沟处大小约 1 cm×1 cm 的正常皮肤，在超净工作台上剔除脂肪，修薄真皮部分后放入中性分散酶溶液（0.4 mg/mL）中，4℃ 静置过夜，分离表皮和真皮。将表皮置于 0.25% 胰蛋白酶溶液中，37℃ 处理 10 min，获得表皮角化细胞悬液，接种于Ⅰ型胶原涂布的培养皿，添加 Epilife 表皮角化细胞基（Lifescience 公司，美国），于 CO2 细胞培养箱中常规培养，待细胞达 90% 融合时进行传代。取第 4 代角化细胞构建 AM-LSE。
取真皮切成直径为 1～2 mm 的组织块，使其紧密贴附于培养皿底部，添加含 2% 患儿自体血清的低血清间充质细胞培养基（广州美萨生物科技有限公司），于 CO2 细胞培养箱中常规培养。镜下观察见成纤维细胞自真皮组织块周围长出并增殖、游走，待组织间的细胞扩展至接近融合时，进行传代培养。取第 5 代成纤维细胞构建 AM-LSE。患儿皮肤组织切取、细胞培养均经患儿家属知情同意。
1.2 AM 制备
实验用 AM 来自 2016 年 5 月汕头大学医学院第二附属医院足月健康剖宫产产妇自愿捐赠。HIV、HBV、HCV、梅毒等产前传染病筛查为阴性。于超净工作台清洗去除血液、蜕膜等后，将 AM 置于 0.02%EDTA 中，37℃ 孵化 30 min，在解剖显微镜下用细胞刮子刮除 AM 上皮，清洗，修剪成 5 cm×5 cm，4℃ 冷藏备用。
1.3 AM-LSE 制备及观察
1.3.1 制备方法
取成纤维细胞，采用添加 2% 自体血清的低血清间充质细胞培养基调整细胞密度为 5×105 个/mL 后，将细胞悬液以 0.5 mL/cm2 滴注于 AM 基质面，静置 2 h 待细胞贴壁后，添加上述培养基，置于 CO2 细胞培养箱中培养，AM 基质面向上。2 d 后翻转使上皮面向上，然后置于嵌入式膜培养皿（Corning 公司，美国），将表皮角化细胞悬液（密度 1×106 个/mL）按照 0.5 mL/cm2 滴注于上皮面。液相下培养 2 d 待细胞达融合后，换气液面角化培养基[11]，开始气液面培养，2 d 换液 1 次。气液面培养 10 d 后收集 AM-LSE。
1.3.2 观察指标
气液面培养 10 d 后，大体观察 AM-LSE；取部分 AM-LSE 标本固定于多聚甲醛液中，石蜡包埋，切片，片厚 6 μm，常规 HE 染色，光镜下观察 AM-LSE 组织学结构。
1.4 观察结果
气液面培养 10 d 后，AM 表面为角化表皮层，呈淡黄色，AM-LSE 质地较韧，可牵拉、不易破损。组织学观察：表皮角化细胞重层化，基底层细胞排列规整紧密，可见棘细胞层、颗粒细胞层以及角质层。成纤维细胞向 AM 基质内浸润生长。见图 1。
图1
AM-LSE 观察
a. 大体观察；b. 组织学观察（HE×200）
Figure1. The observation of AM-LSEa. Gross observation; b. Histological observation (HE×200)
2 临床应用
2.1 病例介绍
患儿 男，5 岁。因“颈肩背部先天性巨痣”于 2016 年 7 月入院。患儿出生时即发现颈肩背部大面积黑痣，并全身多处散在小型色素痣，界限清楚，随年龄增长黑痣面积增大。自 2 岁开始接受巨痣分次切除、自体皮片移植手术，共 3 次。本次入院检查，颈肩背部仍遗留面积约 30 cm×30 cm 的病变组织，并可见已经切除缝合的散发小型痣、痣内切除缝合以及皮片移植术后表现；组织病理学检查显示痣细胞在皮下组织层有浸润。拟采用分次巨痣切除联合 AM-LSE 移植修复创面。全麻下，手术切除巨痣（15 cm×10 cm）至深筋膜层，遗留创面面积为 20 cm×15 cm；充分止血后，覆盖胶原蛋白海绵人工真皮（商品名：皮耐克；Gunze 公司，日本）。2 周后揭除皮耐克硅胶膜，刮除表面水肿肉芽组织后，反复冲洗、止血；将 AM-LSE 切成邮票大小贴敷于肉芽创面，网眼纱固定皮片后，填塞纱布碎片，打包包扎。术后 2 d 拆除敷料，常规换药至 AM-LSE 完全封闭创面。第 1 次AM-LSE 移植术后 6 个月再次行肩部巨痣切除联合 AM-LSE 移植术。本次术中经患儿家属同意用 6 mm 皮肤活检器切取前次移植术后全层皮肤样本，行 HE 染色观察皮肤组织结构。
