引用本文： 叶雨辰, 张长春, 朱坤, 许刚, 韩仲兵, 乐意. 蜂毒肽对 IL-1β 诱导的大鼠腰椎终板软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(3): 345-350. doi: 10.7507/1002-1892.201609062 复制
椎间盘退变是下腰痛、颈部疼痛及相关功能障碍的主要病因。椎间盘退变的机制较为复杂，目前研究表明终板软骨细胞（endplate chondrocytes，EPCs）退变及其细胞外基质降解会加速椎间盘退变[1]。近年研究显示，促炎性细胞因子如 IL-1β 在终板软骨退变中起促进作用，在退变及突出椎间盘中的表达也有所升高[2]。蜂毒肽（Melittin）是从西方蜂蜜中提取出的一种生物多肽，具有生物和药理作用，包括抗菌、抗毒、抗炎及抗癌效用。研究表明，Melittin 通过抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表达，从而起到抑制 EPCs 细胞外基质降解、延缓椎间盘退变进展的作用[3]。本实验通过观察 Melittin 对 IL-1β 诱导的大鼠 EPCsⅡ型胶原表达的影响，探讨其对终板软骨的作用。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4 周龄 SD 大鼠 10 只，雌雄不限，体质量（100±10）g，由蚌埠医学院实验动物中心提供。胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（Sigma 公司，美国）；DMEM/F12、FBS（HyClone 公司，美国）；兔抗Ⅱ型胶原单克隆抗体、兔抗 MMP-3 单克隆抗体、二抗山羊抗兔抗体（Abcam 公司，英国）；重组大鼠 IL-1β（Pepro Tech 公司，美国）；Melittin（安徽博美生物科技有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethane-sulfonyl fluoride，PMSF）、增强型 RIPA 裂解液（武汉博士德生物工程有限公司）。倒置显微镜、倒置荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；细胞孵育箱（Thermo 公司，美国）；台式离心机、PCR 仪（Eppen-dorf 公司，德国）；全自动酶标仪（Bio Tek 公司，美国）；凝胶系统成像仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.2 大鼠 EPCs 培养及鉴定
1.2.1 细胞分离培养 取 10 只 SD 大鼠，采用腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg）处死，移入 75% 乙醇中浸泡消毒 10 min 后置于超净工作台。取后正中切口，显露整个腰椎，分离周围附着软组织后取出；移入装有 PBS 的培养皿中洗涤 5 min，使用薄刀片削取位于椎体及椎间盘之间的淡白色薄层软骨，放入含 10%FBS 及 1% 双抗的 DMEM/F12 培养基中，剪碎至 0.5 mm3。将剪碎的终板软骨以 0.25% 胰蛋白酶 37℃ 消化 5 min 后，转入 15 mL 离心管中，4℃ 以离心半径 15 cm、1 000 r/min 离心 5 min；弃上清后加入 2%Ⅱ型胶原酶，于 37℃、5% CO2 孵育箱中过夜。次日，同上法离心 5 min 后弃上清，加入含 10% FBS 及 1% 双抗的 DMEM/F12 培养基，以 2×105 个/mL密度种植于培养瓶中，于 37℃、5% CO2 孵育箱中培养。每 3 天换液 1 次，换液后采用倒置显微镜观察细胞形态。待原代细胞达 70%～80% 融合时，用 0.25% 胰蛋白酶消化传代，倒置显微镜观察细胞形态变化。
