引用本文： 吕翠, 刘倩, 曾现伟. IL-10 基因修饰的 BMSCs 对大鼠脑缺血再灌注损伤炎性因子及神经细胞凋亡的影响. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(2): 240-245. doi: 10.7507/1002-1892.201605095 复制
据报道，脑卒中已升为中国国民第 1 位死因，并且发病年龄呈年轻化趋势，严重威胁国民生命健康和生活质量[1]。其中 80% 脑卒中为缺血性，快速再灌注是缺血性脑卒中重要治疗策略，但溶栓治疗后出现的缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）会进一步加重原组织损伤，炎症损伤和凋亡基因激活是导致 IRI 的主要因素[2-3]。研究表明通过抑制炎性反应、小胶质细胞活性，降低梗死病灶周围炎性介质浓度水平，可以缩小脑梗死体积，显著改善神经功能[4-5]。
我们前期研究将携带 IL-10 基因的腺病毒载体（recombinant adenovirus IL-10，Ad IL-10）转染至 BMSCs（AdIL-10-BMSCs），并将其移植至大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血 2 h 大鼠模型，结果显示 AdIL-10-BMSCs 对大鼠大脑 IRI 有保护作用[6]。本实验旨在进一步观察移植 AdIL-10-BMSCs 后，大鼠大脑缺血性病灶及周围组织内小胶质细胞、TNF-α、IL-1β表达变化，以及神经细胞凋亡情况，探讨 AdIL-10-BMSCs 对缺血性脑卒中的保护机制。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
清洁级成年 SD 雄性大鼠 45 只，体质量 250～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。AdIL-10 由上海吉凯基因技术有限公司提供。BrdU（Sigma 公司，美国）；小鼠抗大鼠 OX42 单克隆抗体（Abcam 公司，英国）；TNF-α ELISA 试剂盒、IL-1β ELISA 试剂盒（R&D 公司，美国）；一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒、DAPI 染色液、FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG（江苏碧云天生物科技有限公司）；小鼠抗 BrdU 单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
MCO-5AC 型 CO2 培养箱、酶标仪（SANYO 公司，日本）；倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；荧光显微镜、CM1900 冰冻切片机、RM2015 石蜡切片机（Leica 公司，德国）。
1.2 AdIL-10-BMSCs 制备
取 5 只大鼠骨髓采用贴壁培养法分离培养 BMSCs[7]，取第 3 代细胞行免疫组织化学染色鉴定，显示细胞 CD44 阳性、CD34 阴性，提示培养细胞为 BMSCs。取第 3 代 BMSCs，参照本课题组方法[6] 将 AdIL-10 基因转染至细胞，制备 AdIL-10-BMSCs。均于移植前 24 h 制备，备用。
1.3 实验分组及方法
取 40 只大鼠制备 MCAO 模型，10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，选择右侧大脑中动脉，通过颈外动脉将线栓插入颈内动脉至大脑中动脉，栓子从颈内动脉和颈外动脉分叉处进入 1.8～1.9 cm。栓塞 2 h 后拔出栓子，制备 MACO 缺血 2 h 模型。然后，将大鼠模型随机分为 A、B、C、D 4 组，每组 10 只。模型制备后 3 h 于各组大鼠尾静脉注射对应试剂或细胞，A 组注射 1 mL 含 10%FBS 的 L-DMEM 培养液；B 组注射 61.78 ng IL-10（采用 ELISA 法测得 1 mL AdIL-10-BMSCs 中的 IL-10 表达量）；C 组注射 1 mL BMSCs 悬液，细胞浓度为 2×106 个/mL；D 组：注射 1 mL AdIL-10-BMSCs 悬液，细胞浓度 2×106 个/mL。C、D 组细胞移植前 72 h 采用 10 μg/mL BrdU 孵育标记。7 d 后大鼠经颈总动脉灌注处死，取脑组织进行以下观测。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况 观察实验期间各组动物存活情况。
1.4.2 BrdU 免疫荧光染色观察 各组取 4 只大鼠脑组织置于 4% 多聚甲醛固定 24 h，放入脑模中，于视交叉处行冠状切片，片厚 2 mm。取前囟（2 片）及小脑（4 片）组织常规石蜡包埋，连续冠状切片，片厚 7 μm，制备石蜡切片。取 C、D 组部分切片常规脱蜡至水，0.04% 胃蛋白酶室温下修复 6 min，正常羊血清封闭，滴加小鼠抗 BrdU 单克隆抗体（1∶300），4℃ 过夜，滴加 FITC 标记的羊抗小鼠 IgG，防淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察绿色荧光细胞。
