引用本文： 王曦, 黄云超, 周永春, 刘德权, 吕志勇, 叶联华, 陈颖, 杨加鹏, 成鹏, 王正玺. 雌二醇对乳腺癌假体植入术后表皮葡萄球菌生物膜形成的影响研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(7): 876-884. doi: 10.7507/1002-1892.20160178 复制
包膜挛缩是乳房假体植入术后最严重的并发症，该并发症发生与表皮葡萄球菌感染关系密切。细菌在假体表面形成生物膜，持续的亚临床感染造成纤维包膜形成，随着纤维包膜变厚、变硬、收缩，最终改变乳房轮廓，导致严重疼痛[1-3]；生物膜作为细菌屏障还增加了治疗难度。作为激素依赖型肿瘤，体内雌激素水平增高是乳腺癌发病的重要原因之一，如果机体雌二醇水平长期维持在103 pmol/L以上，发生乳腺癌几率也随之增高[4]。此外雌激素对细菌的正调控已得到证实，特别在致病菌生物膜形成方面[5-11]。但对于长期具有高水平雌二醇的乳腺癌患者，表皮葡萄球菌生长和生物膜的形成特点尚未明确。因此，本研究通过体外实验探讨雌二醇对表皮葡萄球菌生长和生物膜形成能力的影响，以期为临床预防假体表面细菌生物膜的形成提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验菌株及主要试剂、仪器
表皮葡萄球菌标准株ATCC35984（生物膜表型阳性）购自美国典型菌种保藏中心，表皮葡萄球菌标准株ATCC12228（生物膜表型阴性）购自中国科学院微生物研究所。一次性硅胶扩张器（广州万和整形材料有限公司）。
雌二醇（Sigma公司，美国）；活/死细菌荧光染色剂（Life公司，美国）；结晶紫、DMSO、溶菌肉汤（lysogeny broth，LB）培养基（北京索莱宝科技有限公司）；XTT细菌增殖及细菌毒性检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基（广东环凯微生物科技有限公司）。
S-30000N扫描电镜（Hitachi公司，日本）；激光共聚焦显微镜（Olympus公司，日本）；紫外分光光度计（Bio-Rad公司，美国）；全波段多功能酶标仪（Thermo公司，美国）。
1.2 细菌悬液实验浓度选择
1.2.1 细菌悬液制备
常规复苏冻存的ATCC35984菌株，接种至LB琼脂平板，于37℃培养24 h。挑取单个菌落转移至TSB培养基中，置于恒温振荡器，以37℃、250 r/min培养16～18 h，使细菌细胞生长至对数生长期，调整细菌悬液浓度为1×107 CFU/mL或1×108 CFU/mL，备用。
1.2.2 雌二醇悬液制备
取0.027 2 g雌二醇置于无水乙醇中溶解，然后加入蒸馏水制成浓度为1×10-2 mol/L的雌二醇原液，避光置于— 20℃备用。实验前取雌二醇原液，利用TSB培养基稀释，制备终浓度为125 pmol/L的雌二醇悬液。
1.2.3 硅胶材料表面细菌生物膜体外模型制备
取一次性硅胶扩张器制成大小为1 cm×1 cm的方形硅胶片，环氧乙烷熏蒸灭菌后备用。取24孔板，每孔加入浓度为1×107 CFU/mL或1×108 CFU/mL的细菌悬液400μL、125 pmol/L雌二醇悬液40μL以及1片硅胶片。置于37°C恒温箱培养，于培养后4、6、12、24、48、72 h进行观测。
1.2.4 观测指标
①结晶紫染色半定量检测硅胶材料表面细菌生物膜形成能力：各时间点两浓度组各取6孔硅胶片，PBS清洗、风干后加入2%结晶紫100 μL染色30 min；取出硅胶片漂洗、风干，加入DMSO脱色15 min；各孔取100μL脱色液至96孔板，用酶标仪测定波长490 nm处吸光度（A）值，以单纯TSB培养基作为空白对照。各孔测量A值与空白对照A值的差值作为生物膜厚度，表示细菌生物膜形成能力，差值> 0.12为生物膜形成阳性。
②XTT法检测硅胶材料表面细菌生长动力：各时间点两浓度组各取6孔硅胶片，PBS清洗、风干后加入100μL TSB培养基和20μL XTT溶液，37℃避光孵育2 h。以添加LB培养基和XTT溶液的无细菌混合液作为空白对照。采用酶标仪测定波长450 nm处A值，以各孔测量A值与空白对照A值的差值表示细菌生长动力。
根据硅胶材料表面细菌生物膜形成能力及细菌生长动力检测结果，选择细菌悬液实验浓度。
1.3 实验分组及方法
参照1.2.2方法制备终浓度为50、125、250、500 pmol/L的雌二醇悬液。取实验浓度ATCC35984菌株悬液以及以上终浓度雌二醇悬液，参照1.2.3方法分别制备硅胶材料表面生物膜体外模型；并以未添加雌二醇悬液（0 pmol/L）作为对照。另取实验浓度ATCC12228菌株悬液同法制备模型，作为阴性对照。
1.4 观测指标
1.4.1 XTT法检测硅胶材料表面细菌生长动力
于培养后4、6、12、24、48、72 h，各组取6孔硅胶片，同1.2.4方法进行检测。
1.4.2 结晶紫染色半定量检测硅胶材料表面细菌生物膜形成能力
于培养后4、6、12、24、48、72 h，各组取6孔硅胶片，同1.2.4方法进行检测。
1.4.3 激光共聚焦显微镜观察硅胶材料表面细菌生物膜厚度
于培养后6、12、24 h，各组取6孔硅胶片，洗去浮游菌，加入荧光染色剂，常温下避光染色20 min后冲洗，激光共聚焦显微镜下以氩离子激光为光源（绿色荧光激发光波长488 nm，红色荧光激发光波长559 nm），观察细菌菌群分布并测量细菌生物膜厚度。
