引用本文： 胡珍珍, 陈彬, 李阳, 姜卫, 文丽红, 姬付康, 杨晓, 王晋煌, 柳大烈. 曲尼司特对小鼠烧伤后创面愈合的影响及给药时间研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(4): 465-472. doi: 10.7507/1002-1892.201611033 复制
增生性瘢痕是伤口异常愈合导致胶原合成及沉积增加的一种纤维化疾病，是烧伤和创伤后常见并发症，常伴有疼痛、瘙痒以及关节活动受限[1-2]，严重时甚至会影响患者生活质量[3]。曲尼司特作为一种 H1 受体阻滞剂，能有效预防和治疗部分纤维化疾病，其中包括增生性瘢痕，因此也被认为是一种新型的抗瘢痕药物，我们前期临床研究也得到了相似结果[4]。本研究以深Ⅱ度烧伤小鼠创面作为观测对象，通过不同时间点进行曲尼司特干预，分析其抑制瘢痕增生的作用机制，以及其抑制瘢痕增生的效果是否与给药时间有关，也为曲尼司特用于临床治疗瘢痕类疾病奠定理论基础。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
7～8 周龄清洁级雄性昆明小鼠 66 只，体质量 18～22 g，由南方医科大学动物实验中心提供，实验前适应性喂养 5 d。
曲尼司特胶囊（中国药科大学制药有限公司）；兔抗鼠 Ⅰ、Ⅲ型胶原一抗（Abcam 公司，美国）；小鼠 TGF-β1 ELISA 试剂盒（R&D 公司，美国）；小鼠组胺 ELISA 试剂盒（Cayman 公司，美国）。DP70 型光学显微镜（Olympus 公司，日本）；H-7000FA 型透射电镜（Hitachi 公司，日本）。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型制备 66 只小鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后，剃毛器剔除背部毛发，面积约 2 cm×2 cm。24 h 后小鼠同上法再次麻醉后，固定于烫伤板，将其背部剃毛区域置于 100℃ 水中持续 8 s，制成烧伤面积约 1 cm×1 cm 的深Ⅱ度烧伤模型。模型建立后，每只小鼠腹腔注射乳酸林格液 0.5 mL 抗休克。模型制备后背部创面暴露，不给予外用药物，分笼喂养，自由进食水。
1.2.2 实验分组及方法 模型制备后，将 66 只小鼠随机分为 4 组，分别为对照组（n=18）、早期干预组（n=18）、中期干预组（n=18）和晚期干预组（n=12）。早、中、晚期干预组分别于模型制备后当天、7 d、14 d 开始进行曲尼司特 200 mg/（kg·d）[5]灌胃，对照组于模型制备后当天开始等体积生理盐水灌胃。对照组及早、中期干预组分别于模型制备后 14、28、42 d，晚期干预组于 28、42 d，随机选取 6 只小鼠处死后观测。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察 肉眼观察各组小鼠创面愈合情况，有无渗血、水肿、感染发生，以及创面开始结痂、脱痂时间；以创面痂壳脱落作为创面愈合标准，记录创面愈合时间。
1.3.2 组织学及免疫组织化学染色观察 各时间点取创面新生组织，经甲醛固定、漂洗、脱水等处理后切片。首先，取部分切片常规行 HE 染色，于高倍显微镜下观察创面组织结构，确定标本取自于创面愈合组织，以提高实验检测结果准确性。然后，取剩余切片常规行甲苯胺蓝、Masson 染色及Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学染色。甲苯胺蓝染色切片观察肥大细胞形态，每张切片取 5 个视野，于 400 倍镜下人工计数肥大细胞；Masson 染色切片观察总胶原情况；免疫组织化学染色观察Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况。取 Masson 染色及免疫组织化学染色切片，于 400 倍镜下每张切片取 5 个视野拍照，采用 Image Pro Plus 6.0 图像分析系统测量吸光度（A）值，作为总胶原、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平的半定量参数，并计算Ⅰ/Ⅲ型胶原含量比值。
1.3.3 ELISA 检测组胺及 TGF-β1 含量 ① 参照小鼠组胺 ELISA 试剂盒说明书步骤进行操作，使用多克隆抗组胺抗体检测各样本 450 nm 波长处A 值，并以组胺标准品系列浓度为 x 轴，对应的 450 nm 波长A 值为 y 轴，在 CurveExpert1.4 软件中选择拟合度最好的标准曲线方程计算各样品中组胺浓度。② 参照小鼠 TG-β1 ELISA 试剂盒说明书步骤进行操作，取上清液采用酶标仪测量 492 nm 波长处A 值，通过标准曲线查得相应 TGF-β1 含量。
1.3.4 透射电镜观察 取术后 28 d 创面新生组织经 3% 戊二醛固定，1% 四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Epon812 包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察成纤维细胞的超微结构。
1.4 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用 LSD 法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
各组创面愈合大体观察情况相似。第 2 天开始创面渗出物形成褐色痂壳覆盖创面，第 3 天创面开始挛缩，第 7 天出现上皮爬行，创面痂壳干燥，并随时间延长从四周向中心逐渐脱落，约 11 d 后痂壳全部脱落，创面基本愈合。见图 1。
图1
各组造模后 14 d 创面愈合大体观察 a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure1.