1.2.2 细胞鉴定 ① 甲苯胺蓝染色观察：分别取第 1、5 代细胞用 0.25% 胰蛋白酶消化后，以 1×105 个/mL密度接种于铺有多聚赖氨酸玻片的 6 孔培养板中进行细胞爬片，待其爬满后取部分切片用 4% 多聚甲醛固定，甲苯胺蓝染色后中性树胶封片，倒置显微镜下观察甲苯胺蓝染色情况。② Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察：取上述细胞爬片，用 0.25% Triton X-100 穿透细胞膜，1% 牛血清白蛋白封闭后孵育一抗兔抗Ⅱ型胶原单克隆抗体，4℃ 过夜，标记Ⅱ型胶原蛋白，次日孵育二抗山羊抗兔抗体（荧光标记一抗）并行 DAPI 染核后，抗荧光衰灭封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。
1.3 IL-1β 及 Melittin 最适浓度选择
取生长良好的第 3 代 EPCs，以 0.25% 胰蛋白酶消化后制成密度为 2×105 个/mL的细胞悬液，接种于 96 孔培养板，每孔 100 μL。筛选 IL-1β 最适浓度时分为 4 组（每组设 4 个复孔），各组细胞中分别加入 0、5、10、20 ng/mL IL-1β 进行干预；筛选 Melittin 最适浓度时分为 5 组（每组设 4 个复孔），各组细胞中分别加入 0、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL Melittin 进行干预。分别于干预 24、48 h 后采用 MTT 法测定各组吸光度（A）值，以是否降低细胞活性作为标准选择 IL-1β 及 Melittin 的最适浓度。
1.4 Melittin 对 IL-1β 诱导的大鼠 EPCsⅡ型胶原表达的影响
取生长良好的第 3 代 EPCs，以 2×105 个/mL密度接种于细胞培养瓶中，于 37℃、5%CO2 孵育箱中培养 48 h 后，根据干预条件不同随机分为 4 组，每组 4 瓶。A 组为正常组，不加任何药物；B 组加入最适浓度的 IL-1β；C 组加入最适浓度的 Melittin；D 组加入最适浓度的 IL-1β 及 Melittin。干预培养 48 h 后，将各组细胞使用胰蛋白酶消化法提取细胞后，加入细胞裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）200 μL 提取蛋白，然后加入 SDS-PAGE 上样缓冲液置于 PCR 仪中 15 min、99℃ 制备蛋白样品，残余样品使用酶标仪测定蛋白浓度。在 10%SDS-PAGE 中每孔上样 20 μg 蛋白样品，分别以 80 V、15 min，120 V、70 min 进行积层胶和分离胶电泳后，以 260 mA、150 min 转聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。将已转成的 PVDF 膜封闭 2 h 后，加入一抗兔抗Ⅱ型胶原单克隆抗体孵育 4℃ 过夜，次日洗膜后加入二抗山羊抗兔抗体孵育 1 h，再次洗膜后将 PVDF 膜置于凝胶系统成像仪中曝光成像。将成像的蛋白表达条带使用 Tanon GIS 系列数码凝胶图像处理系统计算灰度值。
1.5 统计学方法
采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 EPCs 形态观察及鉴定
倒置显微镜观察示，原代培养的 EPCs 排列紧密、折光性强，细胞呈圆形；第 1 代细胞多呈多角形；传至第 5 代后，细胞增殖能力逐渐减弱，细胞形态向梭形转变。甲苯胺蓝染色示第 1 代细胞的细胞核被染成紫色，细胞质中的酸性黏液物质（如蛋白多糖）被染成深蓝色；传至第 5 代后细胞质颜色逐渐变浅。第 1、5 代细胞Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察示，在不同波段荧光激发下，可见细胞骨架部分呈阳性表达（呈绿色荧光），而细胞核区域未见明显阳性表达，即细胞质及细胞膜区域特异性表达Ⅱ型胶原，细胞核使用 DAPI 复染呈蓝色。见图 1。
图1
大鼠腰椎 EPCs 形态观察及鉴定 a. 第 1 代细胞倒置显微镜观察（×200）；b. 第 5 代细胞倒置显微镜观察（×200）；c. 第 1 代细胞甲苯胺蓝染色观察（倒置显微镜×200）；d. 第 5 代细胞甲苯胺蓝染色观察（倒置显微镜×200）；e. 第 1 代细胞免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×200）；f. 第 5 代细胞免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×200）
Figure1.
