引用本文： 徐立, 梁军, 金涛, 周峰. 芒果苷对大鼠急性脊髓损伤的保护作用及相关机制研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(8): 1019-1025. doi: 10.7507/1002-1892.20160205 复制
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是脊柱损伤最严重并发症之一，常导致损伤平面以下肢体功能障碍，严重者甚至会导致瘫痪。目前SCI治疗和康复效果均不理想，成为临床治疗难题[1]。芒果苷是一种四羟基吡酮的碳酮苷，属双苯吡酮类黄酮类化合物[2]。其药理活性广泛，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化以及防止紫外线所致皮肤老化等作用[3]。近年研究发现，芒果苷在脑外伤及脑缺血/再灌注动物模型中能显著减轻脑组织水肿，抗氧化应激反应和抗炎性反应，从而促进神经功能恢复，但相关作用机制仍未明确[4-5]。目前认为氧化应激反应、炎性反应以及神经细胞凋亡在SCI发生、发展过程中具有重要作用，并影响SCI预后。本实验通过建立大鼠SCI模型，给予不同剂量的芒果苷，观察比较损伤脊髓水肿情况以及脊髓氧化应激反应因子、炎性因子以及蛋白活性，凋亡蛋白表达差异，探讨芒果苷对SCI的保护作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年雄性SD大鼠90只，体质量250～300 g，购自上海交通大学实验动物中心。芒果苷（Sigma公司，美国）；一抗大鼠Bax、Bcl-2抗体，DAB显色试剂盒（Santa Cruz公司，美国）；大鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH）、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所）。TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；紫外分光光度计（Bausch & Lomb公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）。
1.2 实验分组及方法
将90只大鼠随机分为5组：假手术组（A组）、SCI组（B组）、10 mg/kg芒果苷处理组（C组）、25 mg/kg芒果苷处理组（D组）、50 mg/kg芒果苷处理组（E组），每组18只。B、C、D、E组参照文献[6]方法制备大鼠SCI模型。具体步骤：大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉后，切除T8～10椎板，暴露T9脊髓。采用Allen法将10 g打击锤固定于脊髓上方6 cm高度（致伤量为60 g/cm），松开打击锤，见大鼠出现摆尾反射，双后肢迟缓性痉挛，为SCI模型制备成功。A组大鼠同法麻醉后，仅切除T8～10椎板，不作其他处理。C、D、E组于术后30 min分别按照10、25、50 mg/kg剂量腹腔注射芒果苷，之后每日注射1次，共注射30 d；A、B组于对应时间点注射等量生理盐水。术后大鼠单笼饲养，防止感染。于术后72 h及30 d，各组分别取9只大鼠同上法麻醉后，取损伤节段脊髓组织进行观测。
1.3 观测指标
1.3.1 后肢运动功能评分
观察各组大鼠术后存活以及切口愈合情况。术后24、48、72 h采用BBB评分[7]评价各组大鼠后肢运动功能，包括大鼠后肢各关节活动、后肢步态和协调功能、运动时爪子的精细运动；总分为0分表示完全瘫痪，21分为完全正常活动。取每只大鼠左、右侧肢体评分均值作为最终评分。
1.3.2 脊髓水含量测定
术后72 h取各组脊髓长约10 mm，迅速称重（湿重）后将其放入80℃烘箱中72 h，再次称重（干重）。按照以下公式计算脊髓水含量：(湿重－干重)/湿重×100%。
1.3.3 ELISA检测
术后72 h取各组脊髓组织，标准稀释液进行稀释，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，加终止液后混匀，酶标仪进行检测，测量脊髓组织中氧化应激反应因子MDA、CAT、SOD、GSH以及炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性。术后30 d，取各组脊髓组织，同上法测量Caspase-3、9活性。
1.3.4 Western blot检测
术后30 d取各组脊髓组织，充分研磨，蛋白裂解液充分裂解后，以10 000×g离心30 min，BCA法测定总蛋白浓度。行电泳、转膜、封闭，Bax、Bcl-2一抗孵育过夜，二抗1∶10 000孵育5 h，加入显色剂显色，以GAPDH作为内参。凝胶成像系统成像，Image J软件测算蛋白灰度值，计算目的蛋白与GAPDH灰度值的比值作为其相对表达量。
1.3.5 组织学及免疫组织化学染色观测
术后30 d取各组脊髓组织，置于10%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，从损伤脊髓中心部位连续切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，倒置相差显微镜下观察脊髓组织和神经元细胞形态学改变。其余切片行Cas pase-3免疫组织化学染色，倒置相差显微镜下观察，Cas pase-3阳性细胞呈黄染。每张切片随机取3个视野，利用Image Pro-Plus 6.0软件检测吸光度（A）值，作为Caspase-3蛋白表达量。
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 后肢运动功能评分
术后各组大鼠均顺利存活至实验完成，切口无红肿等感染表现。术后各时间点，A组BBB评分均显著高于B、C、D、E组，B、C、D、E组评分呈逐渐增高趋势，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 1。
