引用本文： 段鑫, 陈强, 李浪, 许钊, 范兆心, 赵雪, 张林昊, 项舟. 两种软骨缺损模型制备效果比较. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(10): 1220-1224. doi: 10.7507/1002-1892.20160250 复制
关节软骨是构成滑膜关节的重要组成部分，其修复潜能非常有限，损伤后很难愈合，而关节软骨损伤会导致退行性关节炎发生。退行性关节炎的主要临床表现为疼痛、僵硬等，严重者甚至出现关节变形、肌肉萎缩，影响正常生活[1]。因此建立合适的软骨缺损模型，可为软骨缺损的防治提供良好的实验平台。文献报道犬膝关节股骨内侧髁软骨厚度为0.95～1.30mm[2]，这一厚度在制备软骨缺损的同时可不损伤软骨下骨；同时，犬的后膝关节解剖及承重特点均与人较相似，因此犬作为骨关节炎及软骨缺损研究的实验动物是较好选择。本研究以比格犬作为实验动物，比较内侧副韧带切断加半月板切除以及软骨刮除两种不同软骨缺损造模方法，为进一步实验及临床应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
成年健康比格犬10只，雌雄不限，体质量5.0～10.0 kg，由四川大学华西医院动物实验中心提供。随机分为3组，A组（n=4）为内侧副韧带切断加半月板切除组，B组（n=4）为软骨刮除组，C组（n=2）为正常对照组。
番红O软骨染色液（Leagene公司，德国）；4%多聚甲醛、EDTA脱钙液、石蜡、苏木素染液、伊红染液、甲苯胺蓝染液等由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室•干细胞与组织工程研究室自备。角膜环钻（直径4 mm）、耳鼻喉乳突刮匙（成都溶海华康生物科技有限公司）；倒置相差显微镜（Leica公司，德国）；手术用针线、10号手术刀片、刀柄、电刀、纱布、剪刀由四川大学华西医院动物实验中心提供。
1.2 造模方法
1.2.1 A组
取比格犬4只，术前6 h禁饮、禁食。以3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后，双膝关节备皮，术前肌肉注射青霉素80万U。采用膝关节前内侧入路，逐层切开皮肤和皮下组织；切开关节囊，将髌骨向外侧脱位，暴露半月板；切除半月板并切断内侧副韧带；冲洗关节，缝合关节囊，逐层关闭切口。术后肌肉注射青霉素80万U，1次/d，共3 d。统一条件下分笼饲料喂养。见图 1 a。
图1
A、B组软骨缺损模型 ⓐ A组 ⓑ B组 1.2.2 B组
取比格犬4只，术前处理及手术切口同A组。切开关节囊后，将髌骨向外侧脱位，暴露股骨髁。使用角膜环钻（直径4 mm）于髁间沟及内外髁打孔定位，于髌股关节面摩擦部位及股骨内外髁承重部位共制造4个直径4 mm的软骨缺损；使用乳突刮匙刮除软骨，操作轻柔，注意勿损伤软骨下骨；刮除干净后冲洗关节，缝合关节囊，逐层关闭切口。术后处理同A组。见图 1 b。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
术后观察实验动物一般状况、步态、关节活动度、伤口愈合及有无感染等情况。
1.3.2 MRI检查
术后16周采用MRI观察各组膝关节软骨缺损处情况。
1.3.3 标本大体观察
术后16周，空气栓塞法处死所有实验动物，取股骨髁观察内髁、外髁、髁间软骨表面光滑度，是否有骨关节炎表现。
1.3.4 组织学观察