1.4.3 免疫组织化学染色观察 各组取 3 只大鼠脑组织按照顺序置于 4% 多聚甲醛固定 4 h，20% 蔗糖溶液 4 h，30% 蔗糖溶液中直至组织标本沉底； 0.01mol/L PBS 缓冲液冲洗后，将脑组织放入脑模中，同 1.4.2 方法切片。取前囟（2 片）及小脑（4 片）组织置于冰冻切片机，行冠状连续冰冻切片，片厚 20 μm。枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，3%H2O2 溶液消除内源性过氧化物酶活性，正常羊血清封闭，滴加小鼠抗大鼠 OX42 单克隆抗体（1∶500），4℃ 过夜，滴加生物素化山羊抗小鼠二抗工作液，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，DAB 避光显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。镜下观察 OX42 阳性细胞呈棕褐色，胞体大，突起短而粗，呈典型的“阿米巴样”。高倍镜下（×400），各组取 5 张切片，每张切片取 5 个视野，计数 OX42 阳性细胞。
1.4.4 ELISA 检测 TNF-α及 IL-1β含量 各组取 3 只大鼠脑组织加入 5 倍体积的 RIPA 裂解液，制备脑组织匀浆。匀浆液以离心半径 13.5 cm、2 500 r/min 离心 20 min。取上清液，采用 BCA 法参照试剂盒说明书测量 TNF-α、IL-1β含量。结果以每克蛋白所含细胞因子皮克数来表示，即 pg/g（pro）。
1.4.5 TUNEL 法检测梗死灶及其周围半暗带神经细胞凋亡 取 1.4.2 制备的各组石蜡切片，常规脱蜡至水，滴加蛋白酶 K 溶液，37℃ 孵育 20 min。加 50 μL TUNEL 检测液，37℃ 避光孵育 60 min，DAPI 复染。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。取相同冠状位皮层切片，各组取 5 张切片，高倍镜下（×400），梗死灶周围随机选取 5 个非连续视野计数凋亡细胞（呈绿色荧光）。
1.5 统计学方法
采用 SPSS16.0 统计软件进行分析；数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
麻醉后约 2 h 大鼠均完全清醒，出现神经功能缺损症状，实验期间各组大鼠均无死亡。
2.2 BrdU 免疫荧光染色观察
镜下观察示，C、D 组脑组织中均见呈绿色荧光的 BrdU 阳性细胞，主要分布于梗死灶周围的纹状体、大脑皮质、皮质下等部位。见图 1。
图1
D 组 BrdU 免疫荧光染色观察（×400）
Figure1.
Immunofluorescence staining of Brdu in group D (×400)
2.3 免疫组织化学染色观察
镜下观察，各组均可见 OX42 阳性细胞（图 2）。A、B、C、D 组 OX42 阳性细胞数分别为（45.16±4.47）、（35.08±3.84）、（36.25±4.15）、（25.21 ±5.34）个/HP。其中，B、C、D 组 OX42 阳性细胞数明显少于 A 组，D 组少于 B、C 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05），B、C 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图2
OX42 免疫组织化学染色观察（×400） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组
Figure2.
Immunohistochemical staining of OX42 (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.4 ELISA 检测 TNF-α及 IL-1β含量
A、B、C、D 组 TNF-α含量分别为（1.27±0.21）×103、（1.02±0.09）×103、（1.05±0.11）×103、（0.82±0.04）×103pg/g（pro），IL-1β含量分别为（1.26±0.15）×103、（0.95±0.08）×103、（0.99±0.07）×103、（0.61±0.03）×103pg/g（pro）。D 组大鼠脑组织中 TNF-α、IL-1β含量较其余 3 组明显降低，B、C 组低于与 A 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5 TUNEL 法检测缺血病灶及其周围半暗带神经细胞凋亡
镜下观察，各组梗死灶位于大鼠脑额叶、颞叶、顶叶皮质和纹状体，凋亡细胞（TUNEL 阳性细胞）主要见于梗死灶周围的纹状体及额顶皮质下脑 组织（即缺血半暗带）。见图 3、4。
图3
各组 TUNEL 染色观察（×400） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组
Figure3.
TUNEL staining in each group (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
图4
各组TUNEL染色DAPI复染后观察（×400） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组
Figure4.
