引用本文： 陈渝, 邓忠良, 翁政, 陈诗谋, 童伟. NGF/MAG双基因共表达腺病毒修复大鼠周围神经损伤的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(8): 1026-1033. doi: 10.7507/1002-1892.20160206 复制
髓磷脂相关糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）是髓磷脂的重要组成部分，是神经轴突再生的强力抑制因子。研究显示，在慢性压缩性神经损伤诱发的神经轴突萌芽中MAG表达下降[1]。体外实验发现，MAG不仅抑制神经轴突生长，也能有效降低周围神经损伤后轴突异常分支形成[2]。NGF可有效促进神经生长，但新生神经组织结构紊乱，神经功能恢复差[3-4]。能否通过NGF与MAG二者协同作用，达到既促进受损神经组织修复，又抑制神经轴突异常增生，从而促进神经组织结构修复和功能重建，目前尚罕见相关报道。本研究拟构建NGF/MAG双基因共表达腺病毒（adenovirus exp res sing NGF and MAG，Ad-NGF-MAG），探讨其在大鼠坐骨神经损伤修复与再生中的作用。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
雄性SD大鼠37只，体质量180～200 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。人HEK293细胞株由重庆医科大学病理生理研究室提供。
5型腺病毒穿梭质粒pCA13、骨架质粒pBHGE3（Microbix Biosystems公司，加拿大）；核酸限制性内切酶XbaⅠ、NheⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ、ClaⅠ以及T4 DNA连接酶（TaKaRa公司，日本）；溶菌酶、氯化铯（Sigma公司，美国）；Taq DNA聚合酶（Promega公司，美国）；丙烯酰胺、N’N’-亚甲基双丙烯酰胺、Tris-base、甘氨酸、SDS（Amresco公司，美国）；琼脂糖凝胶（BIOWEST公司，法国）；Trizol、脂质体LTX and Plus（LIPOFECTAMINETM LTX and Plus Reagent）RNase A、M-MLV Reverse Transcriptase、Ribonuclerase Inhibitor、Lipofectamine2000转染试剂（Invitrogen公司，美国）；TritonX-100（Fluka公司，美国）；Anti-MAG（ab89780）、Anti-NGF（ab6199）一抗（Abcam公司，英国）；anti-β-GAPDH一抗（ProteinTech公司，美国）；DL2000、DL15000、MarkerⅢ、质粒小量提取试剂盒和大量提取试剂盒、DNA快速纯化回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]；山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；EasyPfu DNA Polymerase（北京全式金生物技术有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒[威格拉斯生物技术（北京）有限公司]。
冷冻台式离心机（Hettich公司，德国）；MJ PTC-100型PCR仪（东胜创新生物科技有限公司）；CO2培养箱、Nanodrop 1000型分光光度计（Thermo Scientific公司，美国）；—80℃冰箱（Sanyo公司，日本）；TE2000-U显微镜（Nikon公司，日本）；BX51显微镜（Olympus公司，日本）；JEM1230透射电镜（JEOL公司，日本）；MYTO肌电图仪（Esaote公司，意大利）；HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统（武汉长海科技有限责任公司）；电泳仪（北京市六一仪器厂）。引物合成、测序均由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 构建Ad-NGF-EGFP和Ad-NGF-MAG-EGFP质粒
1.2.1 pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒构建
通过PCR扩增分别得到XbaⅠ-SV40 promoter-NheⅠ和NheⅠ-EGFP-BamHⅠ，用XbaⅠ和NheⅠ双酶切SV40 promoter，用NheⅠ和BamHⅠ双酶切EGFP，并用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切pCA13。将SV40 promoter和EGFP同时连接至pCA13，得到pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒，并酶切鉴定。
1.2.2 pCA13-NGF-EGFP质粒构建
通过PCR扩增得到SalⅠ-NGF-EcoRⅠ，用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切NGF。用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒。将NGF连接至pCA13-SV40 promoter-EGFP，得到pCA13-NGF-EGFP质粒，并酶切鉴定。
1.2.3 大鼠MAG基因扩增
取5只SD大鼠坐骨神经，提取mRNA，逆转录为cDNA，使用高保真Taq酶扩增MAG基因；l%琼脂糖凝胶电泳及基因测序观察。
1.2.4 pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒构建
通过PCR扩增分别得到EcoRⅠ-IRES-ClaⅠ和ClaⅠ-MAG-XbaⅠ，用EcoRⅠ和ClaⅠ双酶切IRES，用ClaⅠ和XbaⅠ双酶切MAG。用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pCA13-NGF-EGFP质粒。将IRES和MAG同时连接至pCA13-NGF-EGFP后，得到pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒，并酶切鉴定。
1.2.5 Ad-NGF及Ad-NGF-MAG包装、鉴定、纯化及滴度测定
将pCA13-NGF-EGFP、pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒及骨架质粒pBHGE3用Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞株扩增，分离获得Ad-NGF及Ad-NGF-MAG，提取病毒DNA，并以其为模板，加入鉴定引物行PCR扩增，将PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析仪上观察。
