引用本文： 聂开瑜, 胡鹏, 王达利, 魏在荣, 曾学琴, 孙广峰. 雷帕霉素及去铁敏对缺血缺氧创面愈合的影响. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(6): 718-722. doi: 10.7507/1002-1892.201608081 复制
体表缺血缺氧创面形成机制复杂，至今尚未明确。该类型创面愈合困难，研究发现与其局部持续缺血缺氧密切相关[1-4]。缺氧诱导因子 1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）是参与缺氧应答反应的关键性转录因子，其下游靶基因涉及血管生成、细胞能量代谢、离子代谢、细胞凋亡和增殖、细胞迁移等多个方面[1-2]，已成为缺血缺氧创面愈合研究的新热点。研究表明，HIF-1α 表达不足导致的血管生成减少是创面延迟愈合的重要原因之一[5-13]，但缺血缺氧创面中 HIF 表达减少的机制仍未明确。肿瘤和缺血再灌注损伤的相关研究发现，雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是 HIF-1 的上游调节蛋白，可调节 HIF-1 的表达[14-16]；慢性创面发生过程中是否也存在与肿瘤及缺血再灌注损伤类似的由 mTOR 及 HIF-1 参与调解的机制，尚未明确。去铁敏是一种高选择性铁离子螯合剂，在氧分压正常时可明显促进 HIF-1α 表达，动物实验证实通过创面局部或全身使用去铁敏可以明显促进创面愈合[6-8]。本研究旨在观察雷帕霉素及去铁敏对缺血缺氧创面愈合的影响，探讨其作用机制，以期为探索缺血缺氧创面形成机制提供实验依据。
1 材料及方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF 级雄性成年 SD 大鼠 40 只，体质量（300±20）g，由第三军医大学大坪医院医学实验动物中心提供。雷帕霉素、去铁敏（Sigma 公司，美国）；β-actin、mTOR、HIF-1α 以及 VEGF 引物由上海英骏生物有限公司设计合成；兔抗大鼠 mTOR 抗体、HIF-1α 抗体、VEGF 抗体（Abcam 公司，英国）。
TU1810 紫外分光光度计（Beckman 公司，美国）；icycler 荧光定量 PCR 仪、全自动凝胶图像分析仪（Bio-Rad 公司，美国）；高速低温离心机（Eppendorf 公司，德国）；Perimed 经皮氧分压激光多普勒系统（Perimed 公司，瑞典）。
1.2 大鼠缺血缺氧创面模型制备
参照 Chen 等[17]报道的大鼠缺血缺氧创面模型制备方法并进行改良，并经预实验验证。40 只 SD 大鼠术前禁食 12 h；腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，俯卧位固定，背部剃毛、消毒。于肩胛与髂棘之间切取面积为 11 cm×3 cm 的矩形双蒂皮瓣（包含皮肤、皮下肉膜层和浅筋膜层），掀起皮瓣，切断浅筋膜层与深筋膜之间所有穿支，皮瓣血供仅来自于两端蒂部双侧旋髂深动脉、双侧胸背动脉及其发出的顶支形成的真皮下血管网，使双侧蒂部至皮瓣中间的血供逐渐减少，再分别于皮瓣中央等边距及间距，制作 3 个面积为 1 cm×1 cm 全层皮瓣缺损创面；双蒂皮瓣边缘等间距 4-0 丝线间断缝合固定 6 针。术后大鼠分笼饲养，以免撕咬影响皮瓣成活及创面愈合，给予适量青霉素预防感染。
模型制备后即刻以及 1、2、3 d 使用 Perimed 经皮氧分压激光多普勒系统 407 微型激光血流探头检测创面边缘血流信号强度。结果显示，与两侧创面相比，中间创面呈缺血缺氧状态，提示成功制备缺血缺氧创面模型。见图 1。
图1
大鼠缺血缺氧创面模型制备
a. 术前皮瓣及创面设计；b. 术中皮瓣切取及创面制备；c、d. 模型制备后即刻探测创面边缘血流信号强度
Figure1. Preparation of rat model of ischemia-hypoxia wounda. Preoperative flap and wound design; b. Intraoperative flap incision and wound preparation; c, d. The blood flow signal intensity at immediate after the model was prepared
1.3 实验分组及方法
大鼠缺血缺氧创面模型制备后将其随机分为4组，每组 10 只；分别为空白对照组（A 组）、去铁敏干预组（B 组）、雷帕霉素干预组（C 组）、去铁敏+雷帕霉素共同干预组（D 组）。模型制备后 3、6、9 d，A、B、C、D 组分别腹腔注射等体积生理盐水、去铁敏（10 mg/kg）、雷帕霉素（3 mg/kg）、去铁敏（10 mg/kg）+雷帕霉素（3 mg/kg）[6-8, 18-19]。
于创面完全愈合后第 2 天，同上法麻醉大鼠后，于背部切取包含中央创面、直径约 1.5 cm 的圆形全层皮肤组织，纵行两等份，分别进行实时荧光定量 PCR 检测创面组织中 mTOR、HIF-1α、VEGF mRNA 的表达，以及 Western blot 检测 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表达。
1.4 观测指标
1.4.1 大体观察 建模后观察各组大鼠存活情况，观察皮瓣成活以及创面愈合情况，以肉眼观察创面完全上皮化所需时间记为创面愈合时间[20]。