2.2 结果
第 1 次 AM-LSE 移植术后 2 d，见 AM-LSE 贴敷良好；术后 5 d，揭除网眼纱，见 AM-LSE 红润，与创基贴敷牢固，皮片开始向周围爬行扩展；术后 11、14 d 皮片继续扩大融合，仅有少量创面残余。术后 6 个月，移植的 AM-LSE 色泽接近正常皮肤，质地柔软，皮片间隙为淡红色瘢痕，高出皮面，质地较硬，植皮区域边缘见明显创面收缩。组织学观察：基底层细胞呈柱状紧凑排列，棘细胞层、颗粒细胞层以及角质层分化良好。真皮层内分布大量成纤维细胞以及血管，皮下未见黑色素细胞团块，未见明显炎性细胞浸润，真皮下见大量粗大胶原纤维。表皮基底层平坦，未形成乳头状结构，未见毛囊、汗腺等皮肤附属器。见图 2。
图2
典型病例
a. 术前设计切除范围；b. 术中切除巨痣至深筋膜层；c. 采用胶原蛋白海绵人工真皮覆盖创面；d. 术后 2 周肉芽创面贴敷邮票状 AM-LSE；e. 以网眼纱固定 AM-LSE；f. AM-LSE 移植术后 5 d ；g. 移植术后 14 d AM-LSE 封闭创面；h. 移植术后6 个月创面大体观察；i. 移植术后 6 个月组织学观察（HE ×200）
Figure2. A typical casea. Skin lesion for excision before operation; b. Nevus excision to deep fasia; c. Wound repairing with artificial skin of collagen sponge; d. Stamp grafts of AM-LSE on granulation tissue at 2 weeks after operation; e. AM-LSE grafts covered with oil gause; f. At 5 days after AM-LSE grafting; g. Wound healing at 14 days after AM-LSE grafting; h. Gross view of the grafting area at 6 months after operation; i. Histological observation of grafted AM-LSE after 6 months (HE ×200)
3 讨论
自 1983 年 Bell 等[12]应用表皮角化细胞、真皮成纤维细胞和Ⅰ型胶原成功构建 LSE 以来，LSE 构建技术已逐渐成熟。虽然已有应用不同细胞外基质（如人纤维蛋白、自体血浆、脱细胞真皮等）成功构建 LSE 的报道，但目前仍以Ⅰ型胶原构建 LSE 为主，且获得了美国食品药品监督管理局以及中国国家食品药品监督管理总局的认证。我们前期研究发现，成纤维细胞可在去上皮化人 AM 基质层三维立体生长，另外去上皮化人 AM 上皮面因为保留了基底膜的基本成分，能更好地支持表皮角化细胞的贴附生长；以去上皮人 AM 作为基质构建的 AM-LSE 具有更好的表皮分化特征以及发育良好的基底膜，表皮真皮连接更加紧密，耐牵拉和切割，较Ⅰ型胶原构建的 LSE 更易于操作，并成功移植修复裸鼠背部创面且长期存活[8, 10]。上述以 AM 为基质构建的 LSE 的特性，也得到了其他研究的支持[13]。采用患者自体细胞培养、无动物源成分培养以及去除动物源的胶原成分，使 AM-LSE 可以更好地满足临床应用的要求。