Morphology observation and identification of rat lumbar EPCs a. The first generation cells under inverted microscope (×200); b. The fifth generation cells under inverted microscope (×200); c. Toluidine blue staining of the first generation cells (Inverted microscope×200); d. Toluidine blue staining of the fifth generation cells (Inverted microscope×200); e. Immunofluorescence staining of the first generation cells (Inverted fluorescence microscope×200); f. Immunofluorescence staining of the fifth generation cells (Inverted fluorescence microscope×200)
2.2 IL-1β 及 Melittin 最适浓度选择
干预 24、48 h，IL-1β 及 Melittin 对 EPCs 均有抑制作用，并呈剂量依赖性。IL-1β 20 ng/mL 组A 值显著低于 0、5、10 ng/mL 组，Melittin 2.0、4.0 μg/mL 组A 值显著低于 0、0.5、1.0 μg/mL 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2。该结果提示 EPCs 在 IL-1β 20 ng/mL 和 Melittin 2.0、4.0 μg/mL 浓度下出现细胞活性明显降低，故取上一个浓度梯度。因此 IL-1β 及 Melittin 的最适浓度分别为 10 ng/mL 和 1.0 μg/mL。
图2
MTT 法确定 IL-1β 及 Melittin 的最适浓度 a. IL-1β 干预 24 h；b. IL-1β 干预 48 h；c. Melittin 干预 24 h；d. Melittin 干预 48 h
Figure2.
Determination of the optimal concentration of IL-1β and Melittin by MTT assay a. IL-1β intervention for 24 hours; b. IL-1β intervention for 48 hours; c. Melittin intervention for 24 hours; d. Melittin intervention for 48 hours
2.3 Melittin 对 IL-1β 诱导的大鼠 EPCsⅡ型胶原表达的影响
与 A 组比较，B 组 IL-1β 干预后Ⅱ型胶原表达明显减少，C 组 Melittin 干预后Ⅱ型胶原表达明显增加，而 D 组与 A 组比较无明显差异。见图 3。A、B、C、D 组Ⅱ型胶原相对表达量分别为 0.991±0.024、0.474±0.127、1.913±0.350、1.159±0.297，除 A、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
图3
Western blot 法检测各组Ⅱ型胶原表达 1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组
Figure3.
Detection of Col-II expression by Western blot assay in each group 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 讨论
在成人体内，椎间盘是最大的无血管结构，椎间盘中的细胞存活所依赖的血管终止于骨性椎体终板邻近的软骨下骨/髓核。椎间盘细胞中的营养素及代谢物通过扩散作用来提供和交换[4-5]。EPCs 主要表达具有软骨相关性的Ⅱ型胶原及蛋白多糖，并且在椎体与椎间盘之间的营养交换中起重要作用。研究表明终板软骨的退变早于椎间盘退变，并可继发椎间盘退变[6]。终板软骨的生化结构构成对保证椎间盘的生物稳定性具有重要作用，其中Ⅱ型胶原及蛋白多糖含量的减少会继发髓核细胞及其细胞外基质成分的改变，蛋白含量也与椎间盘与椎体之间的营养物质运输密切相关。而软骨终板渗透并传递营养物质的功能取决于两个方面：一是物质的本身特性，如分子形状、相对分子质量大小及所带电荷等；二是终板软骨中蛋白多糖及水分的含量[7-8]。
