引用本文： 任莉荣, 徐永清, 王海, 何晓清, 宋慕国, 陈学秋. 金黄色葡萄球菌脂磷壁酸对破骨细胞分化的影响. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(2): 180-184. doi: 10.7507/1002-1892.201610077 复制
骨组织在生理状态下会持续进行骨重建，成骨细胞调节骨形成，破骨细胞调节骨吸收，二者动态平衡对骨骼形状及骨矿代谢维持具有重要作用[1]。这一平衡被破坏会导致骨代谢紊乱，最终导致各种病理性骨病。骨髓炎是一种骨组织感染，以化脓性炎症、异常骨重建、难控性骨吸收为特征[2]，常导致感染性骨缺损，是骨科治疗难题。金黄色葡萄球菌是引起骨髓炎最常见致病菌[3]，但其导致感染性骨缺损的机制尚不明确。金黄色葡萄球菌脂磷壁酸（Staphylococcal lipoteichoic acid，LTA-sa）是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一个重要毒力因子[4]，其与脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）一样都有致炎特性及结构相似性[5]。Kishimoto 等[6]研究发现，LPS 能促进破骨细胞分化形成、促进骨吸收，而 LTA-sa 对破骨细胞分化过程的影响国内外研究较少。为此，本研究采用不同浓度的 LTA-sa 作用于 RAW264.7 细胞，以观察其对破骨细胞分化形成的作用，报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
RAW264.7 细胞（昆明动物研究所）。LTA-sa（Invitrogen 公司，美国），将该粉末用 PBS 配制成浓度为 1 μg/mL 的溶液，再根据实验所需浓度进行稀释；PBS 及 H-DMEM 培养基（HyClone 公司，美国）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；鼠 NF-κB 受体活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL；R&D Systems 公司，美国）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒（Sigma 公司，美国）。
COAS（Corning Osteo Assay Surface）24 孔板（Corning 公司，美国）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；D90 型倒置相差显微镜（南京江南光电股份有限公司）；SW-CJ-1F 型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Image-Pro Plus 6.0 软件（Media Cybernetics 公司，美国）。
1.2 实验分组
根据培养条件不同，实验分为 5 组，分别为 LTA-sa 100 ng/mL 组（A 组）、LTA-sa 200 ng/mL 组（B 组）、LTA-sa 400 ng/mL 组（C 组）、阳性对照组（D 组，RANKL 100 ng/mL）、空白对照组（E 组，等体积 PBS）。
1.3 观测指标
1.3.1 TRAP 染色观察 取 RAW264.7 细胞根据实验分组（A～E 组），每组设 6 个复孔。细胞以 5 × 103 个/孔浓度接种于 96 孔板，使用完全培养基（含 15% FBS、1% 青链霉素混合溶液的 H-DMEM），于 37 ℃、5% CO2 细胞培养箱内培养过夜后，每组给予对应浓度 LTA-sa、RANKL 及 PBS，然后将培养板置于 37℃、5% CO2 细胞培养箱进行诱导培养，每 3 天换液 1 次，换液后重复加入 LTA-sa、RANKL 及 PBS，诱导培养后第 5 天进行 TRAP 染色。基本操作步骤：① 用枸橼酸、丙酮及甲醛配制固定液，室温固定细胞 30～60 s；② 去离子水清洗 3 遍，加入 TRAP 染液，37℃ 避光染色 1 h；③ 去离子水清洗 2 遍，苏木素染色 1 min；④ 碱性自来水漂洗 3～4 遍，自然晾干。倒置相差显微镜下观察，细胞质内见红色酒石酸酸性磷酸酶活性颗粒者为 TRAP 阳性细胞。于 200 倍镜下计数每孔破骨样细胞（纳入标准[7]：TRAP 阳性且细胞核≥3 个）。
1.3.2 骨吸收凹陷观测 取 RAW264.7 细胞根据实验分组（A～E 组），每组设 6 个复孔。细胞以 2 × 104 个/孔浓度接种于 COAS 24 孔板，同 1.3.1 方法进行诱导培养。诱导培养后第 5 天，移除培养基，PBS 漂洗 2 次，每孔加入 5% 次氯酸钠溶液 1 mL，室温放置 5 min，以移除培养板内细胞；去离子水清洗培养板 3 次，室温放置 4 h 待其干燥。倒置相差显微镜下观察骨吸收凹陷形成情况，用 Image-Pro Plus 6.0 软件测量骨吸收凹陷面积及整个视野面积，计算骨吸收凹陷面积占整个视野面积的比值。
1.3.3 MTT 检测 取 RAW264.7 细胞根据实验分组（A、B、C、E 组），每组设 10 个复孔。细胞以 5 × 103 个/孔浓度接种于 96 孔板，同 1.3.1 方法进行诱导培养。诱导培养后第 5 天，每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL，避光条件下继续培养 4 h，吸弃培养液，每孔加入 150 μL DMSO，避光震荡 10 min。于酶标仪上用 570 nm 波长检测吸光度（A）值。
1.4 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数 ± 标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准α = 0.05。
2 结果
2.1 TRAP 染色观察
诱导培养后第 5 天，各组均可见破骨样细胞形成（图 1）。A～E 组破骨样细胞数分别为（73.15±5.65）、（155.54±5.89）、（238.15±5.13）、（580.85±12.14）、（21.23±4.19）个/孔。A～D 组破骨样细胞数均多于 E 组；且随 LTA-sa 浓度增加，A、B、C 组破骨样细胞数逐渐增加，但均低于 D 组。各组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
图1
各组 TRAP 染色观察（倒置相差显微镜 ×200） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组； e. E 组
Figure1.