图1
术后各时间点各组大鼠后肢运动功能BBB评分 图 2 ELISA检测术后72 h各组脊髓组织中氧化应激反应因子以及炎性因子活性 ⓐ MDA ⓑ CAT ⓒ SOD ⓓ GSH ⓔ NF-κB ⓕ TNF-α ⓖ IL-1β ⓗ IL-6 图 3 ELISA检测术后30 d各组脊髓组织中Caspase-3、9活性 ⓐ Caspase-3 ⓑ Caspase-9 图 4 Western blot检测术后30 d各组Bax、Bcl-2蛋白表达 ⓐ 蛋白条带图 1：A组2：B组3：C组4：D组5：E组 ⓑ 蛋白相对表达量比较
Figure1.
BBB scores for evaluating neurological function at different time points Fig. 2 The activities of oxidative stress factors and inflammatory factors in the spinal cord by ELISA at 72 hours after SCI ⓐ MDA ⓑ CAT ⓒ SOD ⓓ GSH ⓔ NF-κB ⓕ TNF-α ⓖ IL-1β ⓗ IL-6 Fig. 3 The activities of Caspase-3 and Caspase-9 in the spinal cord by ELISA at 30 days after SCI ⓐ Caspase-3 ⓑ Caspase-9 Fig. 4 The relative expressions of Bax and Bcl-2 proteins in the spinal cord by Western blot at 30 days after SCI ⓐ Protein bands 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E ⓑ Expressions of Bax and Bcl-2 proteins
2.2 脊髓水含量测定
术后72 h，A、B、C、D、E组脊髓水含量分别为76.21%±7.49%、87.59%±7.93%、83.16%±7.55%、81.98%±7.61%、79.27%±7.38%。B、C、D、E组水含量均显著高于A组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。而B、C、D、E组水含量呈逐渐降低趋势，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.3 ELISA检测
2.3.1 氧化应激反应因子
术后72 h，B、C、D、E组MDA活性均显著高于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组MDA活性呈逐渐降低趋势，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。B、C、D、E组CAT、SOD、GSH活性均显著低于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组以上因子活性均呈逐渐增高趋势，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2a～d。
2.3.2 炎性因子
术后72 h，B、C、D、E组NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性均显著高于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组以上因子活性均呈逐渐降低趋势，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2e～h。
2.3.3 Caspase-3、9
术后30 d，B、C、D、E组Cas pase-3、9活性均显著高于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组Caspase-3、9活性均呈逐渐降低趋势，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 3。
2.4 Western blot检测
术后30 d，B、C、D、E组Bax蛋白表达均显著高于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组表达呈逐渐降低趋势，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。B、C、D、E组Bcl-2蛋白表达均显著低于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组表达呈逐渐增高趋势，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 4。
2.5 组织学观察
镜下观察，A组脊髓组织形态正常；B组神经元细胞肿胀坏死，严重脱髓鞘样改变，并出现较多炎性细胞浸润；C组神经元细胞肿胀，坏死细胞较B组减少，可见细胞脱髓鞘样改变，炎性细胞浸润减少；D组可见正常神经元细胞，坏死细胞及脱髓鞘样改变显著减少，少量炎性细胞浸润，较C组显著好转；E组可见脊髓组织趋于正常，神经元细胞形态明显较D组好转，未见明显脱髓鞘样改变，炎性细胞显著减少。见图 5。
图5
术后30 d各组HE染色观察（×40） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 ⓔ E组 图 6 术后30 d各组Caspase-3免疫组织化学染色（×40） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 ⓔ E组
Figure5.