Melittin 作为蜂毒中主要有毒化合物的残基，是一个包含有 26 个氨基酸的小分子蛋白。其分子结构具有亲水、亲脂特性，故具有去垢样功能。由于其具有抗粥样动脉硬化功能，继而引起了研究者的广泛关注。体内实验表明，Melittin 具有抑制脂多糖/脂肪所诱导的黏附分子（如细胞因子等）表达的功能。近期研究表明，在大鼠相关性椎间盘退变模型中，Melittin 能够通过抑制 NF-κB 的活性来发挥一定的延缓及改善椎间盘退变作用[9]。
NF-κB 信号在细胞对炎症、应激和损伤的反应中起重要作用。NF-κB 是由一大类结构相关的转录因子组成，在哺乳类动物中包括 5 种蛋白亚单位，RelA 或 p65、c-Rel、RelB、p50 和 p52。NF-κB 作为一个同源二聚体或异源二聚体存在，其中 p50-p65 异源二聚体是控制 NF-κB 主要调控基因表达的最常见形式。NF-κB 的长期激活与组织老化和年龄相关性退变疾病有关，包括骨骼肌肉疾病和骨质疏松症等。NF-κB 同时也参与了年龄相关性椎间盘退变[10]。在椎间盘组织中，NF-κB 的活性显示了与氧化应激和老化退变之间的联系[11]。椎间盘退变疾病中均可发现 NF-κB 活性增高，相比于无症状的椎间盘，有症状的椎间盘具有较高的促炎性细胞因子水平，其中典型的是 NF-κB 靶基因，如 IL-1β、IL-6 及 IL-8、TNF-α[12]。
无论是椎间盘还是终板软骨的退变都与炎性因子相关，其中以 IL-1β 较为突出。IL-1β 高表达于退变椎间盘中，其通过调节趋化因子表达来进一步引发椎间盘中的炎性反应[13-16]。IL-1β 通过诱导椎间盘中的趋化因子配体 3 表达来激活 NF-κB、MAPK 等通路，进而增加 ADAMTS 及 SDC4 的表达，导致椎间盘及终板细胞外基质发生降解[17-18]。此外，IL-1β 通过激活 MMP，进而促使椎间盘及 EPCs 细胞外基质降解[19-20]。故本实验中选用 IL-1β 诱导来建立体外大鼠 EPCs 退变模型。
本实验发现，与正常组比较，IL-1β 诱导后 EPCs 中的Ⅱ型胶原表达下调，而进行 Melittin 干预后，Ⅱ型胶原表达下调被抑制。因此，Melittin 通过抑制 EPCs 细胞外基质成分的降解，从而具有抗炎、抗老化作用，为临床应用 Melittin 防治椎间盘退变相关性疾病提供一定的理论依据。本实验的不足之处在于仅研究了 Melittin 对Ⅱ型胶原表达的影响情况，而 Melittin 对 MMP 家族表达的影响以及 Melittin 如何从信号转导通路角度延缓终板软骨退变，还需进一步实验研究。
· 信 息 · 第三届中山骨科学术周报名通知 复旦大学附属中山医院骨科以新鲜尸体标本操作为特色，连续举办了 7 届全国脊柱及关节和 2 届围关节创伤及肩关节镜学习班，学员多为副高级以上医师，得到了广泛好评。在此基础上，我们连续举办了两届中山骨科学术周，邀请了顾玉东、戴尅戎、邱贵兴、付小兵院士及侯树勋、王岩、田伟、张英泽、王坤正、姜保国、邱勇、杨惠林、袁文、姜建元、张长青等大师和来自美、德、法、日、韩、香港等国家和地区的国际著名教授以及各相关专业领军专家，学术周场场爆满，与会人数千余人。 第 3 届中山骨科学术周将继续邀请国内外著名专家，由董健主任担任总论坛主席于 2017 年 4 月 19 日举行多学科协作高峰论坛；脊柱论坛于 4 月 18 日–21 日举行，论坛主席：董健主任、姜晓幸主任；关节论坛于 4 月 20 日–22 日举行，论坛主席：阎作勤副院长、姚振均主任；创伤论坛于 4 月 21 日–23 日举行，论坛主席：施德源主任、周建平主任；关节镜论坛于 4 月 22 日–23 日举行，论坛主席：林建平主任；骨肿瘤论坛于 4 月 23 日举行，论坛主席：王毅超主任。 本届学术周各学习班可分别报名，详情请关注 http://www.zs-hospital.sh.cn/的“学术会议”栏和 http://www.zs-guke.cn/的“骨科公告”栏。实践操作不接受现场报名，要参加操作的学员请先联系陆医师（手机：13917306891，座机：021-64041990 转 2336）预先报名，操作报名截止日期为 2017 年 4 月 5 日。