TUNEL staining observation after being counterstained with DAPI in each group (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
A、B、C、D 组 TUNEL 阳性细胞数分别为（51.26±5.17）、（37.12±4.35）、（38.65±4.42）、（29.67±3.98）个/HP，D 组与 A、B、C 组，B、C 组与 A 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
目前干细胞治疗脑卒中已进入临床试验阶段，主要有 3 条移植路线：脑实质内、血管和脑池内移植。脑实质内和脑池内移植操作复杂，而且可能发生严重并发症，如颅内压增高、癫痫发作、慢性硬膜下血肿等[8]，临床试验应用逐渐减少。静脉移植操作简便，对患者脑组织无二次损伤。急性脑梗死后血脑屏障完整性破坏，通透性增加并至少持续 2 周[9]，因此 BMSCs 能通过血脑屏障进入脑实质。研究表明经静脉移植后，随着血液循环约 75% BMSCs 聚集在缺血病灶中心，约 18.5% BMSCs 聚集在缺血半暗带内[10]。这种移植入体内的 BMSCs 向损伤及炎症区域迁移、聚集的能力，即为 BMSCs 的归巢特性。因此本实验采用 BrdU 对细胞进行标记后经尾静脉移植，移植后发现梗死区周边有 BrdU 阳性细胞，表明移植细胞迁移至损伤区域。
IRI 是一复杂的病理生理过程，主要包括自由基损伤、能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性、细胞内 Ca2+ 超载、炎性损伤和凋亡基因激活等[11-12]。脑缺血后的炎性反应包括小胶质细胞活化、中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润以及大量细胞毒性物质（如活性氧、蛋白酶、细胞因子、黏附分子、趋化因子等）的释放[13-14]。这些炎性反应能改变脑微环境，引起脑微血管病变和脑血管痉挛、血脑屏障通透性增加，导致脑水肿，进一步加重脑损伤[15]。因此减轻炎性损伤成为治疗急性脑梗死的主要途径之一。
小胶质细胞是脑组织内重要的免疫效应细胞，属于单核-吞噬细胞系统，常处于静止状态，呈“分枝状”。小胶质细胞易被大脑任何类型的损伤或疾病活化，活化后的细胞体积变大，胞体呈圆形，细胞突起减少，呈“阿米巴状”。缺血缺氧是诱发小胶质细胞活化和增殖的重要因素之一[16-17]。研究表明在缺血性脑卒中急性期，小胶质细胞分泌各种炎性介质，造成神经细胞损伤，在后期可促进神经再生[18]。因此脑缺血再灌注早期，抑制小胶质细胞活性，可减少脑梗死体积，对脑组织起保护作用[19]。
TNF-α是脑缺血损伤中一种重要的促炎性细胞因子，中枢神经系统血管内皮细胞、星形胶质细胞以及小胶质细胞均可产生[20]。TNF-α可促进白细胞从血管内溢出，诱导脑缺血区神经胶质细胞和内皮细胞黏附分子表达，促使白细胞聚集在损伤组织，通过阻塞微血管、形成自由基、释放细胞毒素等多种机制，引起血脑屏障通透性增加，最终造成严重的脑组织损伤[21]。
正常脑组织内有少量 IL-1β，生理浓度的 IL-1β能保护神经元免遭兴奋性氨基酸毒性的损伤。缺血后活化的少突胶质细胞、小胶质细胞、星形细胞及浸润的巨噬细胞可分泌 IL-1β。持续表达的 IL-1β可以诱导黏附分子表达，促进内皮细胞和白细胞黏附，导致脑血流速度降低[22]。IL-1β还可导致白细胞释放自由基、基质金属蛋白酶等因子损害神经元，破坏血脑屏障，加重脑水肿[23]。
本研究结果显示，移植后 7 d D 组 OX42 阳性细胞数最少，TNF-α、IL-1β含量也明显降低，与其余 3 组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。表明 AdIL-10-BMSCs 能抑制脑缺血再灌注损伤中小胶质细胞活性，进而抑制促炎性因子 TNF-α、IL-1β的表达。另外，凋亡细胞主要见于梗死灶周围的纹状体及额顶皮质下脑组织（相当于缺血半暗带），D 组凋亡细胞数显著减少，与其余 3 组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。表明 AdIL-10-BMSCs 能够抑制梗死灶周围脑组织中神经细胞凋亡。
综上述，AdIL-10-BMSCs 通过抑制小胶质细胞分泌促炎性因子 TNF-α、IL-1β，减少单核细胞及巨噬细胞在缺血病灶周围聚集，缩小梗死灶面积，另外通过抑制梗死灶周围脑组织神经细胞凋亡，对大鼠脑 IRI 起保护作用。本实验为缺血性脑卒中的治疗提供了新思路。
据报道，脑卒中已升为中国国民第 1 位死因，并且发病年龄呈年轻化趋势，严重威胁国民生命健康和生活质量[1]。其中 80% 脑卒中为缺血性，快速再灌注是缺血性脑卒中重要治疗策略，但溶栓治疗后出现的缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）会进一步加重原组织损伤，炎症损伤和凋亡基因激活是导致 IRI 的主要因素[2-3]。研究表明通过抑制炎性反应、小胶质细胞活性，降低梗死病灶周围炎性介质浓度水平，可以缩小脑梗死体积，显著改善神经功能[4-5]。