TRAP staining observation in each group (Inverted phase contrast microscopy × 200) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.2 骨吸收凹陷观测
诱导培养后第 5 天，各组 COAS 24 孔板内均见骨吸收凹陷形成（图 2）。A～E 组骨吸收凹陷面积占整个视野面积的比值分别为 0.001 947±0.000 118、0.002 671±0.000 092、0.004 499±0.000 100、0.009 595±0.001 017、0.000 167±0.000 122。A～D 组骨吸收凹陷面积占整个视野面积的比值均高于 E 组；且随 LTA-sa 浓度增加，A、B、C 组逐渐增高，但均低于 D 组。各组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
图2
各组骨吸收凹陷观察（倒置相差显微镜 ×200） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组； e. E 组
Figure2.
Bone resorption observation in each group (Inverted phase contrast microscopy × 200) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3 MTT 检测
诱导培养后第 5 天，A、B、C、E 组A 值分别为 0.986±0.051、1.002±0.026、0.981±0.078、0.982±0.076，组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
感染性骨缺损是骨髓炎治疗难点之一，由于成骨细胞调节骨形成，既往关于金黄色葡萄球菌引起骨缺损的发生机制，多集中于金黄色葡萄球菌对成骨细胞的作用。相关研究发现，金黄色葡萄球菌能抑制成骨细胞的骨形成能力[8]，并促进其凋亡或坏死[9-10]。破骨细胞是唯一具有骨吸收活性的细胞，但研究发现金黄色葡萄球菌的表面相关蛋白具有促进破骨细胞分化形成及促进骨吸收的作用[11-13]，但起作用的具体活性成分尚未明确。
LTA-sa 是金黄色葡萄球菌细胞壁上的重要毒性因子[4,14]。本研究发现，LTA-sa 作用于 RAW264.7 细胞后，在形态上形成了 TRAP 阳性且多核的破骨样细胞，破骨样细胞数随 LTA-sa 浓度的增加而增多。骨吸收凹陷形成是成熟破骨细胞最重要特征[15]，本研究骨吸收凹陷实验发现，LTA-sa 作用于 RAW264.7 细胞后，在 COAS24 孔板上见骨吸收凹陷形成，从功能上验证了形成的破骨样细胞具有骨吸收活性，表明 LTA-sa 具有促进破骨细胞分化形成的作用。这一结果与 Yang 等[16-17]的研究结果相反，其研究得出 LTA-sa 抑制了 RANKL 所诱导的破骨细胞分化形成。究其原因，可能与采用的破骨细胞前体细胞不同有关。Yang 等采用文献[18]介绍的骨髓诱导法，用巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）及 RANKL 诱导骨髓远祖细胞获得破骨细胞前体细胞，但破骨细胞前体细胞的形成率以及破骨细胞前体细胞所处的时期（早期、中期或晚期）明显受 M-CSF、RANKL 浓度及作用时间影响，而且诱导获得的破骨细胞前体细胞为多种细胞混合体，因此对结果产生一定影响。本研究选用的 RAW264.7 细胞是处于分化晚期的破骨细胞前体细胞[19]，使用 RANKL 即可促进 RAW264.7 细胞分化形成成熟的破骨细胞[17]，甚至在无 RANKL 作用时，LIGHT、IL-6、IL-8、TNF-α 等即可诱导其分化为成熟的破骨细胞[20]。由于细胞单一，将其作为观察对象，实验结果更可靠，目前已广泛应用于体外研究破骨细胞形成及功能[21]。