The general observation of the wound healing in each group at 14 days after modeling a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
对照组以及早、中、晚期干预组创面愈合时间分别为（10.7±0.7）、（11.2±0.8）、（11.0±0.6）、（10.5±0.4）d，组间比较差异无统计学意义（F=1.105，P=0.371）。
2.2 组织学及免疫组织化学染色观察
2.2.1 甲苯胺蓝染色 镜下观察示，肥大细胞细胞质呈紫红色，细胞核呈蓝色，散在于真皮组织及瘢痕组织中，细胞呈圆形、椭圆形或不规则形，部分细胞颜色变浅，呈脱颗粒现象。各组 14 d 时肥大细胞较少，28 d 最多且脱颗粒明显，42 d 肥大细胞逐渐减少且以脱颗粒状态为主（图 2）。各时间点对照组肥大细胞最多，晚期干预组次之，之后分别为中期干预组、早期干预组。除 42 d 时对照组肥大细胞数与晚期干预组比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余各时间点各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
图2
各组造模后 28 d 创面甲苯胺蓝染色观察（×400） 红箭头示静止状态下细胞膜完整的肥大细胞，黑箭头示活跃状态下脱颗粒的肥大细胞 a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure2.
The toluidine blue staining observation of wound in each group at 28 days after modeling (×400) Red arrow indicated static mast cells with intact cell membrane, black arrow indicated active mast cells under degranulation a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
表1
各时间点各组肥大细胞计数比较（
n=6，个/mm2，
）
Table1.
Comparison of the mast cells number between groups at each time point (
n=6, cells/mm2,
)
2.2.2 Masson染色及免疫组织化学染色观测 各时间点对照组总胶原含量最高，其次为晚期干预组，之后为中期干预组、早期干预组。除对照组与晚期干预组比较总胶原含量差异无统计学意义外（P>0.05），其余各时间点各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。对照组与晚期干预组以Ⅰ型胶原为主，而早期干预组和中期干预组以Ⅲ型胶原为主。各时间点，对照组Ⅰ/Ⅲ型胶原含量比值最高，其次为晚期干预组，之后为中期干预组、早期干预组，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3～5 及表 2。
图3
各组造模后 42 d 创面 Masson 染色观察（×400） a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure3.
Masson staining observation of wound in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
图4
各组造模后 42 d 创面Ⅰ型胶原免疫组织化学染色观察（×400） a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure4.
The collagen type I immunohistochemical staining observation in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
图5
各组造模后 42 d 创面Ⅲ型胶原免疫组织化学染色观察（×400） a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure5.
The collagen type III immunohistochemical staining observation in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
表2
各时间点各组总胶原含量及Ⅰ/Ⅲ型胶原含量比值比较（
n=6，
）
Table2.
Comparison of collagen content and the I/III collagen ratio at each time point (
n=6,
)
2.3 ELISA 检测
2.3.1 组胺含量 各组 28 d 时创面新生组织中组胺含量最高。各时间点对照组组胺含量最高，其次为晚期干预组，之后分别为中期干预组、早期干预组。除 42 d 对照组与晚期干预组比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余各时间点各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 3。
表3
各时间点各组组胺以及 TGF-β1 含量比较（
n=6，
）
Table3.