1.4.4 扫描电镜观察硅胶材料表面细菌生物膜超微结构
于培养后4、6、12、24、48、72 h，各组取2孔硅胶片。PBS洗涤，2%戊二酸固定，乙醇梯度脱水、CO2临界点干燥，真空镀金，扫描电镜下观察。根据生物膜特征和结构，对生物膜成熟情况进行分级[12]。Ⅰ级，可见自由浮动的浮游细胞，细胞黏附于生物膜；Ⅱ级，形成小菌落和细胞群；Ⅲ级，通过细胞外基质纤维使小菌落之间相互联系，形成蜘蛛网外观的微菌落（塔）；Ⅳ级，形成具有地下通道和无定形细胞外物质的塔楼，呈蜂窝式。
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内比较采用t检验；组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细菌悬液实验浓度选择
2.1.1 结晶紫染色半定量检测
各时间点，两浓度组细菌悬液均在硅胶材料表面形成生物膜。1×107 CFU/mL组培养24 h生物膜厚度达峰值，1×108 CFU/mL组培养48 h达峰值，之后生物膜厚度均降低。培养4、6 h时，1×108 CFU/mL组生物膜厚度明显大于1×107 CFU/mL组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；而12～72 h 1×107 CFU/mL组生物膜厚度明显大于1×108 CFU/mL组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1及图 1。
表1
1×107 CFU/mL与1×108 CFU/mL组细菌悬液培养后各时间点生物膜厚度比较（n=6，
图1
1×107 CFU/mL与1×108 CFU/mL组细菌悬液各时间点生物膜厚度比较 图 2 1×107 CFU/mL与1×108 CFU/mL组细菌悬液各时间点细菌生长动力比较 图 3 XTT法检测不同雌二醇浓度组细菌生长动力ⓐATCC12228菌株ⓑATCC35984菌株 图 4 结晶紫染色半定量检测不同雌二醇浓度组细菌生物膜厚度ⓐATCC12228菌株ⓑATCC35984菌株
Figure1.
Comparison of biofilm between 1×107 CFU/mL and 1×108 CFU/mL ATCC35984 at different time points Fig. 2 Comparison of growth kinetics between 1×107 CFU/mL and 1×108 CFU/mL ATCC35984 at different time points Fig. 3 The growth kinetics of Staphylococcus epidermidis ATCC12228 and ATCC35984 in different concentrations of estradiol by XTT ⓐATCC12228 ⓑATCC35984 Fig. 4 The biofilm thickness of Staphylococcus epidermidis ATCC12228 and ATCC35984 in different concentrations of estradiol by crystal violet staining ⓐATCC12228 ⓑATCC35984
2.1.2 XTT法检测
与1×107 CFU/mL组相比，1×108 CFU/mL组细菌总体生长动力较快。各时间点，1×108 CFU/mL组A值均高于1×107 CFU/ mL组；其中4、24 h组间比较差异有统计学意义（P < 0.05），其余各时间点组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2及图 2。
表2
1×107 CFU/mL与1×108 CFU/mL组细菌悬液培养后各时间点细菌生长动力比较（n=6，根据以上检测结果，本实验选择1×107 CFU/mL为实验浓度进行下一步研究。
2.2 不同浓度雌二醇对细菌生物膜形成及生长动力的影响
2.2.1 XTT法检测
①同一时间点，ATCC12228和ATCC35984菌株的细菌生长速度均随雌二醇浓度增加而增加。两种菌株分别在4、6、12、24、72 h和4、6、24、72 h时，125、250、500 pmol/L组A值均高于0、50 pmol/L组，4、6、72 h时500 pmol/L组均高于125、250 pmol/L组，72 h时250 pmol/L组均高于125 pmol/L组，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）；其余各时间点组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。②同一时间点，两种菌株相同雌二醇浓度组A值比较，差异均无统计学意义（P > 0. 05）。见表 3及图 3。
表3
不同雌二醇浓度下表皮葡萄球菌ATCC12228和ATCC35984生长动力比较（n=6，2.2.2 结晶紫染色半定量检测