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主办：复旦大学附属中山医院骨科上海市中西医结合学会骨伤科专业委员会上海医师协会骨科医师分会关节工作组中国临床医学杂志协办：上海市医学会骨科专业委员会上海市医学会创伤专业委员会复旦大学基础医学院解剖与组织胚胎学系中华骨科杂志中华创伤杂志2016-12-27 |
椎间盘退变是下腰痛、颈部疼痛及相关功能障碍的主要病因。椎间盘退变的机制较为复杂，目前研究表明终板软骨细胞（endplate chondrocytes，EPCs）退变及其细胞外基质降解会加速椎间盘退变[1]。近年研究显示，促炎性细胞因子如 IL-1β 在终板软骨退变中起促进作用，在退变及突出椎间盘中的表达也有所升高[2]。蜂毒肽（Melittin）是从西方蜂蜜中提取出的一种生物多肽，具有生物和药理作用，包括抗菌、抗毒、抗炎及抗癌效用。研究表明，Melittin 通过抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表达，从而起到抑制 EPCs 细胞外基质降解、延缓椎间盘退变进展的作用[3]。本实验通过观察 Melittin 对 IL-1β 诱导的大鼠 EPCsⅡ型胶原表达的影响，探讨其对终板软骨的作用。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4 周龄 SD 大鼠 10 只，雌雄不限，体质量（100±10）g，由蚌埠医学院实验动物中心提供。胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（Sigma 公司，美国）；DMEM/F12、FBS（HyClone 公司，美国）；兔抗Ⅱ型胶原单克隆抗体、兔抗 MMP-3 单克隆抗体、二抗山羊抗兔抗体（Abcam 公司，英国）；重组大鼠 IL-1β（Pepro Tech 公司，美国）；Melittin（安徽博美生物科技有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethane-sulfonyl fluoride，PMSF）、增强型 RIPA 裂解液（武汉博士德生物工程有限公司）。倒置显微镜、倒置荧光显微镜（Olympus 公司，日本）；细胞孵育箱（Thermo 公司，美国）；台式离心机、PCR 仪（Eppen-dorf 公司，德国）；全自动酶标仪（Bio Tek 公司，美国）；凝胶系统成像仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.2 大鼠 EPCs 培养及鉴定
1.2.1 细胞分离培养 取 10 只 SD 大鼠，采用腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg）处死，移入 75% 乙醇中浸泡消毒 10 min 后置于超净工作台。取后正中切口，显露整个腰椎，分离周围附着软组织后取出；移入装有 PBS 的培养皿中洗涤 5 min，使用薄刀片削取位于椎体及椎间盘之间的淡白色薄层软骨，放入含 10%FBS 及 1% 双抗的 DMEM/F12 培养基中，剪碎至 0.5 mm3。将剪碎的终板软骨以 0.25% 胰蛋白酶 37℃ 消化 5 min 后，转入 15 mL 离心管中，4℃ 以离心半径 15 cm、1 000 r/min 离心 5 min；弃上清后加入 2%Ⅱ型胶原酶，于 37℃、5% CO2 孵育箱中过夜。次日，同上法离心 5 min 后弃上清，加入含 10% FBS 及 1% 双抗的 DMEM/F12 培养基，以 2×105 个/mL密度种植于培养瓶中，于 37℃、5% CO2 孵育箱中培养。每 3 天换液 1 次，换液后采用倒置显微镜观察细胞形态。待原代细胞达 70%～80% 融合时，用 0.25% 胰蛋白酶消化传代，倒置显微镜观察细胞形态变化。