此外，LTA-sa 虽然为金黄色葡萄球菌细胞壁上一毒性因子，但在本研究所用浓度下，其对 RAW264.7 细胞增殖活性无显著影响，提示在慢性低毒性感染条件下，LTA-sa 更多体现其免疫原性而非毒性。LTA-sa 只是金黄色葡萄球菌众多毒性因子的一种，我们还发现，金黄色葡萄球菌细胞壁上的肽聚糖同样具有促进破骨细胞分化的作用[22]。而 Mendoza 等[23]研究也发现，金黄色葡萄球菌细胞壁上的蛋白 A 也具有促进破骨细胞分化形成的作用。由此说明，金黄色葡萄球菌细胞壁上的一些成分对破骨细胞分化形成及感染性骨缺损的发生起一定作用。但在感染情况下，金黄色葡萄球菌作为一种活菌，除了细胞壁毒性成分外，其还能合成分泌一些毒性因子。因此，作为一个整体，金黄色葡萄球菌对破骨细胞的诱导分化作用仍需进一步研究证实。而关于破骨细胞分化的信号通路，我们在后期研究发现，NF-κB 信号通路在 LTA-sa 诱导的破骨细胞分化形成中起重要作用[24]，但 LTA-sa 诱导作用下不仅 NF-κB 被激活，IL-6 表达也增高，而 IL-6 也可促进破骨细胞分化形成，LTA-sa 是直接促进破骨细胞分化形成，还是间接通过 IL-6 等细胞因子促进破骨细胞分化形成，有待进一步研究。
综上述，本研究表明 LTA-sa 可促进破骨细胞分化，进而在金黄色葡萄球菌感染性骨缺损的发生中起一定作用，由此也提示，金黄色葡萄球菌性骨髓炎中感染性骨不连的成因除感染导致的成骨不全外，还存在感染导致破骨细胞活性增加。因此，从成骨不全及破骨增加两方面对感染性骨不连进行深入机制研究，有望对骨髓炎的治疗提供新的理论依据。
骨组织在生理状态下会持续进行骨重建，成骨细胞调节骨形成，破骨细胞调节骨吸收，二者动态平衡对骨骼形状及骨矿代谢维持具有重要作用[1]。这一平衡被破坏会导致骨代谢紊乱，最终导致各种病理性骨病。骨髓炎是一种骨组织感染，以化脓性炎症、异常骨重建、难控性骨吸收为特征[2]，常导致感染性骨缺损，是骨科治疗难题。金黄色葡萄球菌是引起骨髓炎最常见致病菌[3]，但其导致感染性骨缺损的机制尚不明确。金黄色葡萄球菌脂磷壁酸（Staphylococcal lipoteichoic acid，LTA-sa）是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一个重要毒力因子[4]，其与脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）一样都有致炎特性及结构相似性[5]。Kishimoto 等[6]研究发现，LPS 能促进破骨细胞分化形成、促进骨吸收，而 LTA-sa 对破骨细胞分化过程的影响国内外研究较少。为此，本研究采用不同浓度的 LTA-sa 作用于 RAW264.7 细胞，以观察其对破骨细胞分化形成的作用，报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
RAW264.7 细胞（昆明动物研究所）。LTA-sa（Invitrogen 公司，美国），将该粉末用 PBS 配制成浓度为 1 μg/mL 的溶液，再根据实验所需浓度进行稀释；PBS 及 H-DMEM 培养基（HyClone 公司，美国）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；鼠 NF-κB 受体活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL；R&D Systems 公司，美国）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒（Sigma 公司，美国）。
COAS（Corning Osteo Assay Surface）24 孔板（Corning 公司，美国）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；D90 型倒置相差显微镜（南京江南光电股份有限公司）；SW-CJ-1F 型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；Image-Pro Plus 6.0 软件（Media Cybernetics 公司，美国）。
1.2 实验分组
根据培养条件不同，实验分为 5 组，分别为 LTA-sa 100 ng/mL 组（A 组）、LTA-sa 200 ng/mL 组（B 组）、LTA-sa 400 ng/mL 组（C 组）、阳性对照组（D 组，RANKL 100 ng/mL）、空白对照组（E 组，等体积 PBS）。
1.3 观测指标