各时间点，ATCC12228菌株不同浓度雌二醇组A值差值均低于0.12，提示生物膜形成为阴性，不检测生物膜厚度。而ATCC35984菌株培养4 h即有生物膜形成，随时间延长逐渐增厚，24 h时达峰值，之后厚度减小。
培养4 h时，0 pmol/L组生物膜厚度大于50、250、500 pmol/L组，125 pmol/L组大于250、500 pmol/L组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；其余组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。6 h时，0、50 pmol/L组生物膜厚度大于125、250、500 pmol/ L组（P < 0.05），其余组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。12～72 h时，125、250、500 pmol/ L组生物膜厚度均显著大于0、50 pmol/L组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；且125 pmol/L组生物膜最厚，与250、500 pmol/L组比较差异亦有统计学意义（P < 0.05）；12、72 h时250、500 pmol/L组间比较差异无统计学意义（P > 0.05），24、48 h时500 pmol/L组生物膜厚度明显低于250 pmol/L组（P < 0.05）；12、24 h时，50 pmol/L组生物膜厚度明显低于0 pmol/L组，比较差异有统计学意义（P < 0.05），48、72 h时0、50 pmol/L组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 4及图 4。
表4
结晶紫染色半定量检测不同雌二醇浓度下表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜厚度比较（n=6，2.2.3 激光共聚焦显微镜观察
ATCC12228菌株无生物膜形成，激光共聚焦显微镜只观察ATCC35984菌株情况。镜下观察示，各雌二醇浓度组随培养时间延长生物膜逐渐形成并增厚，且50～500 pmol/L组生物膜形成均早于0 pmol/L组。6 h时生物膜内均为大量活细菌；12 h时形成的生物膜出现活、死细菌混合，但以活细菌为主；24 h时出现大量死细菌。同一时间点，不同雌二醇浓度组间比较发现，125、250、500 pmol/L组细菌明显较0、50 pmol/L组多，其中125 pmol/L组细菌最多。见图 5。
图5
激光共聚焦显微镜观察ATCC35984菌株各雌二醇浓度组生物膜形成情况（×200）
ⓐ0 pmol/L组12 h ⓑ50 pmol/L组12 h ⓒ125 pmol/L组12 h ⓓ250 pmol/L组12 h ⓔ500 pmol/L组12 h ⓕ125 pmol/L组12 h三维重建ⓖ0 pmol/L组24 h ⓗ50 pmol/L组24 h ⓘ125 pmol/L组24 h ⓙ250 pmol/L组24 h ⓚ500 pmol/L组24 h ⓛ125 pmol/L组24 h三维重建
Figure5. Bacterial biofilm in different concentrations of estradiol by CLSM (×200)ⓐ0 pmol/L group at 12 hours ⓑ50 pmol/Lgroup at 12 hours ⓒ125 pmol/L group at 12 hours ⓓ250 pmol/L group at 12 hours ⓔ500 pmol/L group at 12 hours ⓕThree-dimensional reconstruction image of 125 pmol/L group at 12 hours ⓖ0 pmol/L group at 24 hours ⓗ50 pmol/L group at 24 hours ⓘ125 pmol/L group at 24 hours ⓙ250 pmol/L group at 24 hours ⓚ500 pmol/L group at 24 hours ⓛThree-dimensional reconstruction image of 125 pmol/L group at 24 hours
测量结果示，培养6 h时，125、250、500 pmol/ L组生物膜厚度小于0、50 pmol/L组，比较差异有统计学意义（P < 0.05），125、250、500 pmol/L组间和0、50 pmol/L组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。之后各组生物膜逐渐增厚，12、24 h时125 pmol/L组生物膜厚度明显大于其他浓度组，各组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 5。
表5
激光共聚焦显微镜检测不同雌二醇浓度下表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜厚度比较（n=6，μm，2.2.4 扫描电镜观察