1.2.2 细胞鉴定 ① 甲苯胺蓝染色观察：分别取第 1、5 代细胞用 0.25% 胰蛋白酶消化后，以 1×105 个/mL密度接种于铺有多聚赖氨酸玻片的 6 孔培养板中进行细胞爬片，待其爬满后取部分切片用 4% 多聚甲醛固定，甲苯胺蓝染色后中性树胶封片，倒置显微镜下观察甲苯胺蓝染色情况。② Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察：取上述细胞爬片，用 0.25% Triton X-100 穿透细胞膜，1% 牛血清白蛋白封闭后孵育一抗兔抗Ⅱ型胶原单克隆抗体，4℃ 过夜，标记Ⅱ型胶原蛋白，次日孵育二抗山羊抗兔抗体（荧光标记一抗）并行 DAPI 染核后，抗荧光衰灭封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。
1.3 IL-1β 及 Melittin 最适浓度选择
取生长良好的第 3 代 EPCs，以 0.25% 胰蛋白酶消化后制成密度为 2×105 个/mL的细胞悬液，接种于 96 孔培养板，每孔 100 μL。筛选 IL-1β 最适浓度时分为 4 组（每组设 4 个复孔），各组细胞中分别加入 0、5、10、20 ng/mL IL-1β 进行干预；筛选 Melittin 最适浓度时分为 5 组（每组设 4 个复孔），各组细胞中分别加入 0、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL Melittin 进行干预。分别于干预 24、48 h 后采用 MTT 法测定各组吸光度（A）值，以是否降低细胞活性作为标准选择 IL-1β 及 Melittin 的最适浓度。
1.4 Melittin 对 IL-1β 诱导的大鼠 EPCsⅡ型胶原表达的影响
取生长良好的第 3 代 EPCs，以 2×105 个/mL密度接种于细胞培养瓶中，于 37℃、5%CO2 孵育箱中培养 48 h 后，根据干预条件不同随机分为 4 组，每组 4 瓶。A 组为正常组，不加任何药物；B 组加入最适浓度的 IL-1β；C 组加入最适浓度的 Melittin；D 组加入最适浓度的 IL-1β 及 Melittin。干预培养 48 h 后，将各组细胞使用胰蛋白酶消化法提取细胞后，加入细胞裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）200 μL 提取蛋白，然后加入 SDS-PAGE 上样缓冲液置于 PCR 仪中 15 min、99℃ 制备蛋白样品，残余样品使用酶标仪测定蛋白浓度。在 10%SDS-PAGE 中每孔上样 20 μg 蛋白样品，分别以 80 V、15 min，120 V、70 min 进行积层胶和分离胶电泳后，以 260 mA、150 min 转聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。将已转成的 PVDF 膜封闭 2 h 后，加入一抗兔抗Ⅱ型胶原单克隆抗体孵育 4℃ 过夜，次日洗膜后加入二抗山羊抗兔抗体孵育 1 h，再次洗膜后将 PVDF 膜置于凝胶系统成像仪中曝光成像。将成像的蛋白表达条带使用 Tanon GIS 系列数码凝胶图像处理系统计算灰度值。
1.5 统计学方法
采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 EPCs 形态观察及鉴定
倒置显微镜观察示，原代培养的 EPCs 排列紧密、折光性强，细胞呈圆形；第 1 代细胞多呈多角形；传至第 5 代后，细胞增殖能力逐渐减弱，细胞形态向梭形转变。甲苯胺蓝染色示第 1 代细胞的细胞核被染成紫色，细胞质中的酸性黏液物质（如蛋白多糖）被染成深蓝色；传至第 5 代后细胞质颜色逐渐变浅。第 1、5 代细胞Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察示，在不同波段荧光激发下，可见细胞骨架部分呈阳性表达（呈绿色荧光），而细胞核区域未见明显阳性表达，即细胞质及细胞膜区域特异性表达Ⅱ型胶原，细胞核使用 DAPI 复染呈蓝色。见图 1。
图1
大鼠腰椎 EPCs 形态观察及鉴定 a. 第 1 代细胞倒置显微镜观察（×200）；b. 第 5 代细胞倒置显微镜观察（×200）；c. 第 1 代细胞甲苯胺蓝染色观察（倒置显微镜×200）；d. 第 5 代细胞甲苯胺蓝染色观察（倒置显微镜×200）；e. 第 1 代细胞免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×200）；f. 第 5 代细胞免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×200）
Figure1.
