引用本文： 陈泽鹏, 章莹, 林泽枫, 叶翔凌, 张永强, 夏远军, 夏虹, 尹庆水. 硫酸葡聚糖/重组人 BMP-2/壳聚糖复合微球联合珊瑚羟基磷灰石人造骨修复大段骨缺损影像学评价. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(11): 1384-1389. doi: 10.7507/1002-1892.201703094 复制
骨缺损的治疗是长期困扰临床工作的难题，采用自体骨修复骨缺损是最常用方法，具有吸收快、特异性小、成骨效果好、不产生排斥反应等优点，但取骨过程会对患者造成一定程度创伤，并可能发生取骨处感染及皮肤瘢痕等问题，使其来源受限；同种及异种异体骨虽然来源广泛，但存在价格昂贵、发生免疫排斥反应以及消毒灭菌不彻底导致的疾病传染风险。人工骨因具有取材广泛、可塑性强、生物相容性好、可降解性、可消毒灭菌、操作简便等优点，而受到骨科医师青睐。本课题组前期已成功制备了硫酸葡聚糖/重组人 BMP-2/壳聚糖（dextran sulfate/recombinant human BMP-2/chitosan，DS/rhBMP-2/CS）缓释微球，经验证其具有优良的生物安全性[1-2]。体外实验结果显示[3]，DS/rhBMP-2/CS 缓释微球粒径为（217±8）nm，符合纳米级要求；包封率 85.6%±3%，载药量（47.245±3.321）μg/mg；体外释放 2 h 后出现突释期，2 d 后释放达高峰，之后缓慢下降，释放周期约 28 d。异位成骨实验中，将 DS/rhBMP-2/CS 缓释微球植入 SD 大鼠肌袋内，结果表明，4～16 周植入 DSs/rhBMP-2/CS 的缓释微球组较单纯 rhBMP-2 组植入区周围组织质地硬度高，成骨骨块直径更大，并可见骨膜和血管长入[4]。珊瑚羟基磷灰石（coral hydroxyapatite，CHA）作为无机植骨材料，其具有骨传导性是公认的。单纯 CS 培养的 BMSCs 形态呈球形，而羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）-CS 培养的细胞形态呈纺锤状，因添加的 HA 加强了细胞黏附性[5]。但无机材料本身的脆性、可塑性差等原因，限制了其在骨组织工程中的应用。在上述研究基础上，本研究将 DS/rhBMP-2/CS 缓释微球结合 CHA 进行大段骨缺损的成骨研究，对成骨效果进行影像学评估。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、试剂、仪器
24 周龄雄性新西兰大白兔 57 只，体质量 2.0～2.5 kg，购自广州军区广州总医院实验动物中心。所有动物实验流程均符合伦理道德要求，经中国人民解放军广州总医院伦理委员会批准。
CS[相对分子质量为（50～190）×103，脱乙酰度 85%]，DS（相对分子质量 500×103，硫含量 40%～50%）（Sigma 公司，美国）；rhBMP-2（上海瑞邦生物材料有限公司）；CHA（大小 20 mm×5 mm×5 mm，平均孔径 500 μm，孔隙率 65%，密度 0.9 g/mL，表面积 1.5 m2/g，抗压强度 4.0 MPa；北京意华健科贸有限责任公司）；冰乙酸（相对分子质量 60.05；上海润捷化学试剂有限公司）；ZnSO4（用二次蒸馏水配制成 1 mol/L 的储备液）；甘露醇（天津大茂化学试剂厂）；EDTA 脱钙液（武汉博士德生物工程有限公司）。所有化学试剂在使用前未进一步纯化。
JB-2 型恒温磁力搅拌器（上海雷磁仪器厂）；单道手动 100～1 000 μL DRAGON 移液器（上海赛伯乐仪器有限公司）；移液枪头（Kirgen 公司，美国）；电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ-250 DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；50 mL 一次性无菌离心管（JET BIOFIL 公司）；0.22 μm 和 0.45 μm 针头过滤器（Pall 公司，美国）；20 mL 一次性注射器、1 cm 榄型聚四氟乙烯搅拌子、微量分析型超纯水机（重庆艾科浦科技有限公司）；冷冻干燥器（Labconco 公司，美国）；超低温冰箱（Haier 集团）；超净工作台、摆锯、7.9 mm 锯片（厦门大博颖精医疗器械有限公司）；Aloka Latheta LCT-200 Micro-CT 机（Hitachi 公司，日本）。
1.2 DS/rhBMP-2/CS/CHA 和 rhBMP-2/CHA 人工骨制备