1.4.2 实时荧光定量 PCR 检测 取创面组织样品冰上匀浆，每 0.1 克组织加 1 mL Trizol。用 Trizol 裂解法提取组织总 RNA，紫外分光光度法检测总 RNA 含量和纯度。在 10 μL 反应体系中用 Prime-Script RT 试剂盒逆转录成 cDNA，用 SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒在 50 μL 反应体系中扩增。用 ABI Prism 7300 System 检测实时荧光定量 PCR 反应，反应条件：95℃ 预变性 10 s，95℃ 变性 5 s，60℃ 退火延伸 31 s，共 40 个循环。梯度稀释 cDNA 产生的标准曲线计算 PCR 反应效率，用溶解曲线和凝胶电泳检测各引物特异性。引物序列见表 1。
表1
实时荧光定量 PCR 检测引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time fluorescence PCR
1.4.3 Western blot 检测 取创面组织样品冰上匀浆，加入 Tris-HCl 组织裂解液（50 mmol/L）4℃ 裂解 30 min，置入 4℃ 恒温离心机，以离心半径 10 cm、12 000 r/min 离心 15 min。收集上清液，BCA 试剂盒检测蛋白浓度。将样品蛋白 8 μg 在 5%～17% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转聚偏氟乙烯膜，PBS 液加 0.05% Tween-20（PBS-T）洗涤，2% 脱脂奶粉室温封闭 2 h；再用 PBS-T 洗膜，加一抗（mTOR、HIF-1α、VEGF）4℃ 孵育过夜，PBS-T 洗涤，二抗（羊抗兔/鼠 IgG）室温孵育 2 h，PBS-T 洗膜，ECL 法影，X 线片曝光。采用 Image Pro Plus 图像分析软件测定 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表达水平。
1.5 统计学方法
采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
各组大鼠均存活至实验完成；皮瓣均成活，创面均愈合（图 2）。A、B、C、D 组创面愈合时间分别为（14.00±1.25）、（12.00±1.00）、（18.00±2.00）、（13.00±1.25）d，其中 A、B、D 组创面愈合时间均较 C 组明显缩短，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A、B、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图2
A 组大鼠创面愈合后大体观察
黑色圆圈处为切取的全层皮肤组织标本
Figure2. General observation of rats in group A after wound healingBlack circle for full thickness skin specimens
2.2 实时荧光定量 PCR 检测
C、D 组 mTOR mRNA 表达较 A、B 组明显下调，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A、B 组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；C、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。B、D 组 HIF-1α、VEGF mRNA 表达较 A、C 组明显上调，C 组较 A 组表达下调，比较差异有统计学意义（P<0.05）；而 B、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
各组 mTOR、HIF-1α、VEGF mRNA 表达比较（n=10，
）
Table2.
Comparison of the mTOR, HIF-1α, and VEGF mRNA expre-ssions between groups (n=10,
)
2.3 Western blot 检测
mTOR 蛋白：与 A 组相比，B 组蛋白相对表达量上调，C、D 组明显下调，比较差异有统计学意义（P<0.05）。B 组蛋白相对表达量明显高于 C、D 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。C、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3 及图 3。
图3
Western blot 检测各组 mTOR、HIF-1α 及 VEGF 蛋白表达
1：A 组；2：B 组；3：C 组；4：D 组
Figure3. Expressions of mTOR, HIF-1α, and VEGF protein in each group by Western blot1: Group A; 2: Group B; 3: Group C; 4: Group D
HIF-1α 蛋白：A、B、C 组蛋白相对表达量明显高于 D 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。A、B、C 组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3 及图 3。
VEGF 蛋白：与 A 组相比，B、C、D 组蛋白相对表达量明显下调，比较差异有统计学意义（P<0.05）；D 组蛋白相对表达量显著低于 B、C 组，C 组低于 B 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 3 及图 3。
表3
各组 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表达的比较（n=10，
）
Table3.