术后16周取各组标本，4%多聚甲醛固定7 d，EDTA脱钙，乙醇脱水，石蜡包埋，切片，行HE、甲苯胺蓝、番红O染色，倒置相差显微镜下观察。采用国际骨关节炎研究协会（OARSI）骨关节炎组织学评分表[3]对A、B组进行评分。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
A、B组实验动物一般情况均良好，进食、排泄、精神可；切口愈合良好，无红肿、感染征象；术后膝关节活动度可，无明显受限。
2.2 MRI检查
与C组MRI相比，术后16周A组可见关节面平滑，未见明显软骨缺损；B组可见关节面不连续，刮除部位有明显软骨缺口。见图 2。
2.3 标本大体观察
与C组标本相比，术后16周A组可见股骨髁部分软骨磨损痕迹；B组可见软骨缺损明显，缺损部位呈暗红色，部分缺损有少许白色瘢痕样纤维组织长入。见图 3。
2.4 组织学观察
术后16周HE、甲苯胺蓝、番红O染色结果示，A组软骨结构排列表现为软骨表面浅层纤维形成，且不均匀；尚未出现软骨表面不连续，无软骨皲裂扩散或侵蚀，无明显关节软骨损害、关节软骨剥脱、关节变形等严重骨关节炎表现；软骨厚度及软骨基质染色与C组无明显差别。B组可观察到软骨面不连续，全层软骨缺失，软骨缺损边界清晰，软骨下骨未受累及；软骨缺损部位底部很少量透明软骨样组织生长，较少纤维软组织长入，软骨缺损明显。C组软骨结构排列整齐，软骨表面连续，无软骨缺损骨关节炎表现。见图 4～6。
图4
术后16周各组HE染色观察（倒置相差显微镜×40） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 A、B组OARSI骨关节炎组织学评分分别为（0.940±0.574）、（4.500±0.516）分，差异有统计学意义（t=18.461，P=0.000）。
3 讨论
软骨损伤是骨科常见疾病，创伤是造成骨软骨缺损的主要因素。软骨缺损可能造成关节不稳，从而造成关节退化性骨关节炎。关节软骨损伤治疗困难，目前已成为临床治疗的一大挑战。退化性骨关节炎是目前最常见的关节软骨损伤疾病，每年有上百万患者受该病困扰，造成了医疗健康系统的巨大开支[4-5]。直接研究人的软骨损伤困难较多，包括疾病发展缓慢、病因复杂、早期缺乏症状、软骨损伤与症状无确切关联等[6]。因此建立软骨缺损骨关节炎 动物模型，对研究者了解膝关节骨关节炎很有必 要。
可作为软骨缺损骨关节炎动物模型的动物选择很多。理想的膝关节软骨缺损模型需具备与人类膝关节相似的结构，包括大小、结构及软骨损伤再生机制，而且在相应诱发条件下能产生软骨缺损，并发展成为骨关节炎。已有研究表明，C57BL小鼠、昆明小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠、Halrty豚鼠、B63CFI栗鼠、新西兰大白兔、日本大耳白兔、家兔、小型猪等均可作为软骨缺损骨关节炎造模动物[7]，但人与动物的关节在生理及解剖方面不同，尚无一种动物软骨缺损模型可直接与人类相比。目前运用较多的是鼠和兔模型，其中鼠的关节软骨退变组织学特性与人类骨关节炎相似，但其关节几何形状与人类不同且不含硫酸角质素[8]；兔膝关节与人膝关节在解剖方面相似且价格便宜，但兔为小型动物，不利于手术操作。相比于兔、鼠等小型动物，犬类体型较大，便于手术 操作及进行大体标本和影像学、组织学观察。目前研究多采用杂种犬，而本研究选择的比格犬性格温顺、品种单一，减少了动物本身导致的实验偏 倚。