取一定量 CS 溶于 0.175% 乙酸中，配成 1 mg/mL CS 溶液，用 0.45 μm 和 0.22 μm 针头过滤器依次过滤。称取适量 DS 溶于双蒸水，配成 1 mg/mL DS 溶液，再用 0.45 μm 和 0.22 μm 滤膜依次过滤。无菌条件下，取 2.08 mL DS 溶液在 1 500 r/min 转速下搅拌，加入 100 μg rhBMP-2，搅拌 20 min；加入 1.04 mL CS 溶液，搅拌 5 min；加入 0.1 mL ZnSO4，持续搅拌 30 min；加入 5% 甘露醇后持续搅拌均匀，将 CHA 投入溶液中充分浸泡后，转入–80℃ 超低温冰箱中预冻 24 h 后，转移至冷冻干燥器冻干，制成 DS/rhBMP-2/CS/CHA（长度 20 mm）人工骨，备用。
另外于无菌条件下，将 1 mg rhBMP-2 与双蒸水配成 0.1 mg/mL rhBMP-2 溶液；将 CHA 投入溶液中充分浸泡后，转入–80℃ 超低温冰箱中预冻 24 h，转移至冷冻干燥器冻干，制成 rhBMP-2/CHA（长度 20 mm）人工骨，备用。
1.3 实验分组及方法
取 54 只实验动物按随机数字表法随机分为 3 组，每组 18 只，A 组为 CHA 组，B 组为 DS/rhBMP-2/CS/CHA 组，C 组为 rhBMP-2/CHA 组；另设 3 只动物作为空白对照组（D 组），以验证临界骨愈合长度。所有动物以 3% 戊巴比妥（1 mL/kg）耳缘静脉注射麻醉，剔除右前肢毛发，侧卧位，上止血带；手术切口周围注射少量利多卡因局部麻醉；于右前肢中段外侧作一长约 3.0 cm 纵切口，钝性分离浅深筋膜，避开血管，暴露中段桡骨，直视下截取长 20 mm 的桡骨，去除骨膜，冲洗术区。A、B、C 组骨缺损区分别植入 CHA、DS/rhBMP-2/CS/CHA、rhBMP-2/CHA 人工骨，D 组不植入材料。逐层缝合切口，去除止血带，包扎。术后连续肌肉注射青霉素（8 万 U/kg）3 d，观察切口情况，术后 7 d 拆线，分笼独立正常喂养。
1.4 观测指标
1.4.1 X 线片观察
术后 4、8、12 周 A、B、C 组各取 6 只动物，D 组于每个时间点各取 1 只动物。以 3% 戊巴比妥耳缘静脉大剂量注射处死，截取右前肢移植段骨标本，行 X 线侧位扫描，扫描参数：电压 80 kV，电流 0.5 mA。采用 Lane-Sandhu X 线评分标准从新骨形成、骨连接及骨塑形三方面进行骨愈合评价。
1.4.2 Micro-CT 扫描及三维重建观察
获取的标本采用 Micro-CT 进行扫描，扫描参数：电压 80 kV，电流 0.5 mA，层厚 48 μm，分辨率 48 μm，角度 180°。扫描后图像使用 Mimics16.0 软件通过自动划分新生骨和材料灰度值后进行三维重建，并计算新生骨体积。
1.5 统计学分析
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 术后观察
所有实验动物术后均未发现伤口化脓感染，饮食及活动正常；伤口拆线后愈合良好，未见术口崩开及移植物暴露等情况；术后生命体征均平稳，恢复良好。
2.2 X 线片观察
术后 4 周，A 组材料与自体骨之间骨折线较清晰；B、C 组骨折线已模糊，同时两断端伴有新生软骨组织影；D 组骨缺损明显。术后 8 周，A～C 组材料影均较 4 周时有一定程度减低，其中 A 组材料骨折线已模糊；B 组骨缺损愈合结合良好，材料透射影接近自体骨；C 组材料透射影仍明显，但材料与自体骨结合良好；D 组骨缺损未见愈合，断端硬化。术后 12 周，A 组材料结合良好，材料影明显，但骨缺损区基本对合；B 组骨缺损区透射影接近正常骨质，骨愈合良好，逐渐出现骨髓腔（骨中显影较低的部分），同时随着骨生长，材料降解明显，仅残留少许材料，外层皮质骨已形成；C 组骨缺损区愈合良好，材料显影仍明显，断端有新生骨影；D 组未见骨愈合，断端硬化。见图 1。
图1
术后各时间点各组 X 线片观察
从左至右依次为 A、B、C、D 组 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周；c. 术后 12 周
Figure1. X-ray film observation of groups at each time points after operationFrom left to right for groups A, B, C, and D respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
术后各时间点 B 组 X 线片评分显著高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 8、12 周 C 组评分高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
图2
术后各时间点各组 X 线片评分比较
Figure2.