病毒包装后48 h，倒置荧光显微镜下观察HEK293细胞。然后，收集细胞，提取HEK293细胞mRNA，并以将其逆转录为cDNA，RT-PCR检测NGF和MAG mRNA表达；Western blot检测NGF和MAG蛋白表达。氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩重组腺病毒Ad-NGF和Ad-NGF-MAG，经4℃，60 000×g高速离心6 h后，按Karbers公式计算病毒滴度。
1.3 动物模型建立及分组
取32只SD大鼠，随机分成4组（n=8）：对照组、空病毒组（Ad组）、单独表达NGF组（Ad-NGF组）和共表达NGF和MAG组（Ad-NGF-MAG组）。
Ad组、Ad-NGF组及Ad-NGF-MAG组参考文献[4-5]方法制备大鼠坐骨神经损伤模型。大鼠腹腔注射5%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉，俯卧固定。无菌条件下于右后肢作长约2 cm斜切口，钝性分离皮下，沿股后外侧肌间隙钝性分离至腘上缘，显露右侧坐骨神经约2 cm。距梨状肌下缘0.8 cm处切断坐骨神经，在l0倍手术显微镜下以11-0无创尼龙针线缝合，关闭切口。对照组大鼠麻醉后暴露右侧坐骨神经，不作其他处理。
术后对照组于术侧腓肠肌注射生理盐水（100 μL），Ad组、Ad-NGF组和Ad-NGF-MAG组分别注射空腺病毒、Ad-NGF及Ad-NGF-MAG，剂量为1×108 PFU；隔天1次，共注射3次。所有大鼠均正常喂养。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况
术后观察大鼠步态、足趾溃疡发生情况及切口愈合时间。
1.4.2 坐骨神经功能指数（sciatic nerve function index，SFI）检测
1.4.3 神经电生理检测
术后31 d，参照文献[7]方法进行神经电生理检测。分离各组大鼠坐骨神经、腓总神经及胫前肌，于损伤处近端置入3个相距5 mm的刺激电极，由近到远分别标记为S1、S2、S3，刺激时使正极在神经干近端，于胫前肌肌腹中插入2个引导电极和1个接地电极。先在S1、S2处应用不同强度的电流刺激神经，记录刺激脉冲开始时到肌肉动作电位产生所需时间（刺激神经干诱发出动作电位的潜伏期）。同样再在S2、S3进行刺激和测定。按以下公式计算神经传导速度（nerve conductive ve loc ity，NCV），NCV=近端刺激点与远端刺激点的距离/（近端点刺激时诱发电位的潜伏期－远端点刺激时诱发电位的潜伏期）。同时记录诱发电位波幅。
1.4.4 RT-PCR检测NGF和MAG mRNA表达
以上检测完成后，各组大鼠以3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定于解剖台，剪开腹腔、胸腔和右心耳，左心室插管，脉冲灌注泵快速灌入生理盐水，待肝脏变白后用含3%中性甲醛、2%戊二醛的PBS灌注液（pH7.3）200 mL固定，无菌条件下切取坐骨神经吻合处及其远端1 cm组织。采用Trizol提取坐骨神经总RNA，逆转录为cDNA。设计NGF和MAG的扩增引物。引物序列：NGF上游引物：5’-TGTCCCTGAAGCCCACTG-3’，下游引物：5’-TCCTTGCCCTTGATGTCC-3’，扩增片段大小为375 bp；MAG上游引物：5’-GTGGCAGGAACGGAAGTA-3’，下游引物：5’-CATCCCGCATCCAAGTCA-3’，扩增片段大小为382 bp。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳，90 V电压电泳，EB染色，凝胶数字扫描成像系统照相并测定条带积分吸光度（IA）值。
1.4.5 Western blot检测NGF和MAG蛋白表达
取1.4.4获得的各组部分神经标本，按照100 mg神经组织：1 mL细胞裂解液的比例，4℃冰浴匀浆，提取总蛋白，进行蛋白定量。每孔加入40 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，将分离后的蛋白条带转至硝酸纤维膜上，封闭液室温封闭2 h，按1：200分别加入兔抗鼠NGF多克隆抗体、兔抗鼠MAG多克隆抗体和兔抗鼠GAPDH多克隆抗体，37℃孵育2 h，PBST洗膜，按1：400加入二抗，37℃孵育2 h，化学发光试剂反应2 min，发光成像仪成像并测定条带灰度值。
1.4.6 组织学观测
取1.4.4获得的各组部分神经标本置于10%甲醛固定，常规石蜡包埋，纵行连续切片，片厚5 μm。常规HE染色，于镜下观察神经纤维层次、断端神经纤维再生及局部神经纤维髓鞘再生情况，非神经细胞、无髓和有髓神经轴突再生情况。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统，测量神经横切面轴突直径、髓鞘厚度，并行神经纤维计数。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 重组质粒及腺病毒鉴定
2.1.1 pCA13-SV40 promoter-EGFP鉴定
通过XbaⅠ和BamHⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒得到大小为6 926 bp和1 110 bp的产物SV40 promoter与EGFP；通过NheⅠ和BamHⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒得到大小为7 310 bp和726 bp的产物EGFP；通过XbaⅠ和NheⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒得到大小为7 652 bp和384 bp的产物SV40 promoter；酶切结果显示SV40 promoter和EGFP正确构建至pCA13载体。见图 1a。
图1
各质粒酶切鉴定结果 ⓐ pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒酶切鉴定M：Marker 1：XbaⅠ、BamHⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒产物2：NheⅠ、BamHⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒产物3：XbaⅠ、NheⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒产物 ⓑ pCA13-NGF-EGFP质粒酶切鉴定M：Marker 1、2：SalⅠ、EcoRⅠ双酶切pCA13-NGF-EGFP质粒产物 ⓒ PCR扩增大鼠神经组织内MAG基因M：Marker ⓓ 大鼠神经组织内MAG基因测序鉴定 ⓔ pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒酶切鉴定M：Marker 1：ClaⅠ、XbaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒产物 2：SalⅠ、ClaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒产物 3：HindⅢ、ClaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒产物 图 2 HEK293细胞表达绿色荧光（倒置荧光显微镜×100） ⓐ Ad-NGF ⓑ Ad-NGF-MAG
Figure1.