目前，软骨缺损骨关节炎模型造模方法主要包括手术、关节腔内药物注射、自然发生的骨关节炎及转基因模型等[9]。相比于自然发生，关节腔内药物注射造模、手术方法造模能快速造成软骨缺损并发展成为骨关节炎，且具有可重复性[10]。许多研究采用切断内侧副韧带、前交叉韧带或半月板的方法进行软骨缺损骨关节炎造模。Libicher等[11]对24只比格犬采用前交叉韧带切断进行软骨缺损骨关节炎造模，术后48周MRI显示膝关节出现骨关节炎早期病变；Boileau等[12]对5只杂种犬行前交叉韧带切断术，术后4、8、26周MRI均观察到软骨缺损骨关节炎表现。而我们的研究发现，切断内侧副韧带及切除半月板后16周，MRI、组织学染色显示关节结构未见明显改变及未见明显软骨缺损，这可能与术后比格犬活动不足，同时动物本身对损伤有一定修复机制有关。软骨刮除用于软骨缺损骨关节炎造模目前已有报道。Shortcroff等[13]在1996年就对该模型进行了初步研究，他们在6只杂种犬的股骨内外髁上制造了2mm或3mm直径的软骨全层缺损，术后2、4周处死动物后观察，缺损处均无组织长入。Breinan等[14]在1997年也应用相同模型进行了软骨缺损修复的相关研究，他们在14只杂种犬的膝关节髁间沟两侧制造了直径4 mm缺损，组织学结果显示造模成功，并用于后续实验。项舟等[15]在2006年的研究中同样应用该模型并成功造模，大体观察明显可见软骨缺损，显示了该模型的科研价值。然而该模型仍存在一些弊端，实验中我们发现该方法某些缺损制造过程不可避免地会对软骨下骨造成微骨折。目前，对于何种方法能够快速造成软骨缺损骨关节炎，尚无大型动物研究直接对比，我们比较两种造模方法，以期对后续研究提供参考。
采用X线片、micro-CT均可成功进行软骨缺损骨关节炎造模效果检测，但其诊断敏感性不高；MRI能更好地显示骨刺的变化，且能更好地区分关节渗出及滑膜增厚[16-19]。另外，组织学观察被广泛应用于动物模型[20]。本研究中，我们从大体观察、影像学及组织学方面同时进行观察比较，并对组织学进行量化评分，结果均表明软骨刮除能在更短时间达到软骨破坏，从而成功达到软骨缺损造模效果，是一种构建软骨缺损模型的良好方法。
关节软骨是构成滑膜关节的重要组成部分，其修复潜能非常有限，损伤后很难愈合，而关节软骨损伤会导致退行性关节炎发生。退行性关节炎的主要临床表现为疼痛、僵硬等，严重者甚至出现关节变形、肌肉萎缩，影响正常生活[1]。因此建立合适的软骨缺损模型，可为软骨缺损的防治提供良好的实验平台。文献报道犬膝关节股骨内侧髁软骨厚度为0.95～1.30mm[2]，这一厚度在制备软骨缺损的同时可不损伤软骨下骨；同时，犬的后膝关节解剖及承重特点均与人较相似，因此犬作为骨关节炎及软骨缺损研究的实验动物是较好选择。本研究以比格犬作为实验动物，比较内侧副韧带切断加半月板切除以及软骨刮除两种不同软骨缺损造模方法，为进一步实验及临床应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
成年健康比格犬10只，雌雄不限，体质量5.0～10.0 kg，由四川大学华西医院动物实验中心提供。随机分为3组，A组（n=4）为内侧副韧带切断加半月板切除组，B组（n=4）为软骨刮除组，C组（n=2）为正常对照组。
番红O软骨染色液（Leagene公司，德国）；4%多聚甲醛、EDTA脱钙液、石蜡、苏木素染液、伊红染液、甲苯胺蓝染液等由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室•干细胞与组织工程研究室自备。角膜环钻（直径4 mm）、耳鼻喉乳突刮匙（成都溶海华康生物科技有限公司）；倒置相差显微镜（Leica公司，德国）；手术用针线、10号手术刀片、刀柄、电刀、纱布、剪刀由四川大学华西医院动物实验中心提供。