Comparison of X-ray film scores of groups at each time points after operation
2.3 Micro-CT 扫描及三维重建观察
Micro-CT 扫描及三维重建观察示，白色表示正常骨质，浅黄色表示新生骨组织或新生软骨、骨痂。结果显示，术后各时间点 A 组骨缺损区新生骨组织少，成骨形态差；B 组新生骨组织多，骨缺损区骨塑形良好，12 周时逐渐接近正常骨形态；C 组骨缺损区新生骨组织较多，成骨形态一般。见图 3。
图3
术后各时间点各组 Micro-CT 扫描及三维重建观察
从左至右依次为 A、B、C 组 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周；c. 术后 12 周
Figure3. Micro-CT scan and three-dimensional reconstructive observation of groups at each time points after operationFrom left to right for groups A, B, and C respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
术后各时间点 B 组新生骨体积均显著高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 8 周 C 组评分高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
术后各时间点各组新生骨体积比较
Figure4.
Comparison of new bone volume of groups at each time points after operation
3 讨论
CS 与 DS 结合形成的纳米缓释载体在肿瘤[6-7]、耳鼻喉、眼科[8-9]、基因检测、抗菌[10]、抗病毒、疫苗接种[11]等医学领域被广泛应用。在基质细胞衍生因子 1α（stromal cell-derived factor 1α，SDF-1α）、VEGF、FGF-2、BMP-2、溶菌酶等一类蛋白分子中都含有肝素结合位点，而 DS-CS 载体具有的 DS 外壳正好是肝素的同类物，红外光谱研究表明[12]，含肝素结合位点的蛋白质与 DS-CS 载体可有效且紧密地结合，结合率可达 95%～100%，而且 SDF-1α、VEGF 等蛋白与 DS-CS 的结合不会影响蛋白本身的活性，反而增强了蛋白分子自身的热稳定性。每 100 纳摩尔 DS 带电单位中，当肝素蛋白负载达到 1.5 nmol 单体或 0.75 nmol 二聚体时，DS-CS 纳米级载体的形态和 Zeta 电位不会受到影响。研究表明[3, 12-13]，采用离子交联法制备的 DS/rhBMP-2/CS 复合微球包封率为 85.6%±3%，载药率为（47.245±3.321）μg/mg，而普通 rhBMP-2/CS 复合微球载药率只有（33.437±2.290）μg/mg，因为 CS 与生物蛋白之间的作用为静电作用，无法进行大量且有效的结合。而 DS/rhBMP-2/CS 缓释微球除了 DS 与 CS、CS 与 rhBMP-2 之间的静电作用外，经过硫酸化的葡聚糖片段能够和 rhBMP-2 形成肝素结合位点，结合作用强，提升了 CS 载药的稳定性。
微球自身不具备骨传导性，所以本实验中引入了 CHA 作为 rhBMP-2 诱导成骨的生长支架。HA 已被证实是理想的载体，能够搭载许多药物及具备可持续释放的能力，同时能有效促进组织的血管化，促进组织生长[14]；HA-CS 载体能够延缓并控制 rhBMP-2 的释放，增强成骨效应[15]。CHA 较普通的 HA 具备更好的生物相容性、无毒性及多孔性，作为无机植骨材料，其具有的骨传导性是公认的；但因无机材料本身的脆性、可塑性差等原因，制约了其在骨组织工程中的应用。rhBMP-2 缓释因子与 CHA 结合互为弥补，提供了良好的骨诱导性和传导性[15]。