1.3.1 TRAP 染色观察 取 RAW264.7 细胞根据实验分组（A～E 组），每组设 6 个复孔。细胞以 5 × 103 个/孔浓度接种于 96 孔板，使用完全培养基（含 15% FBS、1% 青链霉素混合溶液的 H-DMEM），于 37 ℃、5% CO2 细胞培养箱内培养过夜后，每组给予对应浓度 LTA-sa、RANKL 及 PBS，然后将培养板置于 37℃、5% CO2 细胞培养箱进行诱导培养，每 3 天换液 1 次，换液后重复加入 LTA-sa、RANKL 及 PBS，诱导培养后第 5 天进行 TRAP 染色。基本操作步骤：① 用枸橼酸、丙酮及甲醛配制固定液，室温固定细胞 30～60 s；② 去离子水清洗 3 遍，加入 TRAP 染液，37℃ 避光染色 1 h；③ 去离子水清洗 2 遍，苏木素染色 1 min；④ 碱性自来水漂洗 3～4 遍，自然晾干。倒置相差显微镜下观察，细胞质内见红色酒石酸酸性磷酸酶活性颗粒者为 TRAP 阳性细胞。于 200 倍镜下计数每孔破骨样细胞（纳入标准[7]：TRAP 阳性且细胞核≥3 个）。
1.3.2 骨吸收凹陷观测 取 RAW264.7 细胞根据实验分组（A～E 组），每组设 6 个复孔。细胞以 2 × 104 个/孔浓度接种于 COAS 24 孔板，同 1.3.1 方法进行诱导培养。诱导培养后第 5 天，移除培养基，PBS 漂洗 2 次，每孔加入 5% 次氯酸钠溶液 1 mL，室温放置 5 min，以移除培养板内细胞；去离子水清洗培养板 3 次，室温放置 4 h 待其干燥。倒置相差显微镜下观察骨吸收凹陷形成情况，用 Image-Pro Plus 6.0 软件测量骨吸收凹陷面积及整个视野面积，计算骨吸收凹陷面积占整个视野面积的比值。
1.3.3 MTT 检测 取 RAW264.7 细胞根据实验分组（A、B、C、E 组），每组设 10 个复孔。细胞以 5 × 103 个/孔浓度接种于 96 孔板，同 1.3.1 方法进行诱导培养。诱导培养后第 5 天，每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL，避光条件下继续培养 4 h，吸弃培养液，每孔加入 150 μL DMSO，避光震荡 10 min。于酶标仪上用 570 nm 波长检测吸光度（A）值。
1.4 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数 ± 标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准α = 0.05。
2 结果
2.1 TRAP 染色观察
诱导培养后第 5 天，各组均可见破骨样细胞形成（图 1）。A～E 组破骨样细胞数分别为（73.15±5.65）、（155.54±5.89）、（238.15±5.13）、（580.85±12.14）、（21.23±4.19）个/孔。A～D 组破骨样细胞数均多于 E 组；且随 LTA-sa 浓度增加，A、B、C 组破骨样细胞数逐渐增加，但均低于 D 组。各组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
图1
各组 TRAP 染色观察（倒置相差显微镜 ×200） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组； e. E 组
Figure1.
TRAP staining observation in each group (Inverted phase contrast microscopy × 200) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.2 骨吸收凹陷观测
诱导培养后第 5 天，各组 COAS 24 孔板内均见骨吸收凹陷形成（图 2）。A～E 组骨吸收凹陷面积占整个视野面积的比值分别为 0.001 947±0.000 118、0.002 671±0.000 092、0.004 499±0.000 100、0.009 595±0.001 017、0.000 167±0.000 122。A～D 组骨吸收凹陷面积占整个视野面积的比值均高于 E 组；且随 LTA-sa 浓度增加，A、B、C 组逐渐增高，但均低于 D 组。各组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
图2
各组骨吸收凹陷观察（倒置相差显微镜 ×200） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组； e. E 组
Figure2.