1.2 造模方法
1.2.1 A组
取比格犬4只，术前6 h禁饮、禁食。以3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后，双膝关节备皮，术前肌肉注射青霉素80万U。采用膝关节前内侧入路，逐层切开皮肤和皮下组织；切开关节囊，将髌骨向外侧脱位，暴露半月板；切除半月板并切断内侧副韧带；冲洗关节，缝合关节囊，逐层关闭切口。术后肌肉注射青霉素80万U，1次/d，共3 d。统一条件下分笼饲料喂养。见图 1 a。
图1
A、B组软骨缺损模型 ⓐ A组 ⓑ B组 1.2.2 B组
取比格犬4只，术前处理及手术切口同A组。切开关节囊后，将髌骨向外侧脱位，暴露股骨髁。使用角膜环钻（直径4 mm）于髁间沟及内外髁打孔定位，于髌股关节面摩擦部位及股骨内外髁承重部位共制造4个直径4 mm的软骨缺损；使用乳突刮匙刮除软骨，操作轻柔，注意勿损伤软骨下骨；刮除干净后冲洗关节，缝合关节囊，逐层关闭切口。术后处理同A组。见图 1 b。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
术后观察实验动物一般状况、步态、关节活动度、伤口愈合及有无感染等情况。
1.3.2 MRI检查
术后16周采用MRI观察各组膝关节软骨缺损处情况。
1.3.3 标本大体观察
术后16周，空气栓塞法处死所有实验动物，取股骨髁观察内髁、外髁、髁间软骨表面光滑度，是否有骨关节炎表现。
1.3.4 组织学观察
术后16周取各组标本，4%多聚甲醛固定7 d，EDTA脱钙，乙醇脱水，石蜡包埋，切片，行HE、甲苯胺蓝、番红O染色，倒置相差显微镜下观察。采用国际骨关节炎研究协会（OARSI）骨关节炎组织学评分表[3]对A、B组进行评分。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
A、B组实验动物一般情况均良好，进食、排泄、精神可；切口愈合良好，无红肿、感染征象；术后膝关节活动度可，无明显受限。
2.2 MRI检查
与C组MRI相比，术后16周A组可见关节面平滑，未见明显软骨缺损；B组可见关节面不连续，刮除部位有明显软骨缺口。见图 2。
2.3 标本大体观察
与C组标本相比，术后16周A组可见股骨髁部分软骨磨损痕迹；B组可见软骨缺损明显，缺损部位呈暗红色，部分缺损有少许白色瘢痕样纤维组织长入。见图 3。
2.4 组织学观察
术后16周HE、甲苯胺蓝、番红O染色结果示，A组软骨结构排列表现为软骨表面浅层纤维形成，且不均匀；尚未出现软骨表面不连续，无软骨皲裂扩散或侵蚀，无明显关节软骨损害、关节软骨剥脱、关节变形等严重骨关节炎表现；软骨厚度及软骨基质染色与C组无明显差别。B组可观察到软骨面不连续，全层软骨缺失，软骨缺损边界清晰，软骨下骨未受累及；软骨缺损部位底部很少量透明软骨样组织生长，较少纤维软组织长入，软骨缺损明显。C组软骨结构排列整齐，软骨表面连续，无软骨缺损骨关节炎表现。见图 4～6。
图4
术后16周各组HE染色观察（倒置相差显微镜×40） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 A、B组OARSI骨关节炎组织学评分分别为（0.940±0.574）、（4.500±0.516）分，差异有统计学意义（t=18.461，P=0.000）。
3 讨论