rhBMP-2 主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到募集和分化的作用[16]。骨形成早期，rhBMP-2 促使未分化间充质细胞向骨生成中心聚集分化为骨母细胞，rhBMP-2 还可通过增强或抑制细胞内的某些特异性蛋白的分泌，促使成纤维细胞分化为成骨细胞、成肌细胞分化为肥大的软骨细胞，并促进基质钙化。BMP-2 维持成骨细胞特有细胞表征，诱导成骨细胞标志物水平升高。骨形成后期，BMP-2 作为一种破骨细胞分化因子与其他分化因子直接或间接刺激破骨细胞分化，参与骨的重建[17-20]。
本研究结果均表明，B 组成骨效果最满意，由于 DS-CS 微球的缓释作用，rhBMP-2 在各时间点呈缓慢持续释放。骨形成初期，rhBMP-2 的释放量最多，到骨形成中后期，B 组中的 rhBMP-2 仍在释放并作用，稳定地发挥诱导成骨效应。伴随骨生长的过程，B 组的人工骨材料降解可以更加彻底。在同等剂量条件下（含 rhBMP-2 均为 100 μg），成骨早期 C 组 rhBMP-2 大量释放，成骨效应明显；后期由于 rhBMP-2 短暂的半衰期等因素，rhBMP-2 大量失活，失去有效和持续的成骨效应，但作用效果仍优于未添加 rhBMP-2 的 A 组；A 组因缺乏生长因子，在整个骨生长周期中成骨作用缓慢，材料降解最慢。
B 组各时间点 X 线片评分及新生骨体积均优于 A、C 组。新生骨体积 Micro-CT 扫描分析结果是经系统自动划分材料和新生骨的灰度值并计算得到，结果更客观，且 Micro-CT 已被广泛用于骨三维微结构及骨组织工程的定量测定。Micro-CT 扫描可更加清晰直观地观察组织内的新生骨情况，而 Lane-Sandhu X 线片评分结果具有一定主观性，且 X 线片观察以二维结果为主，不及 Micro-CT 对组织的三维评价特性[21]。所以，研究者更倾向于 Micro-CT 观察结果。
空白对照组术后 4、8、12 周放射学上均未见到骨缺损区愈合，12 周时断端出现硬化骨（死骨），结果表明 20 mm 的骨缺损长度未见明显新生骨生长[22-23]。
综上述，DS/rhBMP-2/CS/CHA 缓释人工骨生物相容性好，成骨作用效果显著，骨生长过程中材料降解更快且制备简易，可为未来将骨组织工程应用于临床治疗骨缺损提供新思路。
骨缺损的治疗是长期困扰临床工作的难题，采用自体骨修复骨缺损是最常用方法，具有吸收快、特异性小、成骨效果好、不产生排斥反应等优点，但取骨过程会对患者造成一定程度创伤，并可能发生取骨处感染及皮肤瘢痕等问题，使其来源受限；同种及异种异体骨虽然来源广泛，但存在价格昂贵、发生免疫排斥反应以及消毒灭菌不彻底导致的疾病传染风险。人工骨因具有取材广泛、可塑性强、生物相容性好、可降解性、可消毒灭菌、操作简便等优点，而受到骨科医师青睐。本课题组前期已成功制备了硫酸葡聚糖/重组人 BMP-2/壳聚糖（dextran sulfate/recombinant human BMP-2/chitosan，DS/rhBMP-2/CS）缓释微球，经验证其具有优良的生物安全性[1-2]。体外实验结果显示[3]，DS/rhBMP-2/CS 缓释微球粒径为（217±8）nm，符合纳米级要求；包封率 85.6%±3%，载药量（47.245±3.321）μg/mg；体外释放 2 h 后出现突释期，2 d 后释放达高峰，之后缓慢下降，释放周期约 28 d。异位成骨实验中，将 DS/rhBMP-2/CS 缓释微球植入 SD 大鼠肌袋内，结果表明，4～16 周植入 DSs/rhBMP-2/CS 的缓释微球组较单纯 rhBMP-2 组植入区周围组织质地硬度高，成骨骨块直径更大，并可见骨膜和血管长入[4]。珊瑚羟基磷灰石（coral hydroxyapatite，CHA）作为无机植骨材料，其具有骨传导性是公认的。单纯 CS 培养的 BMSCs 形态呈球形，而羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）-CS 培养的细胞形态呈纺锤状，因添加的 HA 加强了细胞黏附性[5]。但无机材料本身的脆性、可塑性差等原因，限制了其在骨组织工程中的应用。在上述研究基础上，本研究将 DS/rhBMP-2/CS 缓释微球结合 CHA 进行大段骨缺损的成骨研究，对成骨效果进行影像学评估。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要材料、试剂、仪器