The identification of plasmid by enzyme digestion ⓐ The identification of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Xba Ⅰ and BamH Ⅰ 2: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Nhe Ⅰ and BamH Ⅰ 3: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Xba Ⅰ and Nhe Ⅰ ⓑ The identification of pCA13-NGF-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1, 2: The production of pCA13-NGF-EGFP plasmid by Sal Ⅰ and EcoR Ⅰ ⓒ The amplification of MAG gene in rat nerve tissue by PCR M: Marker ⓓ DNA sequence identification of MAG gene ⓔ The identification of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Cla Ⅰ and Xba Ⅰ 2: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Sal Ⅰ and Cla Ⅰ 3: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Hind Ⅲ and Cla Ⅰ Fig. 2 The expression of EGFP in HEK293 cells (Inverted fluorescence microscope×100) ⓐ Ad-NGF ⓑ Ad-NGF-MAG
2.1.2 pCA13-NGF-EGFP质粒鉴定
通过SalⅠ和EcoRⅠ双酶切pCA13-NGF-EGFP质粒得到大小为8 030 bp和726 bp的产物NGF；酶切结果显示NGF正确构建至pCA13-SV40 promoter-EGFP载体（图 1b）。
2.1.3 大鼠MAG基因鉴定
通过PCR从大鼠神经组织内扩增MAG基因。电泳结果显示得到大小为1 881 bp的条带（图 1c）。将PCR产物回收后进行测序，测序结果表明其为大鼠MAG基因（图 1d）。
2.1.4 pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒鉴定
通过ClaⅠ和XbaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒得到大小为9 359 bp和1 881 bp的产物MAG；通过SalⅠ和ClaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒得到大小为9 910 bp和1 335 bp的产物NGF和IRES；通过HindⅢ和ClaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒得到产物大小为10 893 bp和352 bp的部分IRES（图 1e）；酶切结果显示IRES和MAG正确构建至pCA13-NGF-EGFP载体。
2.1.5 Ad-NGF和Ad-NGF-MAG包装、鉴定、纯化及滴度测定
病毒包装后48 h，倒置荧光显微镜下可见大量绿色荧光，HEK293细胞变圆肿胀、透亮和成团漂浮（图 2）。
RT-PCR及Western blot检测示，Ad-NGF-MAG病毒感染的细胞内检测出MAG mRNA及蛋白表达；Ad-NGF和Ad-NGF-MAG病毒感染的细胞内均能检测NGF mRNA及蛋白表达。见图 3、4。
图3
RT-PCR检测Ad-NGF或Ad-NGF-MAG感染HEK293细胞后MAG和NGF mRNA表达 1：Ad组 2：Ad-NGF组 3：Ad-NGF-MAG组 图 4 Western blot检测Ad-NGF或Ad-NGF-MAG感染HEK293细胞后MAG和NGF蛋白表达 1：Ad组 2：Ad-NGF组 3：Ad-NGF-MAG组 图 5 RT-PCR检测各组NGF和MAG mRNA表达 1：对照组 2：Ad组 3：Ad-NGF组 4：Ad-NGF-MAG组 图 6 Western blot检测各组NGF和MAG蛋白表达1：对照组2：Ad组 3：Ad-NGF组 4：Ad-NGF-MAG组 图 7 各组组织学观察（HE×100） ⓐ 对照组 ⓑ Ad组 ⓒ Ad-NGF组 ⓓ Ad-NGF-MAG组
Figure3.
The mRNA expressions of NGF and MAG in HEK293 cells transfected with Ad-NGF or Ad-NGF-MAG by RT-PCR 1: Ad group 2: Ad-NGF group 3: Ad-NGF-MAG group Fig.4 The protein expressions of NGF and MAG in HEK293 cells transfected with Ad-NGF or Ad-NGF-MAG by Western blot 1: Ad group 2: Ad-NGF group 3: Ad-NGF-MAG group Fig.5 The mRNA expressions of NGF and MAG in each group by RT-PCR 1: Control group 2: Ad group 3: Ad-NGF group 4: Ad-NGF-MAG group Fig.6 The protein expressions of NGF and MAG in each group by Western blot 1: Control group 2: Ad group 3: Ad-NGF group 4: Ad-NGF-MAG group Fig.7 The histological observation of sciatic nerve in each group (HE×100) ⓐ Control group ⓑ Ad group ⓒ Ad-NGF group ⓓ Ad-NGF-MAG group
氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩重组腺病毒Ad-NGF和Ad-NGF-MAG，离心后可见白色病毒层。按Karbers公式计算病毒滴度，Ad-NGF为7.3× 108 PFU/mL，Ad-NGF-MAG为8.56×108 PFU/ mL。
2.2 一般情况