镜下观察示，ATCC12228菌株各雌二醇浓度组均无生物膜形成（图 6）。ATCC35984菌株各雌二醇浓度组培养4 h时，硅胶片表面见单个细菌分裂后形成的细菌团；6 h可见大量细菌团覆盖在硅胶片表面，部分细菌团向外延伸；12 h即见纤维组织形成，将细菌团相互连接形成塔状结构；24 h可见成熟的细菌生物膜结构，蜂窝式结构中有大量通道和无定形细胞外物质填充；48、72 h可见生物膜结构，但呈分解状，周围有新的细菌正在形成细菌团。各时间点125 pmol/L组形成的生物膜结构范围最广，结构最致密、最丰富、层次最多，其次为250 pmol/L组，0、50、500 pmol/L组生物膜相比层次较少，结构较简单。见图 7。
图6
扫描电镜观察ATCC12228菌株125 pmol/L雌二醇浓度组培养24 h生物膜结构（×200） 图 7 扫描电镜观察ATCC35984菌株各时间点各雌二醇浓度组生物膜结构（×200）
ⓐ125 pmol/L组4 h ⓑ125 pmol/L组6 h ⓒ 125 pmol/L组12 h ⓓ 125 pmol/L组24 h ⓔ125 pmol/L组48 h ⓕ125 pmol/L组72 h ⓖ0 pmol/L组24 h ⓗ50 pmol/L组24 h ⓘ250 pmol/L组24 h ⓙ500 pmol/L组24 h
Figure6. Bacterial biofilm structure of ATCC12228 on the surface of silica gel in 125 pmol/L estradiol at 24 hours by SEM (×200) Fig. 7 Bacterial biofilm structure of ATCC35984 on the surface of silica gel in different concentrations of estradiol at different time points by SEM (×200)ⓐ125 pmol/L group at 4 hours ⓑ125 pmol/L group at 6 hours ⓒ125 pmol/L group at 12 hours ⓓ125 pmol/L group at 24 hours ⓔ125 pmol/L group at 48 hours ⓕ125 pmol/L group at 72 hours ⓖ0 pmol/L group at 24 hours ⓗ50 pmol/L group at 24 hours ⓘ250 pmol/L group at 24 hours ⓙ500 pmol/L group at 24 hours
3 讨论
3.1 细菌悬液浓度的选择
研究发现，不是所有定植细菌的假体都会发生包膜挛缩，只有当表皮葡萄球菌数量≥3×105 CFU/ mL时才能最终形成包膜挛缩，但细菌数量≤1×106 CFU/mL时存在不能形成生物膜的可能性[12]，动物实验发现细菌浓度≥1×107 CFU/ mL才能稳定形成生物膜[13]。同时Rieger等[14]研究证实假体包膜挛缩程度与细菌浓度成正相关。由于既往研究关于细菌悬液浓度的选择均不一致，为此我们进行了预实验。在相关研究基础上，选择1×108 CFU/mL和1×107 CFU/mL两种浓度进行观察。结果显示，不是表皮葡萄球菌数量越多，生物膜形成越好，分析原因可能是实验用硅胶材料面积有限，若细菌数量较多会导致拥挤，无法取得理想的黏附空间，从而影响生物膜形成。与1×108 CFU/mL相比，1×107 CFU/mL的细菌悬液表现出较好的实验观察效果，随着时间推移细菌生长能力和生物膜厚度变化均显著优于1×108 CFU/mL组。因此我们选用1×107 CFU/mL作为实验浓度，以便更好地观察雌二醇对表皮葡萄球菌的影响。
3.2 雌二醇浓度对细菌生物膜形成的影响
作为激素依赖型肿瘤，乳腺癌的发生发展与体内性激素水平成显著正相关[15-20]。因此，乳腺癌患者无论绝经前、后，其机体一直处于高激素状态。虽然乳腺癌患者血清中性激素水平均较高，但雌二醇是雌激素最主要和最有效的形式，它可代表雌激素的绝对血清水平，是雌激素活性和效力的指标[19]。因此本实验选择雌二醇作为主要影响因子，并参考国内外乳腺癌患者和正常人群的血清雌二醇水平[20-22]，选择500、250、125、50 pmol/L浓度以模拟这两类人群的雌二醇水平。
本研究结果显示，表皮葡萄球菌ATCC35984在高浓度雌二醇（≥125 pmol/L）作用下形成的生物膜显著增厚，虽然高浓度雌二醇组在4、6 h表现出对生物膜有一定抑制作用，但12 h时表现明显促进作用，24 h时生物膜厚度达最大值，48、72 h时生物膜厚度均大于低雌二醇（50 pmol/L）组；同时发现低雌二醇组形成的生物膜厚度均小于空白（0 pmol/L）组。提示低浓度雌二醇对生物膜形成有一定抑制作用，且高浓度雌二醇未在生物膜形成初期即表现出促进作用，而是在生物膜形成一定程度基础上才开始发挥促进作用。通过对比不同雌二醇浓度组检测结果，我们发现ATCC35984在雌二醇浓度为125 pmol/L时生物膜厚度和细菌生长动力均达最高。
同时扫描电镜观察结果提示，雌二醇对生物膜成熟方面有明显促进作用，各雌二醇浓度组均出现小菌落、塔状和蜂窝状外观，且125 pmol/L雌二醇作用下的生物膜最致密、层次最丰富。此外，雌二醇虽然不能诱导ATCC12228形成生物膜，但其仍能促进细菌生长，提示雌二醇对细菌的生长仍有较强的生物活性，且不会影响细菌自身特定基因的改变。