Comparison of the mTOR, HIF-1α, and VEGF protein expressions between groups (n=10,
)
3 讨论
以缺血缺氧创面为代表的慢性创面具有病程长、对外观影响大、并发症多等特点，已成为影响患者生活质量的重要并发症[1, 21]。雷帕霉素是常用的免疫抑制剂，可以直接抑制 mTOR[14]。它对非免疫细胞的作用日益受到重视。既往研究证实雷帕霉素可以延迟多种创面的愈合[18-19]。本研究中 C 组创面愈合时间较 A 组延长，也进一步证实了雷帕霉素会明显延迟缺血缺氧创面的愈合。
在正常创面愈合中，暂时缺氧能导致 HIF-1α 表达升高，促进其下游基因 VEGF 的表达，从而促进血管生成和创面愈合。去铁敏在氧分压正常时即可明显促进 HIF-1α 表达。在糖尿病和老年动物的缺血缺氧创面模型中均发现，通过创面局部或全身使用去铁敏可以明显促进创面愈合[6-8]。本研究中 B 组 HIF-1α 表达明显上调，且创面愈合时间缩短，也初步证明去铁敏促进创面愈合的机制可能与调节HIF活性有密切关系。
在肿瘤和缺血再灌注损伤的研究中发现：mTOR 是 HIF-1 的上游调节蛋白，可调节 HIF-1 的表达；多种生长因子能激活 PI3K/Akt/mTOR 信号途径，在常氧下增强 HIF-1α 的转录活性；细胞缺血缺氧时 ATP 减少、AMP 增加，可激活 5′-AMP 激活性蛋白激酶，进而抑制 mTOR 的表达，而抑制 mTOR 表达又会减少 HIF-1α 的表达[14-15]。目前，有关 mTOR 对慢性缺血缺氧创面中 HIF-1 表达的影响鲜见报道。本研究发现在缺血缺氧创面中 mTOR mRNA 表达下调，对应 HIF-1α mRNA 表达也下调，这与在缺血再灌注损伤中的研究发现一致。但 Western blot 检测显示，mTOR 及对应 HIF-1α 蛋白表达变化与 mRNA 表达不一致，其具体调节机制是否与缺血再灌注损伤中调节机制存在差异，或者存在其他调节机制参与，有待后期进一步研究。
体表缺血缺氧创面形成机制复杂，至今尚未明确。该类型创面愈合困难，研究发现与其局部持续缺血缺氧密切相关[1-4]。缺氧诱导因子 1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）是参与缺氧应答反应的关键性转录因子，其下游靶基因涉及血管生成、细胞能量代谢、离子代谢、细胞凋亡和增殖、细胞迁移等多个方面[1-2]，已成为缺血缺氧创面愈合研究的新热点。研究表明，HIF-1α 表达不足导致的血管生成减少是创面延迟愈合的重要原因之一[5-13]，但缺血缺氧创面中 HIF 表达减少的机制仍未明确。肿瘤和缺血再灌注损伤的相关研究发现，雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是 HIF-1 的上游调节蛋白，可调节 HIF-1 的表达[14-16]；慢性创面发生过程中是否也存在与肿瘤及缺血再灌注损伤类似的由 mTOR 及 HIF-1 参与调解的机制，尚未明确。去铁敏是一种高选择性铁离子螯合剂，在氧分压正常时可明显促进 HIF-1α 表达，动物实验证实通过创面局部或全身使用去铁敏可以明显促进创面愈合[6-8]。本研究旨在观察雷帕霉素及去铁敏对缺血缺氧创面愈合的影响，探讨其作用机制，以期为探索缺血缺氧创面形成机制提供实验依据。
1 材料及方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF 级雄性成年 SD 大鼠 40 只，体质量（300±20）g，由第三军医大学大坪医院医学实验动物中心提供。雷帕霉素、去铁敏（Sigma 公司，美国）；β-actin、mTOR、HIF-1α 以及 VEGF 引物由上海英骏生物有限公司设计合成；兔抗大鼠 mTOR 抗体、HIF-1α 抗体、VEGF 抗体（Abcam 公司，英国）。