Comparison of the histamine content and the TGF-β1 content at each time point (
n=6,
)
2.3.2 TGF-β1 含量 随时间延长，各组创面新生组织中 TGF-β1 含量呈逐渐下降趋势。各时间点对照组 TGF-β1 含量最高，其次为晚期干预组，之后分别为中期干预组、早期干预组。各时间点各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 3。
2.4 透射电镜观察
对照组：成纤维细胞细胞核内染色质分布均匀，核大、呈长梭形，核仁明显，细胞质内有丰富的粗面内质网，结构清晰，细胞周围可见丰富细密排列不规则的胶原纤维。早、中期干预组：与对照组相比，成纤维细胞结构明显改变，核内染色质分布不均匀，细胞质内粗面内质网不发达或扩张，呈功能异常表现，细胞周围胶原纤维排列疏松、规则，且早期干预组细胞膜已消失，核仁固缩。晚期干预组：成纤维细胞结构与对照组相近，内质网发达，细胞结构清晰，核仁明显，但细胞周围胶原纤维的排列明显较对照组疏松、有规则，且与早期干预组和中期干预组相比纤维更粗。见图 6。
图6
透射电镜观察造模后 28 d 各组成纤维细胞超微结构（×15 k） a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure6.
The ultrastructure of fibroblasts under transmission electron microscope at 28 days after modeling (×15 k) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
3 讨论
研究表明，瘢痕是由于创面愈合过程中炎性反应过度、胶原沉积过量以及伤口收缩剧烈所致[6-8]。伤口愈合过程是一个连续而又重叠的动态过程，传统分为3个时期，分别为炎性反应期、纤维组织增殖期和瘢痕组织重塑期。创面形成初始进入炎性反应阶段，此时成纤维细胞迁移进入伤口并产生胶原，协助新生的肉芽组织取代血栓形成；进入纤维组织增殖期后，真皮组织中的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，促使伤口收缩，减小创面面积，促使伤口表皮化完成；最后交叉编织排列的成熟胶原纤维代替平行排列的不成熟胶原纤维，使伤口更牢固，完成最后的修复重塑过程。肌成纤维细胞及胶原含量过高导致肉芽组织生长过量，表明瘢痕愈合过程中炎性反应期延长及表皮化延迟，而重塑阶段若未正常进行，则会导致非成熟胶原纤维异常增多[9]。
TGF-β1 是细胞因子家族成员之一，主要通过T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及骨髓中的血小板和前体细胞分泌，并参与一系列生物过程的调节，对伤口愈合及瘢痕增生均有重要作用[10]。TGF-β1 被认为是引起瘢痕增生的最重要细胞因子，在皮肤伤口愈合过程中 TGF-β1 增加会导致瘢痕增生，其促瘢痕增生的作用主要通过 3 个途径实现[10-11]：其一，通过刺激成纤维细胞增殖来促进胶原蛋白大量合成；其二，诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞；其三，促进细胞外基质蛋白的异常沉积。与正常皮肤组织相比，瘢痕组织中胶原含量明显增加，且以排列紊乱的Ⅰ型胶原为主，瘢痕中Ⅰ型胶原越多，质地越硬[5]。TGF-β1 不能直接促进胶原降解，但是可调整Ⅰ/Ⅲ型胶原比例，所以直接抑制 TGF-β1 的活性，可调整瘢痕中Ⅰ/Ⅲ型胶原比例而不会减少总胶原含量。有研究表明，抑制 TGF-β1 的生物学活性可能调整瘢痕组织的纤维化紊乱，且动物实验已证实，局部外用 TGF-β1 抑制剂可促使瘢痕成熟并改变瘢痕的组织学特征[12]。
肥大细胞是固有的炎性反应细胞，当皮肤受损伤时能迅速活化以参与机体的各种免疫反应，其活性主要通过脱颗粒反应实现[13]。肥大细胞是炎性反应的重要细胞，且炎性反应与瘢痕增生有密切关系，瘢痕愈合的伤口中肥大细胞数及脱颗粒率显著升高，而无瘢痕愈合的伤口则相反[14]。肥大细胞促进瘢痕增生主要是通过贮存、释放组胺等活性物质，刺激微血管内皮细胞增殖活化形成大量微血管来促进成纤维细胞增殖，动物模型已证实，阻止肥大细胞脱颗粒或中和肥大细胞介质的释放能有效抑制瘢痕增生[13,15]。组胺通常以非活化的形式存在于肥大细胞和嗜碱性粒细胞中，当机体受到创伤和抗原抗体反应等外界刺激后，局部组织以活化的形式分离出组胺并通过脱颗粒释放到细胞外，参与早期炎性反应。同时，组胺还是一种有效的促有丝分裂剂，可刺激成纤维细胞生长，同时导致胶原合成及胶原沉积增加，促进瘢痕形成[16-17]。