乳腺假体植入为细菌的定植提供了平台，我们体外实验发现高浓度雌二醇能加快细菌生长和生物膜形成、促进生物膜的发展，可能促进假体植入术后包膜挛缩的发生，成为临床中棘手的并发症。
包膜挛缩是乳房假体植入术后最严重的并发症，该并发症发生与表皮葡萄球菌感染关系密切。细菌在假体表面形成生物膜，持续的亚临床感染造成纤维包膜形成，随着纤维包膜变厚、变硬、收缩，最终改变乳房轮廓，导致严重疼痛[1-3]；生物膜作为细菌屏障还增加了治疗难度。作为激素依赖型肿瘤，体内雌激素水平增高是乳腺癌发病的重要原因之一，如果机体雌二醇水平长期维持在103 pmol/L以上，发生乳腺癌几率也随之增高[4]。此外雌激素对细菌的正调控已得到证实，特别在致病菌生物膜形成方面[5-11]。但对于长期具有高水平雌二醇的乳腺癌患者，表皮葡萄球菌生长和生物膜的形成特点尚未明确。因此，本研究通过体外实验探讨雌二醇对表皮葡萄球菌生长和生物膜形成能力的影响，以期为临床预防假体表面细菌生物膜的形成提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验菌株及主要试剂、仪器
表皮葡萄球菌标准株ATCC35984（生物膜表型阳性）购自美国典型菌种保藏中心，表皮葡萄球菌标准株ATCC12228（生物膜表型阴性）购自中国科学院微生物研究所。一次性硅胶扩张器（广州万和整形材料有限公司）。
雌二醇（Sigma公司，美国）；活/死细菌荧光染色剂（Life公司，美国）；结晶紫、DMSO、溶菌肉汤（lysogeny broth，LB）培养基（北京索莱宝科技有限公司）；XTT细菌增殖及细菌毒性检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基（广东环凯微生物科技有限公司）。
S-30000N扫描电镜（Hitachi公司，日本）；激光共聚焦显微镜（Olympus公司，日本）；紫外分光光度计（Bio-Rad公司，美国）；全波段多功能酶标仪（Thermo公司，美国）。
1.2 细菌悬液实验浓度选择
1.2.1 细菌悬液制备
常规复苏冻存的ATCC35984菌株，接种至LB琼脂平板，于37℃培养24 h。挑取单个菌落转移至TSB培养基中，置于恒温振荡器，以37℃、250 r/min培养16～18 h，使细菌细胞生长至对数生长期，调整细菌悬液浓度为1×107 CFU/mL或1×108 CFU/mL，备用。
1.2.2 雌二醇悬液制备
取0.027 2 g雌二醇置于无水乙醇中溶解，然后加入蒸馏水制成浓度为1×10-2 mol/L的雌二醇原液，避光置于— 20℃备用。实验前取雌二醇原液，利用TSB培养基稀释，制备终浓度为125 pmol/L的雌二醇悬液。
1.2.3 硅胶材料表面细菌生物膜体外模型制备
取一次性硅胶扩张器制成大小为1 cm×1 cm的方形硅胶片，环氧乙烷熏蒸灭菌后备用。取24孔板，每孔加入浓度为1×107 CFU/mL或1×108 CFU/mL的细菌悬液400μL、125 pmol/L雌二醇悬液40μL以及1片硅胶片。置于37°C恒温箱培养，于培养后4、6、12、24、48、72 h进行观测。
1.2.4 观测指标
①结晶紫染色半定量检测硅胶材料表面细菌生物膜形成能力：各时间点两浓度组各取6孔硅胶片，PBS清洗、风干后加入2%结晶紫100 μL染色30 min；取出硅胶片漂洗、风干，加入DMSO脱色15 min；各孔取100μL脱色液至96孔板，用酶标仪测定波长490 nm处吸光度（A）值，以单纯TSB培养基作为空白对照。各孔测量A值与空白对照A值的差值作为生物膜厚度，表示细菌生物膜形成能力，差值> 0.12为生物膜形成阳性。
②XTT法检测硅胶材料表面细菌生长动力：各时间点两浓度组各取6孔硅胶片，PBS清洗、风干后加入100μL TSB培养基和20μL XTT溶液，37℃避光孵育2 h。以添加LB培养基和XTT溶液的无细菌混合液作为空白对照。采用酶标仪测定波长450 nm处A值，以各孔测量A值与空白对照A值的差值表示细菌生长动力。
根据硅胶材料表面细菌生物膜形成能力及细菌生长动力检测结果，选择细菌悬液实验浓度。
1.3 实验分组及方法
参照1.2.2方法制备终浓度为50、125、250、500 pmol/L的雌二醇悬液。取实验浓度ATCC35984菌株悬液以及以上终浓度雌二醇悬液，参照1.2.3方法分别制备硅胶材料表面生物膜体外模型；并以未添加雌二醇悬液（0 pmol/L）作为对照。另取实验浓度ATCC12228菌株悬液同法制备模型，作为阴性对照。
1.4 观测指标
1.4.1 XTT法检测硅胶材料表面细菌生长动力
于培养后4、6、12、24、48、72 h，各组取6孔硅胶片，同1.2.4方法进行检测。
1.4.2 结晶紫染色半定量检测硅胶材料表面细菌生物膜形成能力
于培养后4、6、12、24、48、72 h，各组取6孔硅胶片，同1.2.4方法进行检测。
1.4.3 激光共聚焦显微镜观察硅胶材料表面细菌生物膜厚度
于培养后6、12、24 h，各组取6孔硅胶片，洗去浮游菌，加入荧光染色剂，常温下避光染色20 min后冲洗，激光共聚焦显微镜下以氩离子激光为光源（绿色荧光激发光波长488 nm，红色荧光激发光波长559 nm），观察细菌菌群分布并测量细菌生物膜厚度。
1.4.4 扫描电镜观察硅胶材料表面细菌生物膜超微结构