32只大鼠术后均成活，切口Ⅰ期愈合，无感染发生。模型制备后，Ad组、Ad-NGF组和Ad-NGF-MAG组大鼠即出现术侧后肢跛行、脚趾并拢；术后3周开始出现足部皮肤红肿、足跟溃疡等失神经支配表现，损伤神经支配区域肌肉萎缩明显；术后4周Ad-NGF-MAG组大鼠足部皮肤红肿消失，感觉障碍、肌肉萎缩程度较Ad组和Ad-NGF组轻。
2.3 SFI检测
对照组、Ad组、Ad-NGF组、Ad-NGF-MAG组的SFI分别为—9.62±1.86、—49.26±2.93、—34.99±2.15、—28.66±1.91。Ad-NGF-MAG组明显优于Ad组和Ad-NGF组，但未达对照组水平，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.4 神经电生理检测
神经电生理检测显示Ad-NGF-MAG组NCV、诱发电位波幅、潜伏期均明显优于Ad-NGF组和Ad组，但未达对照组水平，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
各组神经电生理检测结果（n=8，2.5 RT-PCR检测NGF与MAG mRNA表达
RT-PCR检测显示，对照组、Ad组、Ad-NGF组、Ad-NGF-MAG组MAG mRNA相对表达量分别为22.02±0.20、18.23±0.12、20.62±0.08、72.82±0.41；NGF mRNA相对表达量分别为19.46±0.16、17.41±0.09、71.32±0.11、74.53±0.53。Ad-NGF-MAG组MAG mRNA相对表达量最高，对照组高于Ad组和Ad-NGF组；Ad-NGF组和Ad-NGF-MAG组NGF mRNA相对表达量均高于对照组和Ad组；组间MAG及NGF mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 5。
2.6 Western blot检测NGF与MAG蛋白表达
Weatern blot检测显示，对照组、Ad组、Ad-NGF组、Ad-NGF-MAG组MAG蛋白相对表达量分别为51.31±0.88、23.25±1.35、25.61±1.10、68.74±1.89；NGF蛋白相对表达量分别为24.57±1.52、22.86±1.44、51.48±1.36、54.15±2.59。Ad-NGF-MAG组MAG蛋白表达最高，对照组高于Ad组和Ad-NGF组；Ad-NGF组和Ad-NGF-MAG组NGF蛋白表达均高于对照组和Ad组；组间MAG及NGF蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 6。
2.7 组织学观测
组织学观察显示，对照组神经连续性好；Ad组神经纤维层次混乱，断端神经纤维再生差，断端神经纤维基本无联系，且局部可见较多炎性细胞浸润，局部神经纤维髓鞘再生不明显；Ad-NGF组神经纤维层次结构清晰，局部断端再生良好，部分神经纤维已经形成联系，神经纤维髓鞘再生良好，未见明显炎性细胞浸润，但神经纤维结构紊乱；Ad-NGF-MAG组神经纤维生长有序，神经直径较Ad-NGF组粗，神经纤维结构良好。见图 7。
Ad-NGF-MAG组神经纤维数、轴突直径、髓鞘厚度均优于Ad组和Ad-NGF组，但尚未达对照组正常水平，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
表2
各组神经纤维计数及轴突直径、髓鞘厚度比较（n=8，3 讨论
周围神经发生截断性损伤后，在损伤远端雪旺细胞释放的多种神经因子诱导下，神经损伤部位会生长出大量神经轴突分支以促进神经纤维再生。由于新生神经轴突分支缺乏正确识别远端雪旺细胞的能力，会向不同的雪旺细胞延伸，导致神经过度支配、神经错误连接，影响神经生理功能恢复。因此，神经轴突分支能否与远端雪旺细胞正确连接，对于神经生理功能恢复至关重要。
MAG选择性定位于雪旺细胞和少突胶质细胞膜，属于免疫球蛋白超家族成员，包括5个细胞外免疫球蛋白样区域、1个胞内区域和1个跨膜区域，其抑制作用的位点是在Ig5区[7]。既往报道主要关注于MAG的体外轴突抑制作用，但DeBellard等[8]认为MAG对不同神经元有不同作用，并且在雪旺细胞与轴突的相互作用以及维持轴突、髓鞘等方面起重要作用。在周围神经系统中，MAG作为一种黏附分子能促进神经细胞迁移，介导胶质细胞、轴突间的交流，在早期主要参与调控轴突生长导向，促进轴突生长，后期则表现为抑制轴突过度生长[9]。MAG通过与神经元及轴突胞膜上表达的NgR受体复合体结合启动抑制信号的跨膜转导[10]，并通过Rho/Rho激酶通路发挥作用[11]，对轴突生长表现为双向调节作用[12]。研究发现，MAG可促进轴突成熟、存活及髓鞘能力[13]，也可抑制轴突过度生长。Tomita等[2]在切断大鼠坐骨神经后局部应用MAG，结果显示其能促进神经功能恢复，而且抑制了轴突的异常分支生长，并非单纯使轴突生长锥塌陷抑制轴突生长。
NGF是神经系统最重要的活性物质之一，对神经系统的发育及促进再生等具有重要作用[14]。NGF可促进神经损伤后再生，但同时也存在新生神经纤维排列紊乱，分支较多，纤维细小，神经生理功能恢复差等问题[15-17]。由此可见，单独使用NGF虽可促进神经纤维组织损伤后再生，但神经纤维功能却恢复不佳；MAG具有双向调节神经生长功能，有利于神经功能恢复[18]。据此本实验探讨了以腺病毒为载体，将NGF和MAG通过腺病毒载体共同导入损伤部位，观察NGF和MAG持续性共同表达在神经损伤修复中的效果。结果显示，与Ad组相比，Ad-NGF组和Ad-NGF-MAG组神经纤维再生明显，但Ad-NGF组新生神经纤维排列紊乱，Ad-NGF-MAG组新生神经纤维排列整齐；神经电生理检测显示Ad-NGF-MAG组NCV和诱发电位波幅均优于Ad-NGF组，表明Ad-NGF-MAG组神经电生理功能恢复优于Ad-NGF组；同时Ad-NGF-MAG组SFI显著优于Ad-NGF组，提示Ad-NGF-MAG组坐骨神经生理功能优于Ad-NGF组。
综上述，在坐骨神经损伤后修复再生过程中，腺病毒介导NGF与MAG共表达，既可促进神经纤维生长，又可抑制神经异常分支形成，共同促进神经结构与功能的恢复，为进一步探讨周围神经损伤后修复奠定了实验基础。
髓磷脂相关糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）是髓磷脂的重要组成部分，是神经轴突再生的强力抑制因子。研究显示，在慢性压缩性神经损伤诱发的神经轴突萌芽中MAG表达下降[1]。体外实验发现，MAG不仅抑制神经轴突生长，也能有效降低周围神经损伤后轴突异常分支形成[2]。NGF可有效促进神经生长，但新生神经组织结构紊乱，神经功能恢复差[3-4]。能否通过NGF与MAG二者协同作用，达到既促进受损神经组织修复，又抑制神经轴突异常增生，从而促进神经组织结构修复和功能重建，目前尚罕见相关报道。本研究拟构建NGF/MAG双基因共表达腺病毒（adenovirus exp res sing NGF and MAG，Ad-NGF-MAG），探讨其在大鼠坐骨神经损伤修复与再生中的作用。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