24 周龄雄性新西兰大白兔 57 只，体质量 2.0～2.5 kg，购自广州军区广州总医院实验动物中心。所有动物实验流程均符合伦理道德要求，经中国人民解放军广州总医院伦理委员会批准。
CS[相对分子质量为（50～190）×103，脱乙酰度 85%]，DS（相对分子质量 500×103，硫含量 40%～50%）（Sigma 公司，美国）；rhBMP-2（上海瑞邦生物材料有限公司）；CHA（大小 20 mm×5 mm×5 mm，平均孔径 500 μm，孔隙率 65%，密度 0.9 g/mL，表面积 1.5 m2/g，抗压强度 4.0 MPa；北京意华健科贸有限责任公司）；冰乙酸（相对分子质量 60.05；上海润捷化学试剂有限公司）；ZnSO4（用二次蒸馏水配制成 1 mol/L 的储备液）；甘露醇（天津大茂化学试剂厂）；EDTA 脱钙液（武汉博士德生物工程有限公司）。所有化学试剂在使用前未进一步纯化。
JB-2 型恒温磁力搅拌器（上海雷磁仪器厂）；单道手动 100～1 000 μL DRAGON 移液器（上海赛伯乐仪器有限公司）；移液枪头（Kirgen 公司，美国）；电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ-250 DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；50 mL 一次性无菌离心管（JET BIOFIL 公司）；0.22 μm 和 0.45 μm 针头过滤器（Pall 公司，美国）；20 mL 一次性注射器、1 cm 榄型聚四氟乙烯搅拌子、微量分析型超纯水机（重庆艾科浦科技有限公司）；冷冻干燥器（Labconco 公司，美国）；超低温冰箱（Haier 集团）；超净工作台、摆锯、7.9 mm 锯片（厦门大博颖精医疗器械有限公司）；Aloka Latheta LCT-200 Micro-CT 机（Hitachi 公司，日本）。
1.2 DS/rhBMP-2/CS/CHA 和 rhBMP-2/CHA 人工骨制备
取一定量 CS 溶于 0.175% 乙酸中，配成 1 mg/mL CS 溶液，用 0.45 μm 和 0.22 μm 针头过滤器依次过滤。称取适量 DS 溶于双蒸水，配成 1 mg/mL DS 溶液，再用 0.45 μm 和 0.22 μm 滤膜依次过滤。无菌条件下，取 2.08 mL DS 溶液在 1 500 r/min 转速下搅拌，加入 100 μg rhBMP-2，搅拌 20 min；加入 1.04 mL CS 溶液，搅拌 5 min；加入 0.1 mL ZnSO4，持续搅拌 30 min；加入 5% 甘露醇后持续搅拌均匀，将 CHA 投入溶液中充分浸泡后，转入–80℃ 超低温冰箱中预冻 24 h 后，转移至冷冻干燥器冻干，制成 DS/rhBMP-2/CS/CHA（长度 20 mm）人工骨，备用。
另外于无菌条件下，将 1 mg rhBMP-2 与双蒸水配成 0.1 mg/mL rhBMP-2 溶液；将 CHA 投入溶液中充分浸泡后，转入–80℃ 超低温冰箱中预冻 24 h，转移至冷冻干燥器冻干，制成 rhBMP-2/CHA（长度 20 mm）人工骨，备用。
1.3 实验分组及方法
取 54 只实验动物按随机数字表法随机分为 3 组，每组 18 只，A 组为 CHA 组，B 组为 DS/rhBMP-2/CS/CHA 组，C 组为 rhBMP-2/CHA 组；另设 3 只动物作为空白对照组（D 组），以验证临界骨愈合长度。所有动物以 3% 戊巴比妥（1 mL/kg）耳缘静脉注射麻醉，剔除右前肢毛发，侧卧位，上止血带；手术切口周围注射少量利多卡因局部麻醉；于右前肢中段外侧作一长约 3.0 cm 纵切口，钝性分离浅深筋膜，避开血管，暴露中段桡骨，直视下截取长 20 mm 的桡骨，去除骨膜，冲洗术区。A、B、C 组骨缺损区分别植入 CHA、DS/rhBMP-2/CS/CHA、rhBMP-2/CHA 人工骨，D 组不植入材料。逐层缝合切口，去除止血带，包扎。术后连续肌肉注射青霉素（8 万 U/kg）3 d，观察切口情况，术后 7 d 拆线，分笼独立正常喂养。
1.4 观测指标
1.4.1 X 线片观察
术后 4、8、12 周 A、B、C 组各取 6 只动物，D 组于每个时间点各取 1 只动物。以 3% 戊巴比妥耳缘静脉大剂量注射处死，截取右前肢移植段骨标本，行 X 线侧位扫描，扫描参数：电压 80 kV，电流 0.5 mA。采用 Lane-Sandhu X 线评分标准从新骨形成、骨连接及骨塑形三方面进行骨愈合评价。