曲尼司特被认为是新一代抗纤维化增殖的药物，其抑制瘢痕增生的能力在临床上已得到一定程度证实[18]。目前研究发现其作用机制主要是：稳定肥大细胞细胞膜，阻止肥大细胞脱颗粒释放组胺等化学介质；抑制成纤维细胞的聚集和增殖，选择性抑制胶原合成，抑制 TGF-β1 的释放及其受体的表达，从而有效抑制瘢痕增生[19]。
本研究结果显示，各组创面愈合时间并无显著差异，其原因可能是其他细胞途径代偿了 TGF-β1 促伤口愈合的作用，最终使伤口正常愈合，因此本研究所采用剂量的曲尼司特不足以对创面愈合造成影响。创面新生组织病理检测发现，早期干预组小鼠肥大细胞数、总胶原含量、Ⅰ/Ⅲ型胶原含量比值、TGF-β1 含量、组胺含量均明显低于对照组、中期干预组和晚期干预组；早期干预组、中期干预组、晚期干预组成纤维细胞超微结构与对照组相比，呈现不同程度改变，且越早开始干预的成纤维细胞结构改变越显著。结合陈彬等[4]的临床研究表明，曲尼司特能减轻并改善瘢痕的临床表现特征，提示曲尼司特影响瘢痕形成的作用开始于瘢痕形成早期。
综上述，曲尼司特干预对小鼠创面愈合时间无明显影响，但烧伤后即刻进行曲尼司特干预能明显降低愈伤组织中肥大细胞数量，并阻止肥大细胞活化脱颗粒释放组胺，抑制细胞因子 TGF-β1 的表达，抑制成纤维细胞胶原合成能力及调节胶原合成比例，有显著抑制瘢痕增生的作用。但本实验样本量小，观察时间较短，给药方式等其他因素对小鼠造成的刺激可能会影响实验结果准确性，这些不足有待在今后研究中进一步完善。
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增生性瘢痕是伤口异常愈合导致胶原合成及沉积增加的一种纤维化疾病，是烧伤和创伤后常见并发症，常伴有疼痛、瘙痒以及关节活动受限[1-2]，严重时甚至会影响患者生活质量[3]。曲尼司特作为一种 H1 受体阻滞剂，能有效预防和治疗部分纤维化疾病，其中包括增生性瘢痕，因此也被认为是一种新型的抗瘢痕药物，我们前期临床研究也得到了相似结果[4]。本研究以深Ⅱ度烧伤小鼠创面作为观测对象，通过不同时间点进行曲尼司特干预，分析其抑制瘢痕增生的作用机制，以及其抑制瘢痕增生的效果是否与给药时间有关，也为曲尼司特用于临床治疗瘢痕类疾病奠定理论基础。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
7～8 周龄清洁级雄性昆明小鼠 66 只，体质量 18～22 g，由南方医科大学动物实验中心提供，实验前适应性喂养 5 d。
曲尼司特胶囊（中国药科大学制药有限公司）；兔抗鼠 Ⅰ、Ⅲ型胶原一抗（Abcam 公司，美国）；小鼠 TGF-β1 ELISA 试剂盒（R&D 公司，美国）；小鼠组胺 ELISA 试剂盒（Cayman 公司，美国）。DP70 型光学显微镜（Olympus 公司，日本）；H-7000FA 型透射电镜（Hitachi 公司，日本）。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型制备 66 只小鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（400 mg/kg）麻醉后，剃毛器剔除背部毛发，面积约 2 cm×2 cm。24 h 后小鼠同上法再次麻醉后，固定于烫伤板，将其背部剃毛区域置于 100℃ 水中持续 8 s，制成烧伤面积约 1 cm×1 cm 的深Ⅱ度烧伤模型。模型建立后，每只小鼠腹腔注射乳酸林格液 0.5 mL 抗休克。模型制备后背部创面暴露，不给予外用药物，分笼喂养，自由进食水。
1.2.2 实验分组及方法 模型制备后，将 66 只小鼠随机分为 4 组，分别为对照组（n=18）、早期干预组（n=18）、中期干预组（n=18）和晚期干预组（n=12）。早、中、晚期干预组分别于模型制备后当天、7 d、14 d 开始进行曲尼司特 200 mg/（kg·d）[5]灌胃，对照组于模型制备后当天开始等体积生理盐水灌胃。对照组及早、中期干预组分别于模型制备后 14、28、42 d，晚期干预组于 28、42 d，随机选取 6 只小鼠处死后观测。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察 肉眼观察各组小鼠创面愈合情况，有无渗血、水肿、感染发生，以及创面开始结痂、脱痂时间；以创面痂壳脱落作为创面愈合标准，记录创面愈合时间。