雄性SD大鼠37只，体质量180～200 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。人HEK293细胞株由重庆医科大学病理生理研究室提供。
5型腺病毒穿梭质粒pCA13、骨架质粒pBHGE3（Microbix Biosystems公司，加拿大）；核酸限制性内切酶XbaⅠ、NheⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ、ClaⅠ以及T4 DNA连接酶（TaKaRa公司，日本）；溶菌酶、氯化铯（Sigma公司，美国）；Taq DNA聚合酶（Promega公司，美国）；丙烯酰胺、N’N’-亚甲基双丙烯酰胺、Tris-base、甘氨酸、SDS（Amresco公司，美国）；琼脂糖凝胶（BIOWEST公司，法国）；Trizol、脂质体LTX and Plus（LIPOFECTAMINETM LTX and Plus Reagent）RNase A、M-MLV Reverse Transcriptase、Ribonuclerase Inhibitor、Lipofectamine2000转染试剂（Invitrogen公司，美国）；TritonX-100（Fluka公司，美国）；Anti-MAG（ab89780）、Anti-NGF（ab6199）一抗（Abcam公司，英国）；anti-β-GAPDH一抗（ProteinTech公司，美国）；DL2000、DL15000、MarkerⅢ、质粒小量提取试剂盒和大量提取试剂盒、DNA快速纯化回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]；山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；EasyPfu DNA Polymerase（北京全式金生物技术有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒[威格拉斯生物技术（北京）有限公司]。
冷冻台式离心机（Hettich公司，德国）；MJ PTC-100型PCR仪（东胜创新生物科技有限公司）；CO2培养箱、Nanodrop 1000型分光光度计（Thermo Scientific公司，美国）；—80℃冰箱（Sanyo公司，日本）；TE2000-U显微镜（Nikon公司，日本）；BX51显微镜（Olympus公司，日本）；JEM1230透射电镜（JEOL公司，日本）；MYTO肌电图仪（Esaote公司，意大利）；HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统（武汉长海科技有限责任公司）；电泳仪（北京市六一仪器厂）。引物合成、测序均由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 构建Ad-NGF-EGFP和Ad-NGF-MAG-EGFP质粒
1.2.1 pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒构建
通过PCR扩增分别得到XbaⅠ-SV40 promoter-NheⅠ和NheⅠ-EGFP-BamHⅠ，用XbaⅠ和NheⅠ双酶切SV40 promoter，用NheⅠ和BamHⅠ双酶切EGFP，并用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切pCA13。将SV40 promoter和EGFP同时连接至pCA13，得到pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒，并酶切鉴定。
1.2.2 pCA13-NGF-EGFP质粒构建
通过PCR扩增得到SalⅠ-NGF-EcoRⅠ，用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切NGF。用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒。将NGF连接至pCA13-SV40 promoter-EGFP，得到pCA13-NGF-EGFP质粒，并酶切鉴定。
1.2.3 大鼠MAG基因扩增
取5只SD大鼠坐骨神经，提取mRNA，逆转录为cDNA，使用高保真Taq酶扩增MAG基因；l%琼脂糖凝胶电泳及基因测序观察。
1.2.4 pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒构建
通过PCR扩增分别得到EcoRⅠ-IRES-ClaⅠ和ClaⅠ-MAG-XbaⅠ，用EcoRⅠ和ClaⅠ双酶切IRES，用ClaⅠ和XbaⅠ双酶切MAG。用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pCA13-NGF-EGFP质粒。将IRES和MAG同时连接至pCA13-NGF-EGFP后，得到pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒，并酶切鉴定。
1.2.5 Ad-NGF及Ad-NGF-MAG包装、鉴定、纯化及滴度测定
将pCA13-NGF-EGFP、pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒及骨架质粒pBHGE3用Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞株扩增，分离获得Ad-NGF及Ad-NGF-MAG，提取病毒DNA，并以其为模板，加入鉴定引物行PCR扩增，将PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析仪上观察。
病毒包装后48 h，倒置荧光显微镜下观察HEK293细胞。然后，收集细胞，提取HEK293细胞mRNA，并以将其逆转录为cDNA，RT-PCR检测NGF和MAG mRNA表达；Western blot检测NGF和MAG蛋白表达。氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩重组腺病毒Ad-NGF和Ad-NGF-MAG，经4℃，60 000×g高速离心6 h后，按Karbers公式计算病毒滴度。
1.3 动物模型建立及分组
取32只SD大鼠，随机分成4组（n=8）：对照组、空病毒组（Ad组）、单独表达NGF组（Ad-NGF组）和共表达NGF和MAG组（Ad-NGF-MAG组）。