Morphology observation of the spinal cord by HE staining at 30 days after SCI (×40) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C ⓓ Group D ⓔ Group E Fig. 6 Immunohistochemistry staining of Caspase-3 in the spinal cord at 30 days after SCI (×40) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C ⓓ Group D ⓔ Group E
2.6 免疫组织化学染色观察
镜下观察，各组Caspase-3蛋白均表达于脊髓实质以及神经细胞，A组为正常脊髓，少量Caspase-3阳性细胞，B组可见大量Caspase-3阳性细胞，C、D、E组Caspase-3阳性细胞依次减少（图 6）。A、B、C、D、E组Caspase-3蛋白表达量分别为14.15±2.76、95.24±10.36、82.65±9.42、73.12±10.11、59.45±9.41；B、C、D、E组Caspase-3蛋白表达量均显著高于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组表达量呈逐渐降低趋势，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。
3 讨论
国内外学者对SCI的病理生理机制进行了广泛的探讨和研究，认识到SCI在原发损伤的基础上可能会发展一系列的进行性病理性改变，而这种继发性损伤的病理改变将会加重SCI，甚至造成脊髓的不可逆性伤害[8]。继发性水肿是SCI继发性损伤的重要方面，其病理机制主要是由损伤后水肿的发展激发一系列分子和细胞机制，进而引发炎性反应等，最终引起细胞的凋亡和坏死[9]。椎管内脊髓水肿的发生会加重神经压迫，导致脊髓神经缺血、缺氧，甚至引起神经细胞的变性和坏死。本实验通过Allen法构建大鼠SCI模型，发现SCI大鼠脊髓水含量明显提高，而经腹腔注射芒果苷后，水含量得到抑制，水肿情况明显好转，并且低、中、高浓度组水肿抑制效果逐渐增强（P < 0.05），存在剂量依赖关系。说明芒果苷在SCI早期能通过抑制脊髓水肿发挥神经保护作用。
SCI后继发氧化应激反应是引起脊髓组织损伤的重要因素之一[10]。神经损伤后可产生并释放大量氧自由基[11]，而脊髓神经元的细胞膜结构中富含脂质，产生的性质极不稳定的氧自由基，能攻击细胞膜中的不饱和脂肪酸，从而引发脂质过氧化反应，破坏细胞膜结构的完整性和通透性，最终导致细胞变性、凋亡和坏死。MDA是脂质氧化的最终产物，因此MDA活性可直接反映体内氧自由基产生和释放水平，间接反映细胞受自由基攻击的程度[12]。SOD是细胞内主要的抗氧化酶，也是细胞内主要的自由基清除剂，可保护细胞对抗氧自由基对机体的损害，SOD水平可反映内源性氧自由基清除系统功能[13]。CAT是一种酶类清除剂，存在于细胞的过氧化物体内。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的H2O2，从而使细胞免于遭受H2O2的损害，是过氧化物酶体的标志酶，是生物防御体系的关键酶之一。GSH也是机体内一种重要的抗氧化酶，可催化H2O2分解，其表达水平可间接反映机体清除氧自由基的能力。Kalayci等[14]研究发现SCI后脊髓组织内MDA水平明显上升，SOD、GSH、CAT活性则明显下降。本实验发现，与A组正常脊髓组织相比，SCI后氧化应激反应因子MDA水平提高，而CAT、SOD、GSH活性明显下调，而芒果苷可明显逆转这些氧化应激反应因子的表达，并且低、中、高浓度组氧化应激反应抑制效果逐渐增强（P < 0.05），呈现剂量依赖关系，与Kalayci等[14]的实验研究结果一致。说明芒果苷能抑制SCI后脂质过氧化，增加活性氧的清除，从而发挥神经保护作用。
NF-κB家族作为早期转录因子，是调控炎性反应的重要环节。NF-κB可迅速对有害细胞的刺激做出反应，参与炎性反应，很多炎性因子受NF-κB的调控，包括本实验研究的TNF-α、IL-1β、IL-6[15]。此外，NF-κB也可以被炎性因子、生长因子或趋化因子等激活。常见的炎性因子如IL-1β和TNF-α等，都能激活转录因子NF-κB[16]。本实验发现，B组中NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6表达较A组明显提高（P < 0.05），加重了脊髓的损伤程度；当加入芒果苷治疗后，NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性得到有效抑制（P < 0.05）。提示芒果苷可抑制SCI后炎性反应，从而发挥神经保护作用。