先天性巨痣的治疗以切除为主[14]。本例患儿病理检查显示痣细胞深及皮下组织，病损皮肤切除至深筋膜层。因幼儿无法配合扩张器治疗，所以未选择行减张缝合或自体皮片移植。既往报道，先天性巨痣病损切除后，应用 Integra 等真皮支架覆盖断层皮片可以较好支持皮片生长[15]。日本 Gunze 公司生产的皮耐克具有比 Integra 更小的抗原性，覆盖创面后成纤维细胞和新生血管向皮耐克基质层长入，形成一定厚度的肉芽组织，在肉芽组织上移植薄断层皮片可以达到较好修复效果[16-17]。但是采用薄断层皮片也存在一定不足，供皮区虽然大部分可以无瘢痕愈合，但是在术后可能会长期存在皮肤保水功能恢复不完全、红斑以及色素沉积异常等情况[18]。且本例患儿因颈部和肩背部皮损面积大、并全身散发大量小型皮损，自体供皮区有限。我们应用皮耐克覆盖创面，2 周后揭去硅胶膜，在肉芽创面移植 AM-LSE。AM-LSE 为半透明膜状，具有完整的表皮和真皮层，厚度相当于刃厚皮片，但是相比较自体皮片质地较疏松，无免疫细胞，无与受床血管对接的微小血管，故耐受感染侵袭的能力较弱。所以我们将 AM-LSE 裁剪成邮票大小移植，并在移植术后 2 d 即拆包换药，在网眼纱固定下，按压清除皮片下积液，术后 5 d 见 AM-LSE 红润，术后 11 d 表皮细胞沿皮缘向周边爬行扩展，最终封闭创面。AM-LSE 移植过程中的表现与自体断层皮片移植类似。术后 6 个月，AM-LSE 的外观和柔软度等表现与自体皮片无明显差异。
本例临床应用提示应用自体细胞构建的 AM-LSE 修复创面可行，适合于自体可用供皮区有限、且需要反复多次进行皮肤移植手术的患者。但 AM 虽然具有低免疫原性，考虑到多次 AM-LSE 移植治疗，仍具有激活机体抗原抗体免疫系统的可能性，因此需要增加病例进一步研究多次采用 AM-LSE 移植治疗的可行性及适用性。
目前，对于病损面积较大、自体皮肤可切取面积有限患者，可采用自体皮肤细胞构建活性皮肤替代物（living skin equivalent，LSE）修复创面[1-2]。常用构建方法为在植入真皮成纤维细胞的Ⅰ型胶原凝胶上接种表皮角化细胞，然后气液面培养，进行表皮重层分化[3-5]。这种以Ⅰ型胶原为基质的 LSE 具备真皮基质层和重层化分化良好的表皮层，但是基质层为胶冻状，表皮层和真皮层间连接脆弱[6]。
人羊膜（amniotic membrane，AM）为分娩后的废弃物，易于采集和加工，并具有低免疫原性和抑制炎症的特性，是一种良好的生物辅料[7-9]。前期研究中，我们采用去上皮化人 AM 作为基质，在基质面和上皮面分别接种真皮成纤维细胞和表皮角化细胞构建 LSE（AM-LSE），不仅去除了动物来源的胶原，而且韧性好，耐牵拉、切割、缝合，表皮和真皮间的基底膜发育良好，表皮真皮连接紧密，并成功用于裸鼠背部皮肤缺损修复[10]。经汕头大学医学院第二附属医院伦理委员会批准，2016 年 7 月我们应用 AM-LSE 治疗 1 例颈肩背部先天性巨痣患儿，以探讨其临床应用可行性。报告如下。
1 AM-LSE 的制备
1.1 细胞培养
局麻下，切取患儿腹股沟处大小约 1 cm×1 cm 的正常皮肤，在超净工作台上剔除脂肪，修薄真皮部分后放入中性分散酶溶液（0.4 mg/mL）中，4℃ 静置过夜，分离表皮和真皮。将表皮置于 0.25% 胰蛋白酶溶液中，37℃ 处理 10 min，获得表皮角化细胞悬液，接种于Ⅰ型胶原涂布的培养皿，添加 Epilife 表皮角化细胞基（Lifescience 公司，美国），于 CO2 细胞培养箱中常规培养，待细胞达 90% 融合时进行传代。取第 4 代角化细胞构建 AM-LSE。
取真皮切成直径为 1～2 mm 的组织块，使其紧密贴附于培养皿底部，添加含 2% 患儿自体血清的低血清间充质细胞培养基（广州美萨生物科技有限公司），于 CO2 细胞培养箱中常规培养。镜下观察见成纤维细胞自真皮组织块周围长出并增殖、游走，待组织间的细胞扩展至接近融合时，进行传代培养。取第 5 代成纤维细胞构建 AM-LSE。患儿皮肤组织切取、细胞培养均经患儿家属知情同意。
1.2 AM 制备
实验用 AM 来自 2016 年 5 月汕头大学医学院第二附属医院足月健康剖宫产产妇自愿捐赠。HIV、HBV、HCV、梅毒等产前传染病筛查为阴性。于超净工作台清洗去除血液、蜕膜等后，将 AM 置于 0.02%EDTA 中，37℃ 孵化 30 min，在解剖显微镜下用细胞刮子刮除 AM 上皮，清洗，修剪成 5 cm×5 cm，4℃ 冷藏备用。