于培养后4、6、12、24、48、72 h，各组取2孔硅胶片。PBS洗涤，2%戊二酸固定，乙醇梯度脱水、CO2临界点干燥，真空镀金，扫描电镜下观察。根据生物膜特征和结构，对生物膜成熟情况进行分级[12]。Ⅰ级，可见自由浮动的浮游细胞，细胞黏附于生物膜；Ⅱ级，形成小菌落和细胞群；Ⅲ级，通过细胞外基质纤维使小菌落之间相互联系，形成蜘蛛网外观的微菌落（塔）；Ⅳ级，形成具有地下通道和无定形细胞外物质的塔楼，呈蜂窝式。
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组内比较采用t检验；组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细菌悬液实验浓度选择
2.1.1 结晶紫染色半定量检测
各时间点，两浓度组细菌悬液均在硅胶材料表面形成生物膜。1×107 CFU/mL组培养24 h生物膜厚度达峰值，1×108 CFU/mL组培养48 h达峰值，之后生物膜厚度均降低。培养4、6 h时，1×108 CFU/mL组生物膜厚度明显大于1×107 CFU/mL组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；而12～72 h 1×107 CFU/mL组生物膜厚度明显大于1×108 CFU/mL组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1及图 1。
表1
1×107 CFU/mL与1×108 CFU/mL组细菌悬液培养后各时间点生物膜厚度比较（n=6，
图1
1×107 CFU/mL与1×108 CFU/mL组细菌悬液各时间点生物膜厚度比较 图 2 1×107 CFU/mL与1×108 CFU/mL组细菌悬液各时间点细菌生长动力比较 图 3 XTT法检测不同雌二醇浓度组细菌生长动力ⓐATCC12228菌株ⓑATCC35984菌株 图 4 结晶紫染色半定量检测不同雌二醇浓度组细菌生物膜厚度ⓐATCC12228菌株ⓑATCC35984菌株
Figure1.
Comparison of biofilm between 1×107 CFU/mL and 1×108 CFU/mL ATCC35984 at different time points Fig. 2 Comparison of growth kinetics between 1×107 CFU/mL and 1×108 CFU/mL ATCC35984 at different time points Fig. 3 The growth kinetics of Staphylococcus epidermidis ATCC12228 and ATCC35984 in different concentrations of estradiol by XTT ⓐATCC12228 ⓑATCC35984 Fig. 4 The biofilm thickness of Staphylococcus epidermidis ATCC12228 and ATCC35984 in different concentrations of estradiol by crystal violet staining ⓐATCC12228 ⓑATCC35984
2.1.2 XTT法检测
与1×107 CFU/mL组相比，1×108 CFU/mL组细菌总体生长动力较快。各时间点，1×108 CFU/mL组A值均高于1×107 CFU/ mL组；其中4、24 h组间比较差异有统计学意义（P < 0.05），其余各时间点组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2及图 2。
表2
1×107 CFU/mL与1×108 CFU/mL组细菌悬液培养后各时间点细菌生长动力比较（n=6，根据以上检测结果，本实验选择1×107 CFU/mL为实验浓度进行下一步研究。
2.2 不同浓度雌二醇对细菌生物膜形成及生长动力的影响
2.2.1 XTT法检测
①同一时间点，ATCC12228和ATCC35984菌株的细菌生长速度均随雌二醇浓度增加而增加。两种菌株分别在4、6、12、24、72 h和4、6、24、72 h时，125、250、500 pmol/L组A值均高于0、50 pmol/L组，4、6、72 h时500 pmol/L组均高于125、250 pmol/L组，72 h时250 pmol/L组均高于125 pmol/L组，组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）；其余各时间点组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。②同一时间点，两种菌株相同雌二醇浓度组A值比较，差异均无统计学意义（P > 0. 05）。见表 3及图 3。
表3
不同雌二醇浓度下表皮葡萄球菌ATCC12228和ATCC35984生长动力比较（n=6，2.2.2 结晶紫染色半定量检测
各时间点，ATCC12228菌株不同浓度雌二醇组A值差值均低于0.12，提示生物膜形成为阴性，不检测生物膜厚度。而ATCC35984菌株培养4 h即有生物膜形成，随时间延长逐渐增厚，24 h时达峰值，之后厚度减小。