Caspase-3、9是Caspase家族中2种重要的凋亡蛋白，控制着细胞凋亡启动，被称为凋亡的“分子开关”[17-18]。因此，Caspase-3、9蛋白表达水平从某种程度上可反映SCI部位的细胞凋亡情况。本实验发现，与A组相比，B组SCI后Caspase-3、9蛋白活性及其蛋白表达明显提高（P < 0.05），而芒果苷可明显抑制Caspase-3、9蛋白活性（P < 0.05），并且低、中、高浓度组抑制效果逐渐增强（P < 0.05），呈剂量依赖关系，从而发挥抗凋亡作用。
神经细胞的凋亡和坏死是SCI最严重继发性损伤。继发性细胞凋亡主要是神经元及神经胶质细胞发生的程序性死亡，常见于脊髓缺血或挤压伤。Bax蛋白存在于胞质线粒体内，SCI刺激可激活Bax蛋白，使线粒体膜通透性改变，从而诱发神经细胞凋亡[19]。去除Bax基因的小鼠制备SCI模型后，少突胶质细胞凋亡情况明显下降[20]。而Bcl-2是一种细胞质蛋白，在神经细胞中表达水平较高，并且随着神经系统的逐渐完善，其表达水平维持在较低水平。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，可抑制SCI后各种途径引起的细胞凋亡[21]。此外，Bcl-2是一种可诱导基因，可通过转基因方式使动物高表达Bcl-2，从而减轻脊髓神经损伤，提高脊髓组织抗凋亡的能力，有效阻止神经细胞凋亡，促进损伤中枢神经系统组织修复[22]。Fan等[23]的实验证明Bcl-2与Bax的表达直接影响脊髓神经细胞凋亡，且凋亡程度与Bcl-2/Bax成正相关。本实验中与A组相比，B组SCI模型凋亡蛋白Bax表达水平提高，而Bcl-2表达明显下调（P < 0.05），而芒果苷可明显逆转这些凋亡的表达，并且低、中、高浓度组Bax和Bcl-2逆转效果逐渐增强（P < 0.05），呈现剂量依赖关系。说明芒果苷在SCI后可抑制细胞的凋亡来发挥其神经保护作用。
综上述，芒果苷可抑制大鼠SCI早期发生的脊髓水肿情况，并通过逆转氧化应激反应，下调炎性反应进程，以及通过上调Bcl-2表达和抑制Bax表达抗细胞凋亡，从而发挥神经保护的作用。
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是脊柱损伤最严重并发症之一，常导致损伤平面以下肢体功能障碍，严重者甚至会导致瘫痪。目前SCI治疗和康复效果均不理想，成为临床治疗难题[1]。芒果苷是一种四羟基吡酮的碳酮苷，属双苯吡酮类黄酮类化合物[2]。其药理活性广泛，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化以及防止紫外线所致皮肤老化等作用[3]。近年研究发现，芒果苷在脑外伤及脑缺血/再灌注动物模型中能显著减轻脑组织水肿，抗氧化应激反应和抗炎性反应，从而促进神经功能恢复，但相关作用机制仍未明确[4-5]。目前认为氧化应激反应、炎性反应以及神经细胞凋亡在SCI发生、发展过程中具有重要作用，并影响SCI预后。本实验通过建立大鼠SCI模型，给予不同剂量的芒果苷，观察比较损伤脊髓水肿情况以及脊髓氧化应激反应因子、炎性因子以及蛋白活性，凋亡蛋白表达差异，探讨芒果苷对SCI的保护作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年雄性SD大鼠90只，体质量250～300 g，购自上海交通大学实验动物中心。芒果苷（Sigma公司，美国）；一抗大鼠Bax、Bcl-2抗体，DAB显色试剂盒（Santa Cruz公司，美国）；大鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH）、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所）。TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；紫外分光光度计（Bausch & Lomb公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）。