1.4.2 Micro-CT 扫描及三维重建观察
获取的标本采用 Micro-CT 进行扫描，扫描参数：电压 80 kV，电流 0.5 mA，层厚 48 μm，分辨率 48 μm，角度 180°。扫描后图像使用 Mimics16.0 软件通过自动划分新生骨和材料灰度值后进行三维重建，并计算新生骨体积。
1.5 统计学分析
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 术后观察
所有实验动物术后均未发现伤口化脓感染，饮食及活动正常；伤口拆线后愈合良好，未见术口崩开及移植物暴露等情况；术后生命体征均平稳，恢复良好。
2.2 X 线片观察
术后 4 周，A 组材料与自体骨之间骨折线较清晰；B、C 组骨折线已模糊，同时两断端伴有新生软骨组织影；D 组骨缺损明显。术后 8 周，A～C 组材料影均较 4 周时有一定程度减低，其中 A 组材料骨折线已模糊；B 组骨缺损愈合结合良好，材料透射影接近自体骨；C 组材料透射影仍明显，但材料与自体骨结合良好；D 组骨缺损未见愈合，断端硬化。术后 12 周，A 组材料结合良好，材料影明显，但骨缺损区基本对合；B 组骨缺损区透射影接近正常骨质，骨愈合良好，逐渐出现骨髓腔（骨中显影较低的部分），同时随着骨生长，材料降解明显，仅残留少许材料，外层皮质骨已形成；C 组骨缺损区愈合良好，材料显影仍明显，断端有新生骨影；D 组未见骨愈合，断端硬化。见图 1。
图1
术后各时间点各组 X 线片观察
从左至右依次为 A、B、C、D 组 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周；c. 术后 12 周
Figure1. X-ray film observation of groups at each time points after operationFrom left to right for groups A, B, C, and D respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
术后各时间点 B 组 X 线片评分显著高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 8、12 周 C 组评分高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
图2
术后各时间点各组 X 线片评分比较
Figure2.
Comparison of X-ray film scores of groups at each time points after operation
2.3 Micro-CT 扫描及三维重建观察
Micro-CT 扫描及三维重建观察示，白色表示正常骨质，浅黄色表示新生骨组织或新生软骨、骨痂。结果显示，术后各时间点 A 组骨缺损区新生骨组织少，成骨形态差；B 组新生骨组织多，骨缺损区骨塑形良好，12 周时逐渐接近正常骨形态；C 组骨缺损区新生骨组织较多，成骨形态一般。见图 3。
图3
术后各时间点各组 Micro-CT 扫描及三维重建观察
从左至右依次为 A、B、C 组 a. 术后 4 周；b. 术后 8 周；c. 术后 12 周
Figure3. Micro-CT scan and three-dimensional reconstructive observation of groups at each time points after operationFrom left to right for groups A, B, and C respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
术后各时间点 B 组新生骨体积均显著高于 A、C 组，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 8 周 C 组评分高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
术后各时间点各组新生骨体积比较
Figure4.