我们前期研究将携带 IL-10 基因的腺病毒载体（recombinant adenovirus IL-10，Ad IL-10）转染至 BMSCs（AdIL-10-BMSCs），并将其移植至大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血 2 h 大鼠模型，结果显示 AdIL-10-BMSCs 对大鼠大脑 IRI 有保护作用[6]。本实验旨在进一步观察移植 AdIL-10-BMSCs 后，大鼠大脑缺血性病灶及周围组织内小胶质细胞、TNF-α、IL-1β表达变化，以及神经细胞凋亡情况，探讨 AdIL-10-BMSCs 对缺血性脑卒中的保护机制。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
清洁级成年 SD 雄性大鼠 45 只，体质量 250～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。AdIL-10 由上海吉凯基因技术有限公司提供。BrdU（Sigma 公司，美国）；小鼠抗大鼠 OX42 单克隆抗体（Abcam 公司，英国）；TNF-α ELISA 试剂盒、IL-1β ELISA 试剂盒（R&D 公司，美国）；一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒、DAPI 染色液、FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG（江苏碧云天生物科技有限公司）；小鼠抗 BrdU 单克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。
MCO-5AC 型 CO2 培养箱、酶标仪（SANYO 公司，日本）；倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；荧光显微镜、CM1900 冰冻切片机、RM2015 石蜡切片机（Leica 公司，德国）。
1.2 AdIL-10-BMSCs 制备
取 5 只大鼠骨髓采用贴壁培养法分离培养 BMSCs[7]，取第 3 代细胞行免疫组织化学染色鉴定，显示细胞 CD44 阳性、CD34 阴性，提示培养细胞为 BMSCs。取第 3 代 BMSCs，参照本课题组方法[6] 将 AdIL-10 基因转染至细胞，制备 AdIL-10-BMSCs。均于移植前 24 h 制备，备用。
1.3 实验分组及方法
取 40 只大鼠制备 MCAO 模型，10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，选择右侧大脑中动脉，通过颈外动脉将线栓插入颈内动脉至大脑中动脉，栓子从颈内动脉和颈外动脉分叉处进入 1.8～1.9 cm。栓塞 2 h 后拔出栓子，制备 MACO 缺血 2 h 模型。然后，将大鼠模型随机分为 A、B、C、D 4 组，每组 10 只。模型制备后 3 h 于各组大鼠尾静脉注射对应试剂或细胞，A 组注射 1 mL 含 10%FBS 的 L-DMEM 培养液；B 组注射 61.78 ng IL-10（采用 ELISA 法测得 1 mL AdIL-10-BMSCs 中的 IL-10 表达量）；C 组注射 1 mL BMSCs 悬液，细胞浓度为 2×106 个/mL；D 组：注射 1 mL AdIL-10-BMSCs 悬液，细胞浓度 2×106 个/mL。C、D 组细胞移植前 72 h 采用 10 μg/mL BrdU 孵育标记。7 d 后大鼠经颈总动脉灌注处死，取脑组织进行以下观测。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况 观察实验期间各组动物存活情况。
1.4.2 BrdU 免疫荧光染色观察 各组取 4 只大鼠脑组织置于 4% 多聚甲醛固定 24 h，放入脑模中，于视交叉处行冠状切片，片厚 2 mm。取前囟（2 片）及小脑（4 片）组织常规石蜡包埋，连续冠状切片，片厚 7 μm，制备石蜡切片。取 C、D 组部分切片常规脱蜡至水，0.04% 胃蛋白酶室温下修复 6 min，正常羊血清封闭，滴加小鼠抗 BrdU 单克隆抗体（1∶300），4℃ 过夜，滴加 FITC 标记的羊抗小鼠 IgG，防淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察绿色荧光细胞。