1.2 实验分组及方法
将90只大鼠随机分为5组：假手术组（A组）、SCI组（B组）、10 mg/kg芒果苷处理组（C组）、25 mg/kg芒果苷处理组（D组）、50 mg/kg芒果苷处理组（E组），每组18只。B、C、D、E组参照文献[6]方法制备大鼠SCI模型。具体步骤：大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥钠麻醉后，切除T8～10椎板，暴露T9脊髓。采用Allen法将10 g打击锤固定于脊髓上方6 cm高度（致伤量为60 g/cm），松开打击锤，见大鼠出现摆尾反射，双后肢迟缓性痉挛，为SCI模型制备成功。A组大鼠同法麻醉后，仅切除T8～10椎板，不作其他处理。C、D、E组于术后30 min分别按照10、25、50 mg/kg剂量腹腔注射芒果苷，之后每日注射1次，共注射30 d；A、B组于对应时间点注射等量生理盐水。术后大鼠单笼饲养，防止感染。于术后72 h及30 d，各组分别取9只大鼠同上法麻醉后，取损伤节段脊髓组织进行观测。
1.3 观测指标
1.3.1 后肢运动功能评分
观察各组大鼠术后存活以及切口愈合情况。术后24、48、72 h采用BBB评分[7]评价各组大鼠后肢运动功能，包括大鼠后肢各关节活动、后肢步态和协调功能、运动时爪子的精细运动；总分为0分表示完全瘫痪，21分为完全正常活动。取每只大鼠左、右侧肢体评分均值作为最终评分。
1.3.2 脊髓水含量测定
术后72 h取各组脊髓长约10 mm，迅速称重（湿重）后将其放入80℃烘箱中72 h，再次称重（干重）。按照以下公式计算脊髓水含量：(湿重－干重)/湿重×100%。
1.3.3 ELISA检测
术后72 h取各组脊髓组织，标准稀释液进行稀释，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，加终止液后混匀，酶标仪进行检测，测量脊髓组织中氧化应激反应因子MDA、CAT、SOD、GSH以及炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性。术后30 d，取各组脊髓组织，同上法测量Caspase-3、9活性。
1.3.4 Western blot检测
术后30 d取各组脊髓组织，充分研磨，蛋白裂解液充分裂解后，以10 000×g离心30 min，BCA法测定总蛋白浓度。行电泳、转膜、封闭，Bax、Bcl-2一抗孵育过夜，二抗1∶10 000孵育5 h，加入显色剂显色，以GAPDH作为内参。凝胶成像系统成像，Image J软件测算蛋白灰度值，计算目的蛋白与GAPDH灰度值的比值作为其相对表达量。
1.3.5 组织学及免疫组织化学染色观测
术后30 d取各组脊髓组织，置于10%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，从损伤脊髓中心部位连续切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，倒置相差显微镜下观察脊髓组织和神经元细胞形态学改变。其余切片行Cas pase-3免疫组织化学染色，倒置相差显微镜下观察，Cas pase-3阳性细胞呈黄染。每张切片随机取3个视野，利用Image Pro-Plus 6.0软件检测吸光度（A）值，作为Caspase-3蛋白表达量。
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 后肢运动功能评分
术后各组大鼠均顺利存活至实验完成，切口无红肿等感染表现。术后各时间点，A组BBB评分均显著高于B、C、D、E组，B、C、D、E组评分呈逐渐增高趋势，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 1。
图1
术后各时间点各组大鼠后肢运动功能BBB评分 图 2 ELISA检测术后72 h各组脊髓组织中氧化应激反应因子以及炎性因子活性 ⓐ MDA ⓑ CAT ⓒ SOD ⓓ GSH ⓔ NF-κB ⓕ TNF-α ⓖ IL-1β ⓗ IL-6 图 3 ELISA检测术后30 d各组脊髓组织中Caspase-3、9活性 ⓐ Caspase-3 ⓑ Caspase-9 图 4 Western blot检测术后30 d各组Bax、Bcl-2蛋白表达 ⓐ 蛋白条带图 1：A组2：B组3：C组4：D组5：E组 ⓑ 蛋白相对表达量比较
Figure1.