软骨损伤是骨科常见疾病，创伤是造成骨软骨缺损的主要因素。软骨缺损可能造成关节不稳，从而造成关节退化性骨关节炎。关节软骨损伤治疗困难，目前已成为临床治疗的一大挑战。退化性骨关节炎是目前最常见的关节软骨损伤疾病，每年有上百万患者受该病困扰，造成了医疗健康系统的巨大开支[4-5]。直接研究人的软骨损伤困难较多，包括疾病发展缓慢、病因复杂、早期缺乏症状、软骨损伤与症状无确切关联等[6]。因此建立软骨缺损骨关节炎 动物模型，对研究者了解膝关节骨关节炎很有必 要。
可作为软骨缺损骨关节炎动物模型的动物选择很多。理想的膝关节软骨缺损模型需具备与人类膝关节相似的结构，包括大小、结构及软骨损伤再生机制，而且在相应诱发条件下能产生软骨缺损，并发展成为骨关节炎。已有研究表明，C57BL小鼠、昆明小鼠、Wistar大鼠、SD大鼠、Halrty豚鼠、B63CFI栗鼠、新西兰大白兔、日本大耳白兔、家兔、小型猪等均可作为软骨缺损骨关节炎造模动物[7]，但人与动物的关节在生理及解剖方面不同，尚无一种动物软骨缺损模型可直接与人类相比。目前运用较多的是鼠和兔模型，其中鼠的关节软骨退变组织学特性与人类骨关节炎相似，但其关节几何形状与人类不同且不含硫酸角质素[8]；兔膝关节与人膝关节在解剖方面相似且价格便宜，但兔为小型动物，不利于手术操作。相比于兔、鼠等小型动物，犬类体型较大，便于手术 操作及进行大体标本和影像学、组织学观察。目前研究多采用杂种犬，而本研究选择的比格犬性格温顺、品种单一，减少了动物本身导致的实验偏 倚。
目前，软骨缺损骨关节炎模型造模方法主要包括手术、关节腔内药物注射、自然发生的骨关节炎及转基因模型等[9]。相比于自然发生，关节腔内药物注射造模、手术方法造模能快速造成软骨缺损并发展成为骨关节炎，且具有可重复性[10]。许多研究采用切断内侧副韧带、前交叉韧带或半月板的方法进行软骨缺损骨关节炎造模。Libicher等[11]对24只比格犬采用前交叉韧带切断进行软骨缺损骨关节炎造模，术后48周MRI显示膝关节出现骨关节炎早期病变；Boileau等[12]对5只杂种犬行前交叉韧带切断术，术后4、8、26周MRI均观察到软骨缺损骨关节炎表现。而我们的研究发现，切断内侧副韧带及切除半月板后16周，MRI、组织学染色显示关节结构未见明显改变及未见明显软骨缺损，这可能与术后比格犬活动不足，同时动物本身对损伤有一定修复机制有关。软骨刮除用于软骨缺损骨关节炎造模目前已有报道。Shortcroff等[13]在1996年就对该模型进行了初步研究，他们在6只杂种犬的股骨内外髁上制造了2mm或3mm直径的软骨全层缺损，术后2、4周处死动物后观察，缺损处均无组织长入。Breinan等[14]在1997年也应用相同模型进行了软骨缺损修复的相关研究，他们在14只杂种犬的膝关节髁间沟两侧制造了直径4 mm缺损，组织学结果显示造模成功，并用于后续实验。项舟等[15]在2006年的研究中同样应用该模型并成功造模，大体观察明显可见软骨缺损，显示了该模型的科研价值。然而该模型仍存在一些弊端，实验中我们发现该方法某些缺损制造过程不可避免地会对软骨下骨造成微骨折。目前，对于何种方法能够快速造成软骨缺损骨关节炎，尚无大型动物研究直接对比，我们比较两种造模方法，以期对后续研究提供参考。
采用X线片、micro-CT均可成功进行软骨缺损骨关节炎造模效果检测，但其诊断敏感性不高；MRI能更好地显示骨刺的变化，且能更好地区分关节渗出及滑膜增厚[16-19]。另外，组织学观察被广泛应用于动物模型[20]。本研究中，我们从大体观察、影像学及组织学方面同时进行观察比较，并对组织学进行量化评分，结果均表明软骨刮除能在更短时间达到软骨破坏，从而成功达到软骨缺损造模效果，是一种构建软骨缺损模型的良好方法。