1.3 AM-LSE 制备及观察
1.3.1 制备方法
取成纤维细胞，采用添加 2% 自体血清的低血清间充质细胞培养基调整细胞密度为 5×105 个/mL 后，将细胞悬液以 0.5 mL/cm2 滴注于 AM 基质面，静置 2 h 待细胞贴壁后，添加上述培养基，置于 CO2 细胞培养箱中培养，AM 基质面向上。2 d 后翻转使上皮面向上，然后置于嵌入式膜培养皿（Corning 公司，美国），将表皮角化细胞悬液（密度 1×106 个/mL）按照 0.5 mL/cm2 滴注于上皮面。液相下培养 2 d 待细胞达融合后，换气液面角化培养基[11]，开始气液面培养，2 d 换液 1 次。气液面培养 10 d 后收集 AM-LSE。
1.3.2 观察指标
气液面培养 10 d 后，大体观察 AM-LSE；取部分 AM-LSE 标本固定于多聚甲醛液中，石蜡包埋，切片，片厚 6 μm，常规 HE 染色，光镜下观察 AM-LSE 组织学结构。
1.4 观察结果
气液面培养 10 d 后，AM 表面为角化表皮层，呈淡黄色，AM-LSE 质地较韧，可牵拉、不易破损。组织学观察：表皮角化细胞重层化，基底层细胞排列规整紧密，可见棘细胞层、颗粒细胞层以及角质层。成纤维细胞向 AM 基质内浸润生长。见图 1。
图1
AM-LSE 观察
a. 大体观察；b. 组织学观察（HE×200）
Figure1. The observation of AM-LSEa. Gross observation; b. Histological observation (HE×200)
2 临床应用
2.1 病例介绍
患儿 男，5 岁。因“颈肩背部先天性巨痣”于 2016 年 7 月入院。患儿出生时即发现颈肩背部大面积黑痣，并全身多处散在小型色素痣，界限清楚，随年龄增长黑痣面积增大。自 2 岁开始接受巨痣分次切除、自体皮片移植手术，共 3 次。本次入院检查，颈肩背部仍遗留面积约 30 cm×30 cm 的病变组织，并可见已经切除缝合的散发小型痣、痣内切除缝合以及皮片移植术后表现；组织病理学检查显示痣细胞在皮下组织层有浸润。拟采用分次巨痣切除联合 AM-LSE 移植修复创面。全麻下，手术切除巨痣（15 cm×10 cm）至深筋膜层，遗留创面面积为 20 cm×15 cm；充分止血后，覆盖胶原蛋白海绵人工真皮（商品名：皮耐克；Gunze 公司，日本）。2 周后揭除皮耐克硅胶膜，刮除表面水肿肉芽组织后，反复冲洗、止血；将 AM-LSE 切成邮票大小贴敷于肉芽创面，网眼纱固定皮片后，填塞纱布碎片，打包包扎。术后 2 d 拆除敷料，常规换药至 AM-LSE 完全封闭创面。第 1 次AM-LSE 移植术后 6 个月再次行肩部巨痣切除联合 AM-LSE 移植术。本次术中经患儿家属同意用 6 mm 皮肤活检器切取前次移植术后全层皮肤样本，行 HE 染色观察皮肤组织结构。
2.2 结果
第 1 次 AM-LSE 移植术后 2 d，见 AM-LSE 贴敷良好；术后 5 d，揭除网眼纱，见 AM-LSE 红润，与创基贴敷牢固，皮片开始向周围爬行扩展；术后 11、14 d 皮片继续扩大融合，仅有少量创面残余。术后 6 个月，移植的 AM-LSE 色泽接近正常皮肤，质地柔软，皮片间隙为淡红色瘢痕，高出皮面，质地较硬，植皮区域边缘见明显创面收缩。组织学观察：基底层细胞呈柱状紧凑排列，棘细胞层、颗粒细胞层以及角质层分化良好。真皮层内分布大量成纤维细胞以及血管，皮下未见黑色素细胞团块，未见明显炎性细胞浸润，真皮下见大量粗大胶原纤维。表皮基底层平坦，未形成乳头状结构，未见毛囊、汗腺等皮肤附属器。见图 2。
图2
典型病例
a. 术前设计切除范围；b. 术中切除巨痣至深筋膜层；c. 采用胶原蛋白海绵人工真皮覆盖创面；d. 术后 2 周肉芽创面贴敷邮票状 AM-LSE；e. 以网眼纱固定 AM-LSE；f. AM-LSE 移植术后 5 d ；g. 移植术后 14 d AM-LSE 封闭创面；h. 移植术后6 个月创面大体观察；i. 移植术后 6 个月组织学观察（HE ×200）