BBB scores for evaluating neurological function at different time points Fig. 2 The activities of oxidative stress factors and inflammatory factors in the spinal cord by ELISA at 72 hours after SCI ⓐ MDA ⓑ CAT ⓒ SOD ⓓ GSH ⓔ NF-κB ⓕ TNF-α ⓖ IL-1β ⓗ IL-6 Fig. 3 The activities of Caspase-3 and Caspase-9 in the spinal cord by ELISA at 30 days after SCI ⓐ Caspase-3 ⓑ Caspase-9 Fig. 4 The relative expressions of Bax and Bcl-2 proteins in the spinal cord by Western blot at 30 days after SCI ⓐ Protein bands 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E ⓑ Expressions of Bax and Bcl-2 proteins
2.2 脊髓水含量测定
术后72 h，A、B、C、D、E组脊髓水含量分别为76.21%±7.49%、87.59%±7.93%、83.16%±7.55%、81.98%±7.61%、79.27%±7.38%。B、C、D、E组水含量均显著高于A组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。而B、C、D、E组水含量呈逐渐降低趋势，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。
2.3 ELISA检测
2.3.1 氧化应激反应因子
术后72 h，B、C、D、E组MDA活性均显著高于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组MDA活性呈逐渐降低趋势，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。B、C、D、E组CAT、SOD、GSH活性均显著低于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组以上因子活性均呈逐渐增高趋势，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2a～d。
2.3.2 炎性因子
术后72 h，B、C、D、E组NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性均显著高于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组以上因子活性均呈逐渐降低趋势，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 2e～h。
2.3.3 Caspase-3、9
术后30 d，B、C、D、E组Cas pase-3、9活性均显著高于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组Caspase-3、9活性均呈逐渐降低趋势，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 3。
2.4 Western blot检测
术后30 d，B、C、D、E组Bax蛋白表达均显著高于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组表达呈逐渐降低趋势，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。B、C、D、E组Bcl-2蛋白表达均显著低于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组表达呈逐渐增高趋势，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 4。
2.5 组织学观察
镜下观察，A组脊髓组织形态正常；B组神经元细胞肿胀坏死，严重脱髓鞘样改变，并出现较多炎性细胞浸润；C组神经元细胞肿胀，坏死细胞较B组减少，可见细胞脱髓鞘样改变，炎性细胞浸润减少；D组可见正常神经元细胞，坏死细胞及脱髓鞘样改变显著减少，少量炎性细胞浸润，较C组显著好转；E组可见脊髓组织趋于正常，神经元细胞形态明显较D组好转，未见明显脱髓鞘样改变，炎性细胞显著减少。见图 5。
图5
术后30 d各组HE染色观察（×40） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 ⓔ E组 图 6 术后30 d各组Caspase-3免疫组织化学染色（×40） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 ⓔ E组
Figure5.
Morphology observation of the spinal cord by HE staining at 30 days after SCI (×40) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C ⓓ Group D ⓔ Group E Fig. 6 Immunohistochemistry staining of Caspase-3 in the spinal cord at 30 days after SCI (×40) ⓐ Group A ⓑ Group B ⓒ Group C ⓓ Group D ⓔ Group E
2.6 免疫组织化学染色观察