Morphology observation and identification of rat lumbar EPCs a. The first generation cells under inverted microscope (×200); b. The fifth generation cells under inverted microscope (×200); c. Toluidine blue staining of the first generation cells (Inverted microscope×200); d. Toluidine blue staining of the fifth generation cells (Inverted microscope×200); e. Immunofluorescence staining of the first generation cells (Inverted fluorescence microscope×200); f. Immunofluorescence staining of the fifth generation cells (Inverted fluorescence microscope×200)
2.2 IL-1β 及 Melittin 最适浓度选择
干预 24、48 h，IL-1β 及 Melittin 对 EPCs 均有抑制作用，并呈剂量依赖性。IL-1β 20 ng/mL 组A 值显著低于 0、5、10 ng/mL 组，Melittin 2.0、4.0 μg/mL 组A 值显著低于 0、0.5、1.0 μg/mL 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2。该结果提示 EPCs 在 IL-1β 20 ng/mL 和 Melittin 2.0、4.0 μg/mL 浓度下出现细胞活性明显降低，故取上一个浓度梯度。因此 IL-1β 及 Melittin 的最适浓度分别为 10 ng/mL 和 1.0 μg/mL。
图2
MTT 法确定 IL-1β 及 Melittin 的最适浓度 a. IL-1β 干预 24 h；b. IL-1β 干预 48 h；c. Melittin 干预 24 h；d. Melittin 干预 48 h
Figure2.
Determination of the optimal concentration of IL-1β and Melittin by MTT assay a. IL-1β intervention for 24 hours; b. IL-1β intervention for 48 hours; c. Melittin intervention for 24 hours; d. Melittin intervention for 48 hours
2.3 Melittin 对 IL-1β 诱导的大鼠 EPCsⅡ型胶原表达的影响
与 A 组比较，B 组 IL-1β 干预后Ⅱ型胶原表达明显减少，C 组 Melittin 干预后Ⅱ型胶原表达明显增加，而 D 组与 A 组比较无明显差异。见图 3。A、B、C、D 组Ⅱ型胶原相对表达量分别为 0.991±0.024、0.474±0.127、1.913±0.350、1.159±0.297，除 A、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）外，其余组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
图3
Western blot 法检测各组Ⅱ型胶原表达 1：A 组 2：B 组 3：C 组 4：D 组
Figure3.
Detection of Col-II expression by Western blot assay in each group 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 讨论
在成人体内，椎间盘是最大的无血管结构，椎间盘中的细胞存活所依赖的血管终止于骨性椎体终板邻近的软骨下骨/髓核。椎间盘细胞中的营养素及代谢物通过扩散作用来提供和交换[4-5]。EPCs 主要表达具有软骨相关性的Ⅱ型胶原及蛋白多糖，并且在椎体与椎间盘之间的营养交换中起重要作用。研究表明终板软骨的退变早于椎间盘退变，并可继发椎间盘退变[6]。终板软骨的生化结构构成对保证椎间盘的生物稳定性具有重要作用，其中Ⅱ型胶原及蛋白多糖含量的减少会继发髓核细胞及其细胞外基质成分的改变，蛋白含量也与椎间盘与椎体之间的营养物质运输密切相关。而软骨终板渗透并传递营养物质的功能取决于两个方面：一是物质的本身特性，如分子形状、相对分子质量大小及所带电荷等；二是终板软骨中蛋白多糖及水分的含量[7-8]。