Ad组、Ad-NGF组及Ad-NGF-MAG组参考文献[4-5]方法制备大鼠坐骨神经损伤模型。大鼠腹腔注射5%戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉，俯卧固定。无菌条件下于右后肢作长约2 cm斜切口，钝性分离皮下，沿股后外侧肌间隙钝性分离至腘上缘，显露右侧坐骨神经约2 cm。距梨状肌下缘0.8 cm处切断坐骨神经，在l0倍手术显微镜下以11-0无创尼龙针线缝合，关闭切口。对照组大鼠麻醉后暴露右侧坐骨神经，不作其他处理。
术后对照组于术侧腓肠肌注射生理盐水（100 μL），Ad组、Ad-NGF组和Ad-NGF-MAG组分别注射空腺病毒、Ad-NGF及Ad-NGF-MAG，剂量为1×108 PFU；隔天1次，共注射3次。所有大鼠均正常喂养。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况
术后观察大鼠步态、足趾溃疡发生情况及切口愈合时间。
1.4.2 坐骨神经功能指数（sciatic nerve function index，SFI）检测
1.4.3 神经电生理检测
术后31 d，参照文献[7]方法进行神经电生理检测。分离各组大鼠坐骨神经、腓总神经及胫前肌，于损伤处近端置入3个相距5 mm的刺激电极，由近到远分别标记为S1、S2、S3，刺激时使正极在神经干近端，于胫前肌肌腹中插入2个引导电极和1个接地电极。先在S1、S2处应用不同强度的电流刺激神经，记录刺激脉冲开始时到肌肉动作电位产生所需时间（刺激神经干诱发出动作电位的潜伏期）。同样再在S2、S3进行刺激和测定。按以下公式计算神经传导速度（nerve conductive ve loc ity，NCV），NCV=近端刺激点与远端刺激点的距离/（近端点刺激时诱发电位的潜伏期－远端点刺激时诱发电位的潜伏期）。同时记录诱发电位波幅。
1.4.4 RT-PCR检测NGF和MAG mRNA表达
以上检测完成后，各组大鼠以3.5%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定于解剖台，剪开腹腔、胸腔和右心耳，左心室插管，脉冲灌注泵快速灌入生理盐水，待肝脏变白后用含3%中性甲醛、2%戊二醛的PBS灌注液（pH7.3）200 mL固定，无菌条件下切取坐骨神经吻合处及其远端1 cm组织。采用Trizol提取坐骨神经总RNA，逆转录为cDNA。设计NGF和MAG的扩增引物。引物序列：NGF上游引物：5’-TGTCCCTGAAGCCCACTG-3’，下游引物：5’-TCCTTGCCCTTGATGTCC-3’，扩增片段大小为375 bp；MAG上游引物：5’-GTGGCAGGAACGGAAGTA-3’，下游引物：5’-CATCCCGCATCCAAGTCA-3’，扩增片段大小为382 bp。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳，90 V电压电泳，EB染色，凝胶数字扫描成像系统照相并测定条带积分吸光度（IA）值。
1.4.5 Western blot检测NGF和MAG蛋白表达
取1.4.4获得的各组部分神经标本，按照100 mg神经组织：1 mL细胞裂解液的比例，4℃冰浴匀浆，提取总蛋白，进行蛋白定量。每孔加入40 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，将分离后的蛋白条带转至硝酸纤维膜上，封闭液室温封闭2 h，按1：200分别加入兔抗鼠NGF多克隆抗体、兔抗鼠MAG多克隆抗体和兔抗鼠GAPDH多克隆抗体，37℃孵育2 h，PBST洗膜，按1：400加入二抗，37℃孵育2 h，化学发光试剂反应2 min，发光成像仪成像并测定条带灰度值。
1.4.6 组织学观测
取1.4.4获得的各组部分神经标本置于10%甲醛固定，常规石蜡包埋，纵行连续切片，片厚5 μm。常规HE染色，于镜下观察神经纤维层次、断端神经纤维再生及局部神经纤维髓鞘再生情况，非神经细胞、无髓和有髓神经轴突再生情况。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统，测量神经横切面轴突直径、髓鞘厚度，并行神经纤维计数。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 重组质粒及腺病毒鉴定
2.1.1 pCA13-SV40 promoter-EGFP鉴定
通过XbaⅠ和BamHⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒得到大小为6 926 bp和1 110 bp的产物SV40 promoter与EGFP；通过NheⅠ和BamHⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒得到大小为7 310 bp和726 bp的产物EGFP；通过XbaⅠ和NheⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒得到大小为7 652 bp和384 bp的产物SV40 promoter；酶切结果显示SV40 promoter和EGFP正确构建至pCA13载体。见图 1a。
图1
各质粒酶切鉴定结果 ⓐ pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒酶切鉴定M：Marker 1：XbaⅠ、BamHⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒产物2：NheⅠ、BamHⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒产物3：XbaⅠ、NheⅠ双酶切pCA13-SV40 promoter-EGFP质粒产物 ⓑ pCA13-NGF-EGFP质粒酶切鉴定M：Marker 1、2：SalⅠ、EcoRⅠ双酶切pCA13-NGF-EGFP质粒产物 ⓒ PCR扩增大鼠神经组织内MAG基因M：Marker ⓓ 大鼠神经组织内MAG基因测序鉴定 ⓔ pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒酶切鉴定M：Marker 1：ClaⅠ、XbaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒产物 2：SalⅠ、ClaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒产物 3：HindⅢ、ClaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒产物 图 2 HEK293细胞表达绿色荧光（倒置荧光显微镜×100） ⓐ Ad-NGF ⓑ Ad-NGF-MAG
Figure1.