1.4.3 免疫组织化学染色观察 各组取 3 只大鼠脑组织按照顺序置于 4% 多聚甲醛固定 4 h，20% 蔗糖溶液 4 h，30% 蔗糖溶液中直至组织标本沉底； 0.01mol/L PBS 缓冲液冲洗后，将脑组织放入脑模中，同 1.4.2 方法切片。取前囟（2 片）及小脑（4 片）组织置于冰冻切片机，行冠状连续冰冻切片，片厚 20 μm。枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，3%H2O2 溶液消除内源性过氧化物酶活性，正常羊血清封闭，滴加小鼠抗大鼠 OX42 单克隆抗体（1∶500），4℃ 过夜，滴加生物素化山羊抗小鼠二抗工作液，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，DAB 避光显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。镜下观察 OX42 阳性细胞呈棕褐色，胞体大，突起短而粗，呈典型的“阿米巴样”。高倍镜下（×400），各组取 5 张切片，每张切片取 5 个视野，计数 OX42 阳性细胞。
1.4.4 ELISA 检测 TNF-α及 IL-1β含量 各组取 3 只大鼠脑组织加入 5 倍体积的 RIPA 裂解液，制备脑组织匀浆。匀浆液以离心半径 13.5 cm、2 500 r/min 离心 20 min。取上清液，采用 BCA 法参照试剂盒说明书测量 TNF-α、IL-1β含量。结果以每克蛋白所含细胞因子皮克数来表示，即 pg/g（pro）。
1.4.5 TUNEL 法检测梗死灶及其周围半暗带神经细胞凋亡 取 1.4.2 制备的各组石蜡切片，常规脱蜡至水，滴加蛋白酶 K 溶液，37℃ 孵育 20 min。加 50 μL TUNEL 检测液，37℃ 避光孵育 60 min，DAPI 复染。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。取相同冠状位皮层切片，各组取 5 张切片，高倍镜下（×400），梗死灶周围随机选取 5 个非连续视野计数凋亡细胞（呈绿色荧光）。
1.5 统计学方法
采用 SPSS16.0 统计软件进行分析；数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
麻醉后约 2 h 大鼠均完全清醒，出现神经功能缺损症状，实验期间各组大鼠均无死亡。
2.2 BrdU 免疫荧光染色观察
镜下观察示，C、D 组脑组织中均见呈绿色荧光的 BrdU 阳性细胞，主要分布于梗死灶周围的纹状体、大脑皮质、皮质下等部位。见图 1。
图1
D 组 BrdU 免疫荧光染色观察（×400）
Figure1.
Immunofluorescence staining of Brdu in group D (×400)
2.3 免疫组织化学染色观察
镜下观察，各组均可见 OX42 阳性细胞（图 2）。A、B、C、D 组 OX42 阳性细胞数分别为（45.16±4.47）、（35.08±3.84）、（36.25±4.15）、（25.21 ±5.34）个/HP。其中，B、C、D 组 OX42 阳性细胞数明显少于 A 组，D 组少于 B、C 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05），B、C 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
图2
OX42 免疫组织化学染色观察（×400） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组
Figure2.
Immunohistochemical staining of OX42 (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.4 ELISA 检测 TNF-α及 IL-1β含量
A、B、C、D 组 TNF-α含量分别为（1.27±0.21）×103、（1.02±0.09）×103、（1.05±0.11）×103、（0.82±0.04）×103pg/g（pro），IL-1β含量分别为（1.26±0.15）×103、（0.95±0.08）×103、（0.99±0.07）×103、（0.61±0.03）×103pg/g（pro）。D 组大鼠脑组织中 TNF-α、IL-1β含量较其余 3 组明显降低，B、C 组低于与 A 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.5 TUNEL 法检测缺血病灶及其周围半暗带神经细胞凋亡
镜下观察，各组梗死灶位于大鼠脑额叶、颞叶、顶叶皮质和纹状体，凋亡细胞（TUNEL 阳性细胞）主要见于梗死灶周围的纹状体及额顶皮质下脑 组织（即缺血半暗带）。见图 3、4。
图3
各组 TUNEL 染色观察（×400） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组
Figure3.
TUNEL staining in each group (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
图4
各组TUNEL染色DAPI复染后观察（×400） a. A 组； b. B 组； c. C 组； d. D 组
Figure4.