Comparison of new bone volume of groups at each time points after operation
3 讨论
CS 与 DS 结合形成的纳米缓释载体在肿瘤[6-7]、耳鼻喉、眼科[8-9]、基因检测、抗菌[10]、抗病毒、疫苗接种[11]等医学领域被广泛应用。在基质细胞衍生因子 1α（stromal cell-derived factor 1α，SDF-1α）、VEGF、FGF-2、BMP-2、溶菌酶等一类蛋白分子中都含有肝素结合位点，而 DS-CS 载体具有的 DS 外壳正好是肝素的同类物，红外光谱研究表明[12]，含肝素结合位点的蛋白质与 DS-CS 载体可有效且紧密地结合，结合率可达 95%～100%，而且 SDF-1α、VEGF 等蛋白与 DS-CS 的结合不会影响蛋白本身的活性，反而增强了蛋白分子自身的热稳定性。每 100 纳摩尔 DS 带电单位中，当肝素蛋白负载达到 1.5 nmol 单体或 0.75 nmol 二聚体时，DS-CS 纳米级载体的形态和 Zeta 电位不会受到影响。研究表明[3, 12-13]，采用离子交联法制备的 DS/rhBMP-2/CS 复合微球包封率为 85.6%±3%，载药率为（47.245±3.321）μg/mg，而普通 rhBMP-2/CS 复合微球载药率只有（33.437±2.290）μg/mg，因为 CS 与生物蛋白之间的作用为静电作用，无法进行大量且有效的结合。而 DS/rhBMP-2/CS 缓释微球除了 DS 与 CS、CS 与 rhBMP-2 之间的静电作用外，经过硫酸化的葡聚糖片段能够和 rhBMP-2 形成肝素结合位点，结合作用强，提升了 CS 载药的稳定性。
微球自身不具备骨传导性，所以本实验中引入了 CHA 作为 rhBMP-2 诱导成骨的生长支架。HA 已被证实是理想的载体，能够搭载许多药物及具备可持续释放的能力，同时能有效促进组织的血管化，促进组织生长[14]；HA-CS 载体能够延缓并控制 rhBMP-2 的释放，增强成骨效应[15]。CHA 较普通的 HA 具备更好的生物相容性、无毒性及多孔性，作为无机植骨材料，其具有的骨传导性是公认的；但因无机材料本身的脆性、可塑性差等原因，制约了其在骨组织工程中的应用。rhBMP-2 缓释因子与 CHA 结合互为弥补，提供了良好的骨诱导性和传导性[15]。
rhBMP-2 主要对未分化间充质细胞和骨系细胞起到募集和分化的作用[16]。骨形成早期，rhBMP-2 促使未分化间充质细胞向骨生成中心聚集分化为骨母细胞，rhBMP-2 还可通过增强或抑制细胞内的某些特异性蛋白的分泌，促使成纤维细胞分化为成骨细胞、成肌细胞分化为肥大的软骨细胞，并促进基质钙化。BMP-2 维持成骨细胞特有细胞表征，诱导成骨细胞标志物水平升高。骨形成后期，BMP-2 作为一种破骨细胞分化因子与其他分化因子直接或间接刺激破骨细胞分化，参与骨的重建[17-20]。
本研究结果均表明，B 组成骨效果最满意，由于 DS-CS 微球的缓释作用，rhBMP-2 在各时间点呈缓慢持续释放。骨形成初期，rhBMP-2 的释放量最多，到骨形成中后期，B 组中的 rhBMP-2 仍在释放并作用，稳定地发挥诱导成骨效应。伴随骨生长的过程，B 组的人工骨材料降解可以更加彻底。在同等剂量条件下（含 rhBMP-2 均为 100 μg），成骨早期 C 组 rhBMP-2 大量释放，成骨效应明显；后期由于 rhBMP-2 短暂的半衰期等因素，rhBMP-2 大量失活，失去有效和持续的成骨效应，但作用效果仍优于未添加 rhBMP-2 的 A 组；A 组因缺乏生长因子，在整个骨生长周期中成骨作用缓慢，材料降解最慢。
B 组各时间点 X 线片评分及新生骨体积均优于 A、C 组。新生骨体积 Micro-CT 扫描分析结果是经系统自动划分材料和新生骨的灰度值并计算得到，结果更客观，且 Micro-CT 已被广泛用于骨三维微结构及骨组织工程的定量测定。Micro-CT 扫描可更加清晰直观地观察组织内的新生骨情况，而 Lane-Sandhu X 线片评分结果具有一定主观性，且 X 线片观察以二维结果为主，不及 Micro-CT 对组织的三维评价特性[21]。所以，研究者更倾向于 Micro-CT 观察结果。
空白对照组术后 4、8、12 周放射学上均未见到骨缺损区愈合，12 周时断端出现硬化骨（死骨），结果表明 20 mm 的骨缺损长度未见明显新生骨生长[22-23]。
综上述，DS/rhBMP-2/CS/CHA 缓释人工骨生物相容性好，成骨作用效果显著，骨生长过程中材料降解更快且制备简易，可为未来将骨组织工程应用于临床治疗骨缺损提供新思路。