培养4 h时，0 pmol/L组生物膜厚度大于50、250、500 pmol/L组，125 pmol/L组大于250、500 pmol/L组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；其余组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。6 h时，0、50 pmol/L组生物膜厚度大于125、250、500 pmol/ L组（P < 0.05），其余组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。12～72 h时，125、250、500 pmol/ L组生物膜厚度均显著大于0、50 pmol/L组，比较差异有统计学意义（P < 0.05）；且125 pmol/L组生物膜最厚，与250、500 pmol/L组比较差异亦有统计学意义（P < 0.05）；12、72 h时250、500 pmol/L组间比较差异无统计学意义（P > 0.05），24、48 h时500 pmol/L组生物膜厚度明显低于250 pmol/L组（P < 0.05）；12、24 h时，50 pmol/L组生物膜厚度明显低于0 pmol/L组，比较差异有统计学意义（P < 0.05），48、72 h时0、50 pmol/L组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 4及图 4。
表4
结晶紫染色半定量检测不同雌二醇浓度下表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜厚度比较（n=6，2.2.3 激光共聚焦显微镜观察
ATCC12228菌株无生物膜形成，激光共聚焦显微镜只观察ATCC35984菌株情况。镜下观察示，各雌二醇浓度组随培养时间延长生物膜逐渐形成并增厚，且50～500 pmol/L组生物膜形成均早于0 pmol/L组。6 h时生物膜内均为大量活细菌；12 h时形成的生物膜出现活、死细菌混合，但以活细菌为主；24 h时出现大量死细菌。同一时间点，不同雌二醇浓度组间比较发现，125、250、500 pmol/L组细菌明显较0、50 pmol/L组多，其中125 pmol/L组细菌最多。见图 5。
图5
激光共聚焦显微镜观察ATCC35984菌株各雌二醇浓度组生物膜形成情况（×200）
ⓐ0 pmol/L组12 h ⓑ50 pmol/L组12 h ⓒ125 pmol/L组12 h ⓓ250 pmol/L组12 h ⓔ500 pmol/L组12 h ⓕ125 pmol/L组12 h三维重建ⓖ0 pmol/L组24 h ⓗ50 pmol/L组24 h ⓘ125 pmol/L组24 h ⓙ250 pmol/L组24 h ⓚ500 pmol/L组24 h ⓛ125 pmol/L组24 h三维重建
Figure5. Bacterial biofilm in different concentrations of estradiol by CLSM (×200)ⓐ0 pmol/L group at 12 hours ⓑ50 pmol/Lgroup at 12 hours ⓒ125 pmol/L group at 12 hours ⓓ250 pmol/L group at 12 hours ⓔ500 pmol/L group at 12 hours ⓕThree-dimensional reconstruction image of 125 pmol/L group at 12 hours ⓖ0 pmol/L group at 24 hours ⓗ50 pmol/L group at 24 hours ⓘ125 pmol/L group at 24 hours ⓙ250 pmol/L group at 24 hours ⓚ500 pmol/L group at 24 hours ⓛThree-dimensional reconstruction image of 125 pmol/L group at 24 hours
测量结果示，培养6 h时，125、250、500 pmol/ L组生物膜厚度小于0、50 pmol/L组，比较差异有统计学意义（P < 0.05），125、250、500 pmol/L组间和0、50 pmol/L组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。之后各组生物膜逐渐增厚，12、24 h时125 pmol/L组生物膜厚度明显大于其他浓度组，各组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 5。
表5
激光共聚焦显微镜检测不同雌二醇浓度下表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜厚度比较（n=6，μm，2.2.4 扫描电镜观察
镜下观察示，ATCC12228菌株各雌二醇浓度组均无生物膜形成（图 6）。ATCC35984菌株各雌二醇浓度组培养4 h时，硅胶片表面见单个细菌分裂后形成的细菌团；6 h可见大量细菌团覆盖在硅胶片表面，部分细菌团向外延伸；12 h即见纤维组织形成，将细菌团相互连接形成塔状结构；24 h可见成熟的细菌生物膜结构，蜂窝式结构中有大量通道和无定形细胞外物质填充；48、72 h可见生物膜结构，但呈分解状，周围有新的细菌正在形成细菌团。各时间点125 pmol/L组形成的生物膜结构范围最广，结构最致密、最丰富、层次最多，其次为250 pmol/L组，0、50、500 pmol/L组生物膜相比层次较少，结构较简单。见图 7。