The identification of plasmid by enzyme digestion ⓐ The identification of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Xba Ⅰ and BamH Ⅰ 2: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Nhe Ⅰ and BamH Ⅰ 3: The production of pCA13-SV40 promoter-EGFP plasmid by Xba Ⅰ and Nhe Ⅰ ⓑ The identification of pCA13-NGF-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1, 2: The production of pCA13-NGF-EGFP plasmid by Sal Ⅰ and EcoR Ⅰ ⓒ The amplification of MAG gene in rat nerve tissue by PCR M: Marker ⓓ DNA sequence identification of MAG gene ⓔ The identification of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by enzyme digestion M: Marker 1: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Cla Ⅰ and Xba Ⅰ 2: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Sal Ⅰ and Cla Ⅰ 3: The production of pCA13-NGF-MAG-EGFP plasmid by Hind Ⅲ and Cla Ⅰ Fig. 2 The expression of EGFP in HEK293 cells (Inverted fluorescence microscope×100) ⓐ Ad-NGF ⓑ Ad-NGF-MAG
2.1.2 pCA13-NGF-EGFP质粒鉴定
通过SalⅠ和EcoRⅠ双酶切pCA13-NGF-EGFP质粒得到大小为8 030 bp和726 bp的产物NGF；酶切结果显示NGF正确构建至pCA13-SV40 promoter-EGFP载体（图 1b）。
2.1.3 大鼠MAG基因鉴定
通过PCR从大鼠神经组织内扩增MAG基因。电泳结果显示得到大小为1 881 bp的条带（图 1c）。将PCR产物回收后进行测序，测序结果表明其为大鼠MAG基因（图 1d）。
2.1.4 pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒鉴定
通过ClaⅠ和XbaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒得到大小为9 359 bp和1 881 bp的产物MAG；通过SalⅠ和ClaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒得到大小为9 910 bp和1 335 bp的产物NGF和IRES；通过HindⅢ和ClaⅠ双酶切pCA13-NGF-MAG-EGFP质粒得到产物大小为10 893 bp和352 bp的部分IRES（图 1e）；酶切结果显示IRES和MAG正确构建至pCA13-NGF-EGFP载体。
2.1.5 Ad-NGF和Ad-NGF-MAG包装、鉴定、纯化及滴度测定
病毒包装后48 h，倒置荧光显微镜下可见大量绿色荧光，HEK293细胞变圆肿胀、透亮和成团漂浮（图 2）。
RT-PCR及Western blot检测示，Ad-NGF-MAG病毒感染的细胞内检测出MAG mRNA及蛋白表达；Ad-NGF和Ad-NGF-MAG病毒感染的细胞内均能检测NGF mRNA及蛋白表达。见图 3、4。
图3
RT-PCR检测Ad-NGF或Ad-NGF-MAG感染HEK293细胞后MAG和NGF mRNA表达 1：Ad组 2：Ad-NGF组 3：Ad-NGF-MAG组 图 4 Western blot检测Ad-NGF或Ad-NGF-MAG感染HEK293细胞后MAG和NGF蛋白表达 1：Ad组 2：Ad-NGF组 3：Ad-NGF-MAG组 图 5 RT-PCR检测各组NGF和MAG mRNA表达 1：对照组 2：Ad组 3：Ad-NGF组 4：Ad-NGF-MAG组 图 6 Western blot检测各组NGF和MAG蛋白表达1：对照组2：Ad组 3：Ad-NGF组 4：Ad-NGF-MAG组 图 7 各组组织学观察（HE×100） ⓐ 对照组 ⓑ Ad组 ⓒ Ad-NGF组 ⓓ Ad-NGF-MAG组
Figure3.
The mRNA expressions of NGF and MAG in HEK293 cells transfected with Ad-NGF or Ad-NGF-MAG by RT-PCR 1: Ad group 2: Ad-NGF group 3: Ad-NGF-MAG group Fig.4 The protein expressions of NGF and MAG in HEK293 cells transfected with Ad-NGF or Ad-NGF-MAG by Western blot 1: Ad group 2: Ad-NGF group 3: Ad-NGF-MAG group Fig.5 The mRNA expressions of NGF and MAG in each group by RT-PCR 1: Control group 2: Ad group 3: Ad-NGF group 4: Ad-NGF-MAG group Fig.6 The protein expressions of NGF and MAG in each group by Western blot 1: Control group 2: Ad group 3: Ad-NGF group 4: Ad-NGF-MAG group Fig.7 The histological observation of sciatic nerve in each group (HE×100) ⓐ Control group ⓑ Ad group ⓒ Ad-NGF group ⓓ Ad-NGF-MAG group
氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩重组腺病毒Ad-NGF和Ad-NGF-MAG，离心后可见白色病毒层。按Karbers公式计算病毒滴度，Ad-NGF为7.3× 108 PFU/mL，Ad-NGF-MAG为8.56×108 PFU/ mL。
2.2 一般情况
32只大鼠术后均成活，切口Ⅰ期愈合，无感染发生。模型制备后，Ad组、Ad-NGF组和Ad-NGF-MAG组大鼠即出现术侧后肢跛行、脚趾并拢；术后3周开始出现足部皮肤红肿、足跟溃疡等失神经支配表现，损伤神经支配区域肌肉萎缩明显；术后4周Ad-NGF-MAG组大鼠足部皮肤红肿消失，感觉障碍、肌肉萎缩程度较Ad组和Ad-NGF组轻。
2.3 SFI检测
对照组、Ad组、Ad-NGF组、Ad-NGF-MAG组的SFI分别为—9.62±1.86、—49.26±2.93、—34.99±2.15、—28.66±1.91。Ad-NGF-MAG组明显优于Ad组和Ad-NGF组，但未达对照组水平，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.4 神经电生理检测
神经电生理检测显示Ad-NGF-MAG组NCV、诱发电位波幅、潜伏期均明显优于Ad-NGF组和Ad组，但未达对照组水平，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
各组神经电生理检测结果（n=8，2.5 RT-PCR检测NGF与MAG mRNA表达
RT-PCR检测显示，对照组、Ad组、Ad-NGF组、Ad-NGF-MAG组MAG mRNA相对表达量分别为22.02±0.20、18.23±0.12、20.62±0.08、72.82±0.41；NGF mRNA相对表达量分别为19.46±0.16、17.41±0.09、71.32±0.11、74.53±0.53。Ad-NGF-MAG组MAG mRNA相对表达量最高，对照组高于Ad组和Ad-NGF组；Ad-NGF组和Ad-NGF-MAG组NGF mRNA相对表达量均高于对照组和Ad组；组间MAG及NGF mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 5。
2.6 Western blot检测NGF与MAG蛋白表达
Weatern blot检测显示，对照组、Ad组、Ad-NGF组、Ad-NGF-MAG组MAG蛋白相对表达量分别为51.31±0.88、23.25±1.35、25.61±1.10、68.74±1.89；NGF蛋白相对表达量分别为24.57±1.52、22.86±1.44、51.48±1.36、54.15±2.59。Ad-NGF-MAG组MAG蛋白表达最高，对照组高于Ad组和Ad-NGF组；Ad-NGF组和Ad-NGF-MAG组NGF蛋白表达均高于对照组和Ad组；组间MAG及NGF蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 6。
2.7 组织学观测
组织学观察显示，对照组神经连续性好；Ad组神经纤维层次混乱，断端神经纤维再生差，断端神经纤维基本无联系，且局部可见较多炎性细胞浸润，局部神经纤维髓鞘再生不明显；Ad-NGF组神经纤维层次结构清晰，局部断端再生良好，部分神经纤维已经形成联系，神经纤维髓鞘再生良好，未见明显炎性细胞浸润，但神经纤维结构紊乱；Ad-NGF-MAG组神经纤维生长有序，神经直径较Ad-NGF组粗，神经纤维结构良好。见图 7。
Ad-NGF-MAG组神经纤维数、轴突直径、髓鞘厚度均优于Ad组和Ad-NGF组，但尚未达对照组正常水平，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
表2
各组神经纤维计数及轴突直径、髓鞘厚度比较（n=8，3 讨论
周围神经发生截断性损伤后，在损伤远端雪旺细胞释放的多种神经因子诱导下，神经损伤部位会生长出大量神经轴突分支以促进神经纤维再生。由于新生神经轴突分支缺乏正确识别远端雪旺细胞的能力，会向不同的雪旺细胞延伸，导致神经过度支配、神经错误连接，影响神经生理功能恢复。因此，神经轴突分支能否与远端雪旺细胞正确连接，对于神经生理功能恢复至关重要。
MAG选择性定位于雪旺细胞和少突胶质细胞膜，属于免疫球蛋白超家族成员，包括5个细胞外免疫球蛋白样区域、1个胞内区域和1个跨膜区域，其抑制作用的位点是在Ig5区[7]。既往报道主要关注于MAG的体外轴突抑制作用，但DeBellard等[8]认为MAG对不同神经元有不同作用，并且在雪旺细胞与轴突的相互作用以及维持轴突、髓鞘等方面起重要作用。在周围神经系统中，MAG作为一种黏附分子能促进神经细胞迁移，介导胶质细胞、轴突间的交流，在早期主要参与调控轴突生长导向，促进轴突生长，后期则表现为抑制轴突过度生长[9]。MAG通过与神经元及轴突胞膜上表达的NgR受体复合体结合启动抑制信号的跨膜转导[10]，并通过Rho/Rho激酶通路发挥作用[11]，对轴突生长表现为双向调节作用[12]。研究发现，MAG可促进轴突成熟、存活及髓鞘能力[13]，也可抑制轴突过度生长。Tomita等[2]在切断大鼠坐骨神经后局部应用MAG，结果显示其能促进神经功能恢复，而且抑制了轴突的异常分支生长，并非单纯使轴突生长锥塌陷抑制轴突生长。
NGF是神经系统最重要的活性物质之一，对神经系统的发育及促进再生等具有重要作用[14]。NGF可促进神经损伤后再生，但同时也存在新生神经纤维排列紊乱，分支较多，纤维细小，神经生理功能恢复差等问题[15-17]。由此可见，单独使用NGF虽可促进神经纤维组织损伤后再生，但神经纤维功能却恢复不佳；MAG具有双向调节神经生长功能，有利于神经功能恢复[18]。据此本实验探讨了以腺病毒为载体，将NGF和MAG通过腺病毒载体共同导入损伤部位，观察NGF和MAG持续性共同表达在神经损伤修复中的效果。结果显示，与Ad组相比，Ad-NGF组和Ad-NGF-MAG组神经纤维再生明显，但Ad-NGF组新生神经纤维排列紊乱，Ad-NGF-MAG组新生神经纤维排列整齐；神经电生理检测显示Ad-NGF-MAG组NCV和诱发电位波幅均优于Ad-NGF组，表明Ad-NGF-MAG组神经电生理功能恢复优于Ad-NGF组；同时Ad-NGF-MAG组SFI显著优于Ad-NGF组，提示Ad-NGF-MAG组坐骨神经生理功能优于Ad-NGF组。
综上述，在坐骨神经损伤后修复再生过程中，腺病毒介导NGF与MAG共表达，既可促进神经纤维生长，又可抑制神经异常分支形成，共同促进神经结构与功能的恢复，为进一步探讨周围神经损伤后修复奠定了实验基础。