镜下观察，各组Caspase-3蛋白均表达于脊髓实质以及神经细胞，A组为正常脊髓，少量Caspase-3阳性细胞，B组可见大量Caspase-3阳性细胞，C、D、E组Caspase-3阳性细胞依次减少（图 6）。A、B、C、D、E组Caspase-3蛋白表达量分别为14.15±2.76、95.24±10.36、82.65±9.42、73.12±10.11、59.45±9.41；B、C、D、E组Caspase-3蛋白表达量均显著高于A组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C、D、E组表达量呈逐渐降低趋势，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。
3 讨论
国内外学者对SCI的病理生理机制进行了广泛的探讨和研究，认识到SCI在原发损伤的基础上可能会发展一系列的进行性病理性改变，而这种继发性损伤的病理改变将会加重SCI，甚至造成脊髓的不可逆性伤害[8]。继发性水肿是SCI继发性损伤的重要方面，其病理机制主要是由损伤后水肿的发展激发一系列分子和细胞机制，进而引发炎性反应等，最终引起细胞的凋亡和坏死[9]。椎管内脊髓水肿的发生会加重神经压迫，导致脊髓神经缺血、缺氧，甚至引起神经细胞的变性和坏死。本实验通过Allen法构建大鼠SCI模型，发现SCI大鼠脊髓水含量明显提高，而经腹腔注射芒果苷后，水含量得到抑制，水肿情况明显好转，并且低、中、高浓度组水肿抑制效果逐渐增强（P < 0.05），存在剂量依赖关系。说明芒果苷在SCI早期能通过抑制脊髓水肿发挥神经保护作用。
SCI后继发氧化应激反应是引起脊髓组织损伤的重要因素之一[10]。神经损伤后可产生并释放大量氧自由基[11]，而脊髓神经元的细胞膜结构中富含脂质，产生的性质极不稳定的氧自由基，能攻击细胞膜中的不饱和脂肪酸，从而引发脂质过氧化反应，破坏细胞膜结构的完整性和通透性，最终导致细胞变性、凋亡和坏死。MDA是脂质氧化的最终产物，因此MDA活性可直接反映体内氧自由基产生和释放水平，间接反映细胞受自由基攻击的程度[12]。SOD是细胞内主要的抗氧化酶，也是细胞内主要的自由基清除剂，可保护细胞对抗氧自由基对机体的损害，SOD水平可反映内源性氧自由基清除系统功能[13]。CAT是一种酶类清除剂，存在于细胞的过氧化物体内。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的H2O2，从而使细胞免于遭受H2O2的损害，是过氧化物酶体的标志酶，是生物防御体系的关键酶之一。GSH也是机体内一种重要的抗氧化酶，可催化H2O2分解，其表达水平可间接反映机体清除氧自由基的能力。Kalayci等[14]研究发现SCI后脊髓组织内MDA水平明显上升，SOD、GSH、CAT活性则明显下降。本实验发现，与A组正常脊髓组织相比，SCI后氧化应激反应因子MDA水平提高，而CAT、SOD、GSH活性明显下调，而芒果苷可明显逆转这些氧化应激反应因子的表达，并且低、中、高浓度组氧化应激反应抑制效果逐渐增强（P < 0.05），呈现剂量依赖关系，与Kalayci等[14]的实验研究结果一致。说明芒果苷能抑制SCI后脂质过氧化，增加活性氧的清除，从而发挥神经保护作用。
NF-κB家族作为早期转录因子，是调控炎性反应的重要环节。NF-κB可迅速对有害细胞的刺激做出反应，参与炎性反应，很多炎性因子受NF-κB的调控，包括本实验研究的TNF-α、IL-1β、IL-6[15]。此外，NF-κB也可以被炎性因子、生长因子或趋化因子等激活。常见的炎性因子如IL-1β和TNF-α等，都能激活转录因子NF-κB[16]。本实验发现，B组中NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6表达较A组明显提高（P < 0.05），加重了脊髓的损伤程度；当加入芒果苷治疗后，NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性得到有效抑制（P < 0.05）。提示芒果苷可抑制SCI后炎性反应，从而发挥神经保护作用。
Caspase-3、9是Caspase家族中2种重要的凋亡蛋白，控制着细胞凋亡启动，被称为凋亡的“分子开关”[17-18]。因此，Caspase-3、9蛋白表达水平从某种程度上可反映SCI部位的细胞凋亡情况。本实验发现，与A组相比，B组SCI后Caspase-3、9蛋白活性及其蛋白表达明显提高（P < 0.05），而芒果苷可明显抑制Caspase-3、9蛋白活性（P < 0.05），并且低、中、高浓度组抑制效果逐渐增强（P < 0.05），呈剂量依赖关系，从而发挥抗凋亡作用。
神经细胞的凋亡和坏死是SCI最严重继发性损伤。继发性细胞凋亡主要是神经元及神经胶质细胞发生的程序性死亡，常见于脊髓缺血或挤压伤。Bax蛋白存在于胞质线粒体内，SCI刺激可激活Bax蛋白，使线粒体膜通透性改变，从而诱发神经细胞凋亡[19]。去除Bax基因的小鼠制备SCI模型后，少突胶质细胞凋亡情况明显下降[20]。而Bcl-2是一种细胞质蛋白，在神经细胞中表达水平较高，并且随着神经系统的逐渐完善，其表达水平维持在较低水平。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，可抑制SCI后各种途径引起的细胞凋亡[21]。此外，Bcl-2是一种可诱导基因，可通过转基因方式使动物高表达Bcl-2，从而减轻脊髓神经损伤，提高脊髓组织抗凋亡的能力，有效阻止神经细胞凋亡，促进损伤中枢神经系统组织修复[22]。Fan等[23]的实验证明Bcl-2与Bax的表达直接影响脊髓神经细胞凋亡，且凋亡程度与Bcl-2/Bax成正相关。本实验中与A组相比，B组SCI模型凋亡蛋白Bax表达水平提高，而Bcl-2表达明显下调（P < 0.05），而芒果苷可明显逆转这些凋亡的表达，并且低、中、高浓度组Bax和Bcl-2逆转效果逐渐增强（P < 0.05），呈现剂量依赖关系。说明芒果苷在SCI后可抑制细胞的凋亡来发挥其神经保护作用。
综上述，芒果苷可抑制大鼠SCI早期发生的脊髓水肿情况，并通过逆转氧化应激反应，下调炎性反应进程，以及通过上调Bcl-2表达和抑制Bax表达抗细胞凋亡，从而发挥神经保护的作用。