Figure2. A typical casea. Skin lesion for excision before operation; b. Nevus excision to deep fasia; c. Wound repairing with artificial skin of collagen sponge; d. Stamp grafts of AM-LSE on granulation tissue at 2 weeks after operation; e. AM-LSE grafts covered with oil gause; f. At 5 days after AM-LSE grafting; g. Wound healing at 14 days after AM-LSE grafting; h. Gross view of the grafting area at 6 months after operation; i. Histological observation of grafted AM-LSE after 6 months (HE ×200)
3 讨论
自 1983 年 Bell 等[12]应用表皮角化细胞、真皮成纤维细胞和Ⅰ型胶原成功构建 LSE 以来，LSE 构建技术已逐渐成熟。虽然已有应用不同细胞外基质（如人纤维蛋白、自体血浆、脱细胞真皮等）成功构建 LSE 的报道，但目前仍以Ⅰ型胶原构建 LSE 为主，且获得了美国食品药品监督管理局以及中国国家食品药品监督管理总局的认证。我们前期研究发现，成纤维细胞可在去上皮化人 AM 基质层三维立体生长，另外去上皮化人 AM 上皮面因为保留了基底膜的基本成分，能更好地支持表皮角化细胞的贴附生长；以去上皮人 AM 作为基质构建的 AM-LSE 具有更好的表皮分化特征以及发育良好的基底膜，表皮真皮连接更加紧密，耐牵拉和切割，较Ⅰ型胶原构建的 LSE 更易于操作，并成功移植修复裸鼠背部创面且长期存活[8, 10]。上述以 AM 为基质构建的 LSE 的特性，也得到了其他研究的支持[13]。采用患者自体细胞培养、无动物源成分培养以及去除动物源的胶原成分，使 AM-LSE 可以更好地满足临床应用的要求。
先天性巨痣的治疗以切除为主[14]。本例患儿病理检查显示痣细胞深及皮下组织，病损皮肤切除至深筋膜层。因幼儿无法配合扩张器治疗，所以未选择行减张缝合或自体皮片移植。既往报道，先天性巨痣病损切除后，应用 Integra 等真皮支架覆盖断层皮片可以较好支持皮片生长[15]。日本 Gunze 公司生产的皮耐克具有比 Integra 更小的抗原性，覆盖创面后成纤维细胞和新生血管向皮耐克基质层长入，形成一定厚度的肉芽组织，在肉芽组织上移植薄断层皮片可以达到较好修复效果[16-17]。但是采用薄断层皮片也存在一定不足，供皮区虽然大部分可以无瘢痕愈合，但是在术后可能会长期存在皮肤保水功能恢复不完全、红斑以及色素沉积异常等情况[18]。且本例患儿因颈部和肩背部皮损面积大、并全身散发大量小型皮损，自体供皮区有限。我们应用皮耐克覆盖创面，2 周后揭去硅胶膜，在肉芽创面移植 AM-LSE。AM-LSE 为半透明膜状，具有完整的表皮和真皮层，厚度相当于刃厚皮片，但是相比较自体皮片质地较疏松，无免疫细胞，无与受床血管对接的微小血管，故耐受感染侵袭的能力较弱。所以我们将 AM-LSE 裁剪成邮票大小移植，并在移植术后 2 d 即拆包换药，在网眼纱固定下，按压清除皮片下积液，术后 5 d 见 AM-LSE 红润，术后 11 d 表皮细胞沿皮缘向周边爬行扩展，最终封闭创面。AM-LSE 移植过程中的表现与自体断层皮片移植类似。术后 6 个月，AM-LSE 的外观和柔软度等表现与自体皮片无明显差异。
本例临床应用提示应用自体细胞构建的 AM-LSE 修复创面可行，适合于自体可用供皮区有限、且需要反复多次进行皮肤移植手术的患者。但 AM 虽然具有低免疫原性，考虑到多次 AM-LSE 移植治疗，仍具有激活机体抗原抗体免疫系统的可能性，因此需要增加病例进一步研究多次采用 AM-LSE 移植治疗的可行性及适用性。