TU1810 紫外分光光度计（Beckman 公司，美国）；icycler 荧光定量 PCR 仪、全自动凝胶图像分析仪（Bio-Rad 公司，美国）；高速低温离心机（Eppendorf 公司，德国）；Perimed 经皮氧分压激光多普勒系统（Perimed 公司，瑞典）。
1.2 大鼠缺血缺氧创面模型制备
参照 Chen 等[17]报道的大鼠缺血缺氧创面模型制备方法并进行改良，并经预实验验证。40 只 SD 大鼠术前禁食 12 h；腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，俯卧位固定，背部剃毛、消毒。于肩胛与髂棘之间切取面积为 11 cm×3 cm 的矩形双蒂皮瓣（包含皮肤、皮下肉膜层和浅筋膜层），掀起皮瓣，切断浅筋膜层与深筋膜之间所有穿支，皮瓣血供仅来自于两端蒂部双侧旋髂深动脉、双侧胸背动脉及其发出的顶支形成的真皮下血管网，使双侧蒂部至皮瓣中间的血供逐渐减少，再分别于皮瓣中央等边距及间距，制作 3 个面积为 1 cm×1 cm 全层皮瓣缺损创面；双蒂皮瓣边缘等间距 4-0 丝线间断缝合固定 6 针。术后大鼠分笼饲养，以免撕咬影响皮瓣成活及创面愈合，给予适量青霉素预防感染。
模型制备后即刻以及 1、2、3 d 使用 Perimed 经皮氧分压激光多普勒系统 407 微型激光血流探头检测创面边缘血流信号强度。结果显示，与两侧创面相比，中间创面呈缺血缺氧状态，提示成功制备缺血缺氧创面模型。见图 1。
图1
大鼠缺血缺氧创面模型制备
a. 术前皮瓣及创面设计；b. 术中皮瓣切取及创面制备；c、d. 模型制备后即刻探测创面边缘血流信号强度
Figure1. Preparation of rat model of ischemia-hypoxia wounda. Preoperative flap and wound design; b. Intraoperative flap incision and wound preparation; c, d. The blood flow signal intensity at immediate after the model was prepared
1.3 实验分组及方法
大鼠缺血缺氧创面模型制备后将其随机分为4组，每组 10 只；分别为空白对照组（A 组）、去铁敏干预组（B 组）、雷帕霉素干预组（C 组）、去铁敏+雷帕霉素共同干预组（D 组）。模型制备后 3、6、9 d，A、B、C、D 组分别腹腔注射等体积生理盐水、去铁敏（10 mg/kg）、雷帕霉素（3 mg/kg）、去铁敏（10 mg/kg）+雷帕霉素（3 mg/kg）[6-8, 18-19]。
于创面完全愈合后第 2 天，同上法麻醉大鼠后，于背部切取包含中央创面、直径约 1.5 cm 的圆形全层皮肤组织，纵行两等份，分别进行实时荧光定量 PCR 检测创面组织中 mTOR、HIF-1α、VEGF mRNA 的表达，以及 Western blot 检测 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表达。
1.4 观测指标
1.4.1 大体观察 建模后观察各组大鼠存活情况，观察皮瓣成活以及创面愈合情况，以肉眼观察创面完全上皮化所需时间记为创面愈合时间[20]。
1.4.2 实时荧光定量 PCR 检测 取创面组织样品冰上匀浆，每 0.1 克组织加 1 mL Trizol。用 Trizol 裂解法提取组织总 RNA，紫外分光光度法检测总 RNA 含量和纯度。在 10 μL 反应体系中用 Prime-Script RT 试剂盒逆转录成 cDNA，用 SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒在 50 μL 反应体系中扩增。用 ABI Prism 7300 System 检测实时荧光定量 PCR 反应，反应条件：95℃ 预变性 10 s，95℃ 变性 5 s，60℃ 退火延伸 31 s，共 40 个循环。梯度稀释 cDNA 产生的标准曲线计算 PCR 反应效率，用溶解曲线和凝胶电泳检测各引物特异性。引物序列见表 1。
表1
实时荧光定量 PCR 检测引物序列
Table1.