Bone resorption observation in each group (Inverted phase contrast microscopy × 200) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3 MTT 检测
诱导培养后第 5 天，A、B、C、E 组A 值分别为 0.986±0.051、1.002±0.026、0.981±0.078、0.982±0.076，组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
感染性骨缺损是骨髓炎治疗难点之一，由于成骨细胞调节骨形成，既往关于金黄色葡萄球菌引起骨缺损的发生机制，多集中于金黄色葡萄球菌对成骨细胞的作用。相关研究发现，金黄色葡萄球菌能抑制成骨细胞的骨形成能力[8]，并促进其凋亡或坏死[9-10]。破骨细胞是唯一具有骨吸收活性的细胞，但研究发现金黄色葡萄球菌的表面相关蛋白具有促进破骨细胞分化形成及促进骨吸收的作用[11-13]，但起作用的具体活性成分尚未明确。
LTA-sa 是金黄色葡萄球菌细胞壁上的重要毒性因子[4,14]。本研究发现，LTA-sa 作用于 RAW264.7 细胞后，在形态上形成了 TRAP 阳性且多核的破骨样细胞，破骨样细胞数随 LTA-sa 浓度的增加而增多。骨吸收凹陷形成是成熟破骨细胞最重要特征[15]，本研究骨吸收凹陷实验发现，LTA-sa 作用于 RAW264.7 细胞后，在 COAS24 孔板上见骨吸收凹陷形成，从功能上验证了形成的破骨样细胞具有骨吸收活性，表明 LTA-sa 具有促进破骨细胞分化形成的作用。这一结果与 Yang 等[16-17]的研究结果相反，其研究得出 LTA-sa 抑制了 RANKL 所诱导的破骨细胞分化形成。究其原因，可能与采用的破骨细胞前体细胞不同有关。Yang 等采用文献[18]介绍的骨髓诱导法，用巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）及 RANKL 诱导骨髓远祖细胞获得破骨细胞前体细胞，但破骨细胞前体细胞的形成率以及破骨细胞前体细胞所处的时期（早期、中期或晚期）明显受 M-CSF、RANKL 浓度及作用时间影响，而且诱导获得的破骨细胞前体细胞为多种细胞混合体，因此对结果产生一定影响。本研究选用的 RAW264.7 细胞是处于分化晚期的破骨细胞前体细胞[19]，使用 RANKL 即可促进 RAW264.7 细胞分化形成成熟的破骨细胞[17]，甚至在无 RANKL 作用时，LIGHT、IL-6、IL-8、TNF-α 等即可诱导其分化为成熟的破骨细胞[20]。由于细胞单一，将其作为观察对象，实验结果更可靠，目前已广泛应用于体外研究破骨细胞形成及功能[21]。
此外，LTA-sa 虽然为金黄色葡萄球菌细胞壁上一毒性因子，但在本研究所用浓度下，其对 RAW264.7 细胞增殖活性无显著影响，提示在慢性低毒性感染条件下，LTA-sa 更多体现其免疫原性而非毒性。LTA-sa 只是金黄色葡萄球菌众多毒性因子的一种，我们还发现，金黄色葡萄球菌细胞壁上的肽聚糖同样具有促进破骨细胞分化的作用[22]。而 Mendoza 等[23]研究也发现，金黄色葡萄球菌细胞壁上的蛋白 A 也具有促进破骨细胞分化形成的作用。由此说明，金黄色葡萄球菌细胞壁上的一些成分对破骨细胞分化形成及感染性骨缺损的发生起一定作用。但在感染情况下，金黄色葡萄球菌作为一种活菌，除了细胞壁毒性成分外，其还能合成分泌一些毒性因子。因此，作为一个整体，金黄色葡萄球菌对破骨细胞的诱导分化作用仍需进一步研究证实。而关于破骨细胞分化的信号通路，我们在后期研究发现，NF-κB 信号通路在 LTA-sa 诱导的破骨细胞分化形成中起重要作用[24]，但 LTA-sa 诱导作用下不仅 NF-κB 被激活，IL-6 表达也增高，而 IL-6 也可促进破骨细胞分化形成，LTA-sa 是直接促进破骨细胞分化形成，还是间接通过 IL-6 等细胞因子促进破骨细胞分化形成，有待进一步研究。
综上述，本研究表明 LTA-sa 可促进破骨细胞分化，进而在金黄色葡萄球菌感染性骨缺损的发生中起一定作用，由此也提示，金黄色葡萄球菌性骨髓炎中感染性骨不连的成因除感染导致的成骨不全外，还存在感染导致破骨细胞活性增加。因此，从成骨不全及破骨增加两方面对感染性骨不连进行深入机制研究，有望对骨髓炎的治疗提供新的理论依据。