Melittin 作为蜂毒中主要有毒化合物的残基，是一个包含有 26 个氨基酸的小分子蛋白。其分子结构具有亲水、亲脂特性，故具有去垢样功能。由于其具有抗粥样动脉硬化功能，继而引起了研究者的广泛关注。体内实验表明，Melittin 具有抑制脂多糖/脂肪所诱导的黏附分子（如细胞因子等）表达的功能。近期研究表明，在大鼠相关性椎间盘退变模型中，Melittin 能够通过抑制 NF-κB 的活性来发挥一定的延缓及改善椎间盘退变作用[9]。
NF-κB 信号在细胞对炎症、应激和损伤的反应中起重要作用。NF-κB 是由一大类结构相关的转录因子组成，在哺乳类动物中包括 5 种蛋白亚单位，RelA 或 p65、c-Rel、RelB、p50 和 p52。NF-κB 作为一个同源二聚体或异源二聚体存在，其中 p50-p65 异源二聚体是控制 NF-κB 主要调控基因表达的最常见形式。NF-κB 的长期激活与组织老化和年龄相关性退变疾病有关，包括骨骼肌肉疾病和骨质疏松症等。NF-κB 同时也参与了年龄相关性椎间盘退变[10]。在椎间盘组织中，NF-κB 的活性显示了与氧化应激和老化退变之间的联系[11]。椎间盘退变疾病中均可发现 NF-κB 活性增高，相比于无症状的椎间盘，有症状的椎间盘具有较高的促炎性细胞因子水平，其中典型的是 NF-κB 靶基因，如 IL-1β、IL-6 及 IL-8、TNF-α[12]。
无论是椎间盘还是终板软骨的退变都与炎性因子相关，其中以 IL-1β 较为突出。IL-1β 高表达于退变椎间盘中，其通过调节趋化因子表达来进一步引发椎间盘中的炎性反应[13-16]。IL-1β 通过诱导椎间盘中的趋化因子配体 3 表达来激活 NF-κB、MAPK 等通路，进而增加 ADAMTS 及 SDC4 的表达，导致椎间盘及终板细胞外基质发生降解[17-18]。此外，IL-1β 通过激活 MMP，进而促使椎间盘及 EPCs 细胞外基质降解[19-20]。故本实验中选用 IL-1β 诱导来建立体外大鼠 EPCs 退变模型。
本实验发现，与正常组比较，IL-1β 诱导后 EPCs 中的Ⅱ型胶原表达下调，而进行 Melittin 干预后，Ⅱ型胶原表达下调被抑制。因此，Melittin 通过抑制 EPCs 细胞外基质成分的降解，从而具有抗炎、抗老化作用，为临床应用 Melittin 防治椎间盘退变相关性疾病提供一定的理论依据。本实验的不足之处在于仅研究了 Melittin 对Ⅱ型胶原表达的影响情况，而 Melittin 对 MMP 家族表达的影响以及 Melittin 如何从信号转导通路角度延缓终板软骨退变，还需进一步实验研究。
· 信 息 · 第三届中山骨科学术周报名通知 复旦大学附属中山医院骨科以新鲜尸体标本操作为特色，连续举办了 7 届全国脊柱及关节和 2 届围关节创伤及肩关节镜学习班，学员多为副高级以上医师，得到了广泛好评。在此基础上，我们连续举办了两届中山骨科学术周，邀请了顾玉东、戴尅戎、邱贵兴、付小兵院士及侯树勋、王岩、田伟、张英泽、王坤正、姜保国、邱勇、杨惠林、袁文、姜建元、张长青等大师和来自美、德、法、日、韩、香港等国家和地区的国际著名教授以及各相关专业领军专家，学术周场场爆满，与会人数千余人。 第 3 届中山骨科学术周将继续邀请国内外著名专家，由董健主任担任总论坛主席于 2017 年 4 月 19 日举行多学科协作高峰论坛；脊柱论坛于 4 月 18 日–21 日举行，论坛主席：董健主任、姜晓幸主任；关节论坛于 4 月 20 日–22 日举行，论坛主席：阎作勤副院长、姚振均主任；创伤论坛于 4 月 21 日–23 日举行，论坛主席：施德源主任、周建平主任；关节镜论坛于 4 月 22 日–23 日举行，论坛主席：林建平主任；骨肿瘤论坛于 4 月 23 日举行，论坛主席：王毅超主任。 本届学术周各学习班可分别报名，详情请关注 http://www.zs-hospital.sh.cn/的“学术会议”栏和 http://www.zs-guke.cn/的“骨科公告”栏。实践操作不接受现场报名，要参加操作的学员请先联系陆医师（手机：13917306891，座机：021-64041990 转 2336）预先报名，操作报名截止日期为 2017 年 4 月 5 日。
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主办：复旦大学附属中山医院骨科上海市中西医结合学会骨伤科专业委员会上海医师协会骨科医师分会关节工作组中国临床医学杂志协办：上海市医学会骨科专业委员会上海市医学会创伤专业委员会复旦大学基础医学院解剖与组织胚胎学系中华骨科杂志中华创伤杂志2016-12-27 |