TUNEL staining observation after being counterstained with DAPI in each group (×400) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
A、B、C、D 组 TUNEL 阳性细胞数分别为（51.26±5.17）、（37.12±4.35）、（38.65±4.42）、（29.67±3.98）个/HP，D 组与 A、B、C 组，B、C 组与 A 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；B、C 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
目前干细胞治疗脑卒中已进入临床试验阶段，主要有 3 条移植路线：脑实质内、血管和脑池内移植。脑实质内和脑池内移植操作复杂，而且可能发生严重并发症，如颅内压增高、癫痫发作、慢性硬膜下血肿等[8]，临床试验应用逐渐减少。静脉移植操作简便，对患者脑组织无二次损伤。急性脑梗死后血脑屏障完整性破坏，通透性增加并至少持续 2 周[9]，因此 BMSCs 能通过血脑屏障进入脑实质。研究表明经静脉移植后，随着血液循环约 75% BMSCs 聚集在缺血病灶中心，约 18.5% BMSCs 聚集在缺血半暗带内[10]。这种移植入体内的 BMSCs 向损伤及炎症区域迁移、聚集的能力，即为 BMSCs 的归巢特性。因此本实验采用 BrdU 对细胞进行标记后经尾静脉移植，移植后发现梗死区周边有 BrdU 阳性细胞，表明移植细胞迁移至损伤区域。
IRI 是一复杂的病理生理过程，主要包括自由基损伤、能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性、细胞内 Ca2+ 超载、炎性损伤和凋亡基因激活等[11-12]。脑缺血后的炎性反应包括小胶质细胞活化、中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润以及大量细胞毒性物质（如活性氧、蛋白酶、细胞因子、黏附分子、趋化因子等）的释放[13-14]。这些炎性反应能改变脑微环境，引起脑微血管病变和脑血管痉挛、血脑屏障通透性增加，导致脑水肿，进一步加重脑损伤[15]。因此减轻炎性损伤成为治疗急性脑梗死的主要途径之一。
小胶质细胞是脑组织内重要的免疫效应细胞，属于单核-吞噬细胞系统，常处于静止状态，呈“分枝状”。小胶质细胞易被大脑任何类型的损伤或疾病活化，活化后的细胞体积变大，胞体呈圆形，细胞突起减少，呈“阿米巴状”。缺血缺氧是诱发小胶质细胞活化和增殖的重要因素之一[16-17]。研究表明在缺血性脑卒中急性期，小胶质细胞分泌各种炎性介质，造成神经细胞损伤，在后期可促进神经再生[18]。因此脑缺血再灌注早期，抑制小胶质细胞活性，可减少脑梗死体积，对脑组织起保护作用[19]。
TNF-α是脑缺血损伤中一种重要的促炎性细胞因子，中枢神经系统血管内皮细胞、星形胶质细胞以及小胶质细胞均可产生[20]。TNF-α可促进白细胞从血管内溢出，诱导脑缺血区神经胶质细胞和内皮细胞黏附分子表达，促使白细胞聚集在损伤组织，通过阻塞微血管、形成自由基、释放细胞毒素等多种机制，引起血脑屏障通透性增加，最终造成严重的脑组织损伤[21]。
正常脑组织内有少量 IL-1β，生理浓度的 IL-1β能保护神经元免遭兴奋性氨基酸毒性的损伤。缺血后活化的少突胶质细胞、小胶质细胞、星形细胞及浸润的巨噬细胞可分泌 IL-1β。持续表达的 IL-1β可以诱导黏附分子表达，促进内皮细胞和白细胞黏附，导致脑血流速度降低[22]。IL-1β还可导致白细胞释放自由基、基质金属蛋白酶等因子损害神经元，破坏血脑屏障，加重脑水肿[23]。
本研究结果显示，移植后 7 d D 组 OX42 阳性细胞数最少，TNF-α、IL-1β含量也明显降低，与其余 3 组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。表明 AdIL-10-BMSCs 能抑制脑缺血再灌注损伤中小胶质细胞活性，进而抑制促炎性因子 TNF-α、IL-1β的表达。另外，凋亡细胞主要见于梗死灶周围的纹状体及额顶皮质下脑组织（相当于缺血半暗带），D 组凋亡细胞数显著减少，与其余 3 组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。表明 AdIL-10-BMSCs 能够抑制梗死灶周围脑组织中神经细胞凋亡。
综上述，AdIL-10-BMSCs 通过抑制小胶质细胞分泌促炎性因子 TNF-α、IL-1β，减少单核细胞及巨噬细胞在缺血病灶周围聚集，缩小梗死灶面积，另外通过抑制梗死灶周围脑组织神经细胞凋亡，对大鼠脑 IRI 起保护作用。本实验为缺血性脑卒中的治疗提供了新思路。