Primer sequences for real-time fluorescence PCR
1.4.3 Western blot 检测 取创面组织样品冰上匀浆，加入 Tris-HCl 组织裂解液（50 mmol/L）4℃ 裂解 30 min，置入 4℃ 恒温离心机，以离心半径 10 cm、12 000 r/min 离心 15 min。收集上清液，BCA 试剂盒检测蛋白浓度。将样品蛋白 8 μg 在 5%～17% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转聚偏氟乙烯膜，PBS 液加 0.05% Tween-20（PBS-T）洗涤，2% 脱脂奶粉室温封闭 2 h；再用 PBS-T 洗膜，加一抗（mTOR、HIF-1α、VEGF）4℃ 孵育过夜，PBS-T 洗涤，二抗（羊抗兔/鼠 IgG）室温孵育 2 h，PBS-T 洗膜，ECL 法影，X 线片曝光。采用 Image Pro Plus 图像分析软件测定 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表达水平。
1.5 统计学方法
采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
各组大鼠均存活至实验完成；皮瓣均成活，创面均愈合（图 2）。A、B、C、D 组创面愈合时间分别为（14.00±1.25）、（12.00±1.00）、（18.00±2.00）、（13.00±1.25）d，其中 A、B、D 组创面愈合时间均较 C 组明显缩短，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A、B、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图2
A 组大鼠创面愈合后大体观察
黑色圆圈处为切取的全层皮肤组织标本
Figure2. General observation of rats in group A after wound healingBlack circle for full thickness skin specimens
2.2 实时荧光定量 PCR 检测
C、D 组 mTOR mRNA 表达较 A、B 组明显下调，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A、B 组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；C、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。B、D 组 HIF-1α、VEGF mRNA 表达较 A、C 组明显上调，C 组较 A 组表达下调，比较差异有统计学意义（P<0.05）；而 B、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表2
各组 mTOR、HIF-1α、VEGF mRNA 表达比较（n=10，
）
Table2.
Comparison of the mTOR, HIF-1α, and VEGF mRNA expre-ssions between groups (n=10,
)
2.3 Western blot 检测
mTOR 蛋白：与 A 组相比，B 组蛋白相对表达量上调，C、D 组明显下调，比较差异有统计学意义（P<0.05）。B 组蛋白相对表达量明显高于 C、D 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。C、D 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3 及图 3。
图3
Western blot 检测各组 mTOR、HIF-1α 及 VEGF 蛋白表达
1：A 组；2：B 组；3：C 组；4：D 组
Figure3. Expressions of mTOR, HIF-1α, and VEGF protein in each group by Western blot1: Group A; 2: Group B; 3: Group C; 4: Group D
HIF-1α 蛋白：A、B、C 组蛋白相对表达量明显高于 D 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。A、B、C 组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3 及图 3。
VEGF 蛋白：与 A 组相比，B、C、D 组蛋白相对表达量明显下调，比较差异有统计学意义（P<0.05）；D 组蛋白相对表达量显著低于 B、C 组，C 组低于 B 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表 3 及图 3。
表3
各组 mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白表达的比较（n=10，
）
Table3.
Comparison of the mTOR, HIF-1α, and VEGF protein expressions between groups (n=10,
)
3 讨论
以缺血缺氧创面为代表的慢性创面具有病程长、对外观影响大、并发症多等特点，已成为影响患者生活质量的重要并发症[1, 21]。雷帕霉素是常用的免疫抑制剂，可以直接抑制 mTOR[14]。它对非免疫细胞的作用日益受到重视。既往研究证实雷帕霉素可以延迟多种创面的愈合[18-19]。本研究中 C 组创面愈合时间较 A 组延长，也进一步证实了雷帕霉素会明显延迟缺血缺氧创面的愈合。
在正常创面愈合中，暂时缺氧能导致 HIF-1α 表达升高，促进其下游基因 VEGF 的表达，从而促进血管生成和创面愈合。去铁敏在氧分压正常时即可明显促进 HIF-1α 表达。在糖尿病和老年动物的缺血缺氧创面模型中均发现，通过创面局部或全身使用去铁敏可以明显促进创面愈合[6-8]。本研究中 B 组 HIF-1α 表达明显上调，且创面愈合时间缩短，也初步证明去铁敏促进创面愈合的机制可能与调节HIF活性有密切关系。
在肿瘤和缺血再灌注损伤的研究中发现：mTOR 是 HIF-1 的上游调节蛋白，可调节 HIF-1 的表达；多种生长因子能激活 PI3K/Akt/mTOR 信号途径，在常氧下增强 HIF-1α 的转录活性；细胞缺血缺氧时 ATP 减少、AMP 增加，可激活 5′-AMP 激活性蛋白激酶，进而抑制 mTOR 的表达，而抑制 mTOR 表达又会减少 HIF-1α 的表达[14-15]。目前，有关 mTOR 对慢性缺血缺氧创面中 HIF-1 表达的影响鲜见报道。本研究发现在缺血缺氧创面中 mTOR mRNA 表达下调，对应 HIF-1α mRNA 表达也下调，这与在缺血再灌注损伤中的研究发现一致。但 Western blot 检测显示，mTOR 及对应 HIF-1α 蛋白表达变化与 mRNA 表达不一致，其具体调节机制是否与缺血再灌注损伤中调节机制存在差异，或者存在其他调节机制参与，有待后期进一步研究。