1.3.2 组织学及免疫组织化学染色观察 各时间点取创面新生组织，经甲醛固定、漂洗、脱水等处理后切片。首先，取部分切片常规行 HE 染色，于高倍显微镜下观察创面组织结构，确定标本取自于创面愈合组织，以提高实验检测结果准确性。然后，取剩余切片常规行甲苯胺蓝、Masson 染色及Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学染色。甲苯胺蓝染色切片观察肥大细胞形态，每张切片取 5 个视野，于 400 倍镜下人工计数肥大细胞；Masson 染色切片观察总胶原情况；免疫组织化学染色观察Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况。取 Masson 染色及免疫组织化学染色切片，于 400 倍镜下每张切片取 5 个视野拍照，采用 Image Pro Plus 6.0 图像分析系统测量吸光度（A）值，作为总胶原、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平的半定量参数，并计算Ⅰ/Ⅲ型胶原含量比值。
1.3.3 ELISA 检测组胺及 TGF-β1 含量 ① 参照小鼠组胺 ELISA 试剂盒说明书步骤进行操作，使用多克隆抗组胺抗体检测各样本 450 nm 波长处A 值，并以组胺标准品系列浓度为 x 轴，对应的 450 nm 波长A 值为 y 轴，在 CurveExpert1.4 软件中选择拟合度最好的标准曲线方程计算各样品中组胺浓度。② 参照小鼠 TG-β1 ELISA 试剂盒说明书步骤进行操作，取上清液采用酶标仪测量 492 nm 波长处A 值，通过标准曲线查得相应 TGF-β1 含量。
1.3.4 透射电镜观察 取术后 28 d 创面新生组织经 3% 戊二醛固定，1% 四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Epon812 包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察成纤维细胞的超微结构。
1.4 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用 LSD 法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
各组创面愈合大体观察情况相似。第 2 天开始创面渗出物形成褐色痂壳覆盖创面，第 3 天创面开始挛缩，第 7 天出现上皮爬行，创面痂壳干燥，并随时间延长从四周向中心逐渐脱落，约 11 d 后痂壳全部脱落，创面基本愈合。见图 1。
图1
各组造模后 14 d 创面愈合大体观察 a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure1.
The general observation of the wound healing in each group at 14 days after modeling a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
对照组以及早、中、晚期干预组创面愈合时间分别为（10.7±0.7）、（11.2±0.8）、（11.0±0.6）、（10.5±0.4）d，组间比较差异无统计学意义（F=1.105，P=0.371）。
2.2 组织学及免疫组织化学染色观察
2.2.1 甲苯胺蓝染色 镜下观察示，肥大细胞细胞质呈紫红色，细胞核呈蓝色，散在于真皮组织及瘢痕组织中，细胞呈圆形、椭圆形或不规则形，部分细胞颜色变浅，呈脱颗粒现象。各组 14 d 时肥大细胞较少，28 d 最多且脱颗粒明显，42 d 肥大细胞逐渐减少且以脱颗粒状态为主（图 2）。各时间点对照组肥大细胞最多，晚期干预组次之，之后分别为中期干预组、早期干预组。除 42 d 时对照组肥大细胞数与晚期干预组比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余各时间点各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
图2
各组造模后 28 d 创面甲苯胺蓝染色观察（×400） 红箭头示静止状态下细胞膜完整的肥大细胞，黑箭头示活跃状态下脱颗粒的肥大细胞 a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure2.
The toluidine blue staining observation of wound in each group at 28 days after modeling (×400) Red arrow indicated static mast cells with intact cell membrane, black arrow indicated active mast cells under degranulation a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
表1
各时间点各组肥大细胞计数比较（
n=6，个/mm2，
）
Table1.