图6
扫描电镜观察ATCC12228菌株125 pmol/L雌二醇浓度组培养24 h生物膜结构（×200） 图 7 扫描电镜观察ATCC35984菌株各时间点各雌二醇浓度组生物膜结构（×200）
ⓐ125 pmol/L组4 h ⓑ125 pmol/L组6 h ⓒ 125 pmol/L组12 h ⓓ 125 pmol/L组24 h ⓔ125 pmol/L组48 h ⓕ125 pmol/L组72 h ⓖ0 pmol/L组24 h ⓗ50 pmol/L组24 h ⓘ250 pmol/L组24 h ⓙ500 pmol/L组24 h
Figure6. Bacterial biofilm structure of ATCC12228 on the surface of silica gel in 125 pmol/L estradiol at 24 hours by SEM (×200) Fig. 7 Bacterial biofilm structure of ATCC35984 on the surface of silica gel in different concentrations of estradiol at different time points by SEM (×200)ⓐ125 pmol/L group at 4 hours ⓑ125 pmol/L group at 6 hours ⓒ125 pmol/L group at 12 hours ⓓ125 pmol/L group at 24 hours ⓔ125 pmol/L group at 48 hours ⓕ125 pmol/L group at 72 hours ⓖ0 pmol/L group at 24 hours ⓗ50 pmol/L group at 24 hours ⓘ250 pmol/L group at 24 hours ⓙ500 pmol/L group at 24 hours
3 讨论
3.1 细菌悬液浓度的选择
研究发现，不是所有定植细菌的假体都会发生包膜挛缩，只有当表皮葡萄球菌数量≥3×105 CFU/ mL时才能最终形成包膜挛缩，但细菌数量≤1×106 CFU/mL时存在不能形成生物膜的可能性[12]，动物实验发现细菌浓度≥1×107 CFU/ mL才能稳定形成生物膜[13]。同时Rieger等[14]研究证实假体包膜挛缩程度与细菌浓度成正相关。由于既往研究关于细菌悬液浓度的选择均不一致，为此我们进行了预实验。在相关研究基础上，选择1×108 CFU/mL和1×107 CFU/mL两种浓度进行观察。结果显示，不是表皮葡萄球菌数量越多，生物膜形成越好，分析原因可能是实验用硅胶材料面积有限，若细菌数量较多会导致拥挤，无法取得理想的黏附空间，从而影响生物膜形成。与1×108 CFU/mL相比，1×107 CFU/mL的细菌悬液表现出较好的实验观察效果，随着时间推移细菌生长能力和生物膜厚度变化均显著优于1×108 CFU/mL组。因此我们选用1×107 CFU/mL作为实验浓度，以便更好地观察雌二醇对表皮葡萄球菌的影响。
3.2 雌二醇浓度对细菌生物膜形成的影响
作为激素依赖型肿瘤，乳腺癌的发生发展与体内性激素水平成显著正相关[15-20]。因此，乳腺癌患者无论绝经前、后，其机体一直处于高激素状态。虽然乳腺癌患者血清中性激素水平均较高，但雌二醇是雌激素最主要和最有效的形式，它可代表雌激素的绝对血清水平，是雌激素活性和效力的指标[19]。因此本实验选择雌二醇作为主要影响因子，并参考国内外乳腺癌患者和正常人群的血清雌二醇水平[20-22]，选择500、250、125、50 pmol/L浓度以模拟这两类人群的雌二醇水平。
本研究结果显示，表皮葡萄球菌ATCC35984在高浓度雌二醇（≥125 pmol/L）作用下形成的生物膜显著增厚，虽然高浓度雌二醇组在4、6 h表现出对生物膜有一定抑制作用，但12 h时表现明显促进作用，24 h时生物膜厚度达最大值，48、72 h时生物膜厚度均大于低雌二醇（50 pmol/L）组；同时发现低雌二醇组形成的生物膜厚度均小于空白（0 pmol/L）组。提示低浓度雌二醇对生物膜形成有一定抑制作用，且高浓度雌二醇未在生物膜形成初期即表现出促进作用，而是在生物膜形成一定程度基础上才开始发挥促进作用。通过对比不同雌二醇浓度组检测结果，我们发现ATCC35984在雌二醇浓度为125 pmol/L时生物膜厚度和细菌生长动力均达最高。
同时扫描电镜观察结果提示，雌二醇对生物膜成熟方面有明显促进作用，各雌二醇浓度组均出现小菌落、塔状和蜂窝状外观，且125 pmol/L雌二醇作用下的生物膜最致密、层次最丰富。此外，雌二醇虽然不能诱导ATCC12228形成生物膜，但其仍能促进细菌生长，提示雌二醇对细菌的生长仍有较强的生物活性，且不会影响细菌自身特定基因的改变。
乳腺假体植入为细菌的定植提供了平台，我们体外实验发现高浓度雌二醇能加快细菌生长和生物膜形成、促进生物膜的发展，可能促进假体植入术后包膜挛缩的发生，成为临床中棘手的并发症。