Comparison of the mast cells number between groups at each time point (
n=6, cells/mm2,
)
2.2.2 Masson染色及免疫组织化学染色观测 各时间点对照组总胶原含量最高，其次为晚期干预组，之后为中期干预组、早期干预组。除对照组与晚期干预组比较总胶原含量差异无统计学意义外（P>0.05），其余各时间点各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。对照组与晚期干预组以Ⅰ型胶原为主，而早期干预组和中期干预组以Ⅲ型胶原为主。各时间点，对照组Ⅰ/Ⅲ型胶原含量比值最高，其次为晚期干预组，之后为中期干预组、早期干预组，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 3～5 及表 2。
图3
各组造模后 42 d 创面 Masson 染色观察（×400） a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure3.
Masson staining observation of wound in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
图4
各组造模后 42 d 创面Ⅰ型胶原免疫组织化学染色观察（×400） a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure4.
The collagen type I immunohistochemical staining observation in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
图5
各组造模后 42 d 创面Ⅲ型胶原免疫组织化学染色观察（×400） a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure5.
The collagen type III immunohistochemical staining observation in each group at 42 days after modeling (×400) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
表2
各时间点各组总胶原含量及Ⅰ/Ⅲ型胶原含量比值比较（
n=6，
）
Table2.
Comparison of collagen content and the I/III collagen ratio at each time point (
n=6,
)
2.3 ELISA 检测
2.3.1 组胺含量 各组 28 d 时创面新生组织中组胺含量最高。各时间点对照组组胺含量最高，其次为晚期干预组，之后分别为中期干预组、早期干预组。除 42 d 对照组与晚期干预组比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余各时间点各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 3。
表3
各时间点各组组胺以及 TGF-β1 含量比较（
n=6，
）
Table3.
Comparison of the histamine content and the TGF-β1 content at each time point (
n=6,
)
2.3.2 TGF-β1 含量 随时间延长，各组创面新生组织中 TGF-β1 含量呈逐渐下降趋势。各时间点对照组 TGF-β1 含量最高，其次为晚期干预组，之后分别为中期干预组、早期干预组。各时间点各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 3。
2.4 透射电镜观察
对照组：成纤维细胞细胞核内染色质分布均匀，核大、呈长梭形，核仁明显，细胞质内有丰富的粗面内质网，结构清晰，细胞周围可见丰富细密排列不规则的胶原纤维。早、中期干预组：与对照组相比，成纤维细胞结构明显改变，核内染色质分布不均匀，细胞质内粗面内质网不发达或扩张，呈功能异常表现，细胞周围胶原纤维排列疏松、规则，且早期干预组细胞膜已消失，核仁固缩。晚期干预组：成纤维细胞结构与对照组相近，内质网发达，细胞结构清晰，核仁明显，但细胞周围胶原纤维的排列明显较对照组疏松、有规则，且与早期干预组和中期干预组相比纤维更粗。见图 6。
图6
透射电镜观察造模后 28 d 各组成纤维细胞超微结构（×15 k） a. 对照组；b. 早期干预组；c. 中期干预组；d. 晚期干预组
Figure6.
The ultrastructure of fibroblasts under transmission electron microscope at 28 days after modeling (×15 k) a. Control group; b. Early intervention group; c. Medium intervention group; d. Late intervention group
3 讨论
研究表明，瘢痕是由于创面愈合过程中炎性反应过度、胶原沉积过量以及伤口收缩剧烈所致[6-8]。伤口愈合过程是一个连续而又重叠的动态过程，传统分为3个时期，分别为炎性反应期、纤维组织增殖期和瘢痕组织重塑期。创面形成初始进入炎性反应阶段，此时成纤维细胞迁移进入伤口并产生胶原，协助新生的肉芽组织取代血栓形成；进入纤维组织增殖期后，真皮组织中的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，促使伤口收缩，减小创面面积，促使伤口表皮化完成；最后交叉编织排列的成熟胶原纤维代替平行排列的不成熟胶原纤维，使伤口更牢固，完成最后的修复重塑过程。肌成纤维细胞及胶原含量过高导致肉芽组织生长过量，表明瘢痕愈合过程中炎性反应期延长及表皮化延迟，而重塑阶段若未正常进行，则会导致非成熟胶原纤维异常增多[9]。
TGF-β1 是细胞因子家族成员之一，主要通过T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及骨髓中的血小板和前体细胞分泌，并参与一系列生物过程的调节，对伤口愈合及瘢痕增生均有重要作用[10]。TGF-β1 被认为是引起瘢痕增生的最重要细胞因子，在皮肤伤口愈合过程中 TGF-β1 增加会导致瘢痕增生，其促瘢痕增生的作用主要通过 3 个途径实现[10-11]：其一，通过刺激成纤维细胞增殖来促进胶原蛋白大量合成；其二，诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞；其三，促进细胞外基质蛋白的异常沉积。与正常皮肤组织相比，瘢痕组织中胶原含量明显增加，且以排列紊乱的Ⅰ型胶原为主，瘢痕中Ⅰ型胶原越多，质地越硬[5]。TGF-β1 不能直接促进胶原降解，但是可调整Ⅰ/Ⅲ型胶原比例，所以直接抑制 TGF-β1 的活性，可调整瘢痕中Ⅰ/Ⅲ型胶原比例而不会减少总胶原含量。有研究表明，抑制 TGF-β1 的生物学活性可能调整瘢痕组织的纤维化紊乱，且动物实验已证实，局部外用 TGF-β1 抑制剂可促使瘢痕成熟并改变瘢痕的组织学特征[12]。
肥大细胞是固有的炎性反应细胞，当皮肤受损伤时能迅速活化以参与机体的各种免疫反应，其活性主要通过脱颗粒反应实现[13]。肥大细胞是炎性反应的重要细胞，且炎性反应与瘢痕增生有密切关系，瘢痕愈合的伤口中肥大细胞数及脱颗粒率显著升高，而无瘢痕愈合的伤口则相反[14]。肥大细胞促进瘢痕增生主要是通过贮存、释放组胺等活性物质，刺激微血管内皮细胞增殖活化形成大量微血管来促进成纤维细胞增殖，动物模型已证实，阻止肥大细胞脱颗粒或中和肥大细胞介质的释放能有效抑制瘢痕增生[13,15]。组胺通常以非活化的形式存在于肥大细胞和嗜碱性粒细胞中，当机体受到创伤和抗原抗体反应等外界刺激后，局部组织以活化的形式分离出组胺并通过脱颗粒释放到细胞外，参与早期炎性反应。同时，组胺还是一种有效的促有丝分裂剂，可刺激成纤维细胞生长，同时导致胶原合成及胶原沉积增加，促进瘢痕形成[16-17]。
曲尼司特被认为是新一代抗纤维化增殖的药物，其抑制瘢痕增生的能力在临床上已得到一定程度证实[18]。目前研究发现其作用机制主要是：稳定肥大细胞细胞膜，阻止肥大细胞脱颗粒释放组胺等化学介质；抑制成纤维细胞的聚集和增殖，选择性抑制胶原合成，抑制 TGF-β1 的释放及其受体的表达，从而有效抑制瘢痕增生[19]。
本研究结果显示，各组创面愈合时间并无显著差异，其原因可能是其他细胞途径代偿了 TGF-β1 促伤口愈合的作用，最终使伤口正常愈合，因此本研究所采用剂量的曲尼司特不足以对创面愈合造成影响。创面新生组织病理检测发现，早期干预组小鼠肥大细胞数、总胶原含量、Ⅰ/Ⅲ型胶原含量比值、TGF-β1 含量、组胺含量均明显低于对照组、中期干预组和晚期干预组；早期干预组、中期干预组、晚期干预组成纤维细胞超微结构与对照组相比，呈现不同程度改变，且越早开始干预的成纤维细胞结构改变越显著。结合陈彬等[4]的临床研究表明，曲尼司特能减轻并改善瘢痕的临床表现特征，提示曲尼司特影响瘢痕形成的作用开始于瘢痕形成早期。
综上述，曲尼司特干预对小鼠创面愈合时间无明显影响，但烧伤后即刻进行曲尼司特干预能明显降低愈伤组织中肥大细胞数量，并阻止肥大细胞活化脱颗粒释放组胺，抑制细胞因子 TGF-β1 的表达，抑制成纤维细胞胶原合成能力及调节胶原合成比例，有显著抑制瘢痕增生的作用。但本实验样本量小，观察时间较短，给药方式等其他因素对小鼠造成的刺激可能会影响实验结果准确性，这些不足有待在今后研究中进一步完善。
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