引用本文： 魏波, 康银辉, 宋丽君, 王朝军, 郭伟雄, 向旻, 李广盛, 林林颢, 曾荣. BMSCs条件培养基改善地塞米松对成骨细胞成骨功能抑制效应的研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(6): 761-766. doi: 10.7507/1002-1892.20160155 复制
目前，糖皮质激素已广泛用于治疗过敏性、自身免疫性和炎症性疾病，但长时间应用会引起不同程度骨量丢失，甚至发生骨坏死[1-2]。而由糖皮质激素导致的骨坏死发病机制仍不明确。成骨细胞在调节骨生长和形成中具有至关重要的作用，是糖皮质激素作用的重要靶细胞[3-4]，体外实验证明糖皮质激素能抑制成骨细胞功能[5-7]。BMSCs 来源于中胚层，具有自我更新和多向分化能力，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、成纤维细胞等[8]。BMSCs移植治疗激素性股骨头缺血性坏死已成为研究热点，这种治疗作用可能是通过细胞和细胞间分泌的某种因子产生的[9-10]。这些生物活性因子包括小分子蛋白、生长因子、细胞因子和其他细胞调节剂[9, 11]，有调节多种细胞生理活性的能力，包括诱导骨形成及血管发生、发育[12-14]。目前，关于BMSCs旁分泌作用对糖皮质激素造成的成骨细胞成骨能力改变是否存在影响，尚无研究报道。MC3T3-E1细胞是从C57BL/6小鼠颅顶骨细胞中建株的成骨细胞，常作为骨代谢研究的细胞模型[15]。本实验以MC3T3-E1细胞为研究对象，初步探讨BMSCs条件培养基对地塞米松所致成骨细胞成骨功能抑制效应的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
MC3T3-E1细胞购自上海生命科学院；C57BL/6小鼠BMSCs购自赛业（广州）生物科技有限公司。地塞米松（Sigma公司，美国）；C57BL/6小鼠BMSCs完全培养基（含10%FBS、1%青霉素/链霉素双抗和1%谷氨酰胺）、茜素红S[赛业（广州）生物科技有限公司]；α-MEM培养基（HyClone公司，美国）；青霉素/链霉素双抗、FBS（GIBCO公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（Dojindo公司，日本）；ALP活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；SYBR?Green qPCR荧光染料（大连宝生物公司）；兔抗鼠RUNX2一抗、鼠抗鼠骨钙素（Osteocalcin）一抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。Roche LightCycler480荧光定量PCR仪[罗氏（上海）有限公司]；酶标仪（Thermofisher公司，美国）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）。
1.2 MC3T3-E1细胞培养及BMSCs条件培养基制备
取MC3T3-E1细胞，用含10%FBS和1%青霉素/链霉素双抗的α-MEM培养基，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，待细胞生长达80%～90%时传代。
取C57BL/6小鼠BMSCs，用C57BL/6小鼠BMSCs完全培养基，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，待细胞生长达80%～90%时传代。取对数生长期BMSCs，以5.5×106个/皿的密度接种于10 cm培养皿中，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养 ，待细胞生长达80%后弃培养基，加入BMSCs基础培养基，24 h后收集上清，4℃保存，3 d内使用。
1.3 地塞米松对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响
取对数生长期MC3T3-E1细胞，以5×103个/孔接种于96孔板，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养6 h，使细胞完全贴壁。分别以浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L地塞米松100 μL培养24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培养箱内孵育1 h，用酶标仪测定450 nm处吸光度（A）值，比较不同浓度地塞米松对MC3T3-E1细胞增殖的抑制作用，选择对细胞增殖影响最小的最大浓度用于后续实验。每个浓度设5个复孔。
1.4 实验分组及方法
1.4.1 实验分组
根据不同培养条件，实验分为4 组。A组为对照组，以α-MEM培养基培养；B组添加1 μmol/L地塞米松；C组按1:1比例添加1 μmol/L地塞米松和BMSCs条件培养基；D组仅添加BMSCs条件培养基。
1.4.2 茜素红染色
将第3代MC3T3-E1细胞以5×104个/孔接种于6孔板中，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养6 h后，按上述分组方法分别培养，每隔3 d换液。培养21 d后PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗2遍，0.1%茜素红溶液染色5 min，PBS冲洗2遍[16]，倒置显微镜下观察钙结节形成情况。
1.4.3 细胞内ALP含量测定
按1.4.2方法分组培养细胞24 h后测定蛋白浓度，按以下步骤测定细胞内ALP含量。在96孔板中设置空白孔（双蒸水5 μL）、标准孔（0.1 mg/mL酚标准应用液5 μL）和测定孔（样本5 μL），测定孔设5个复孔；再依次加入缓冲液、基质液各50 μL，摇床混匀后在37℃水浴中放置15 min（待测样品中ALP活性较低时，可适当延长孵育时间至30 min），各孔加入显色剂150 μL，混匀后用酶标仪测定520 nm处A值，根据以下公式计算ALP含量： （测定孔A值－空白孔A值） /（标准孔A值－空白孔A值）×校准品浓度×待测样本蛋白浓度。
1.4.4 Western blot检测
按1.4.2方法分组培养细胞24 h后，PBS冲洗3遍，冰上用裂解液裂解30 min后提取细胞总蛋白。蛋白浓度用BCA法测定，与5×上样缓冲液混合，100℃变性5 min。取等量蛋白经SDS-PAGE电泳后，将凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封闭过夜。加入兔抗鼠RUNX2一抗、鼠抗鼠Osteocalcin一抗（1:1 000）和内参GAPDH（1:2 000），4℃过夜，室温孵育1 h，洗膜后经相应二抗（1:5 000）孵育1 h，洗膜后ECL显影液显影，曝光成像，Image J软件分析目的条带，以目的蛋白与GAPDH比值作为蛋白相对表达量。
1.4.5 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测
将生长状态良好的第3代MC3T3-E1细胞以 1×105个/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁后按分组方法培养24 h后，用Trizol试剂提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，分光光度计测定浓度，逆转录为cDNA，获得反应体系模版。α1-Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ-α 1，COL1A1）、RUNX2、ALP、Osteocalcin和内参β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表 1。采用两步法进行分析，反应总体系20 μL，反应条件：预变性95℃、2 min，95℃、15 s，60℃、30 s，40个循环。每个样本设5个复孔。采用2-ΔΔCt标准化法计算各目的基因相对表达量。
表1
RT-qPCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for RT-qPCR
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 地塞米松对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响
各浓度地塞米松对MC3T3-E1细胞增殖均有抑制作用，且随着浓度增加，细胞活性逐渐降低。0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L浓度组细胞存活率均低于0 μmol/L浓度组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 1。其中0.5、1.0 μmol/L浓度组培养细胞存活率超过80%，故选择1.0 μmol/L作为后续实验用浓度。
图1
不同浓度地塞米松培养24 h后对MC3T3-E1细胞增殖的影响
Figure1.
Effect of different concentrations of dexamethasone on MC3T3-E1 cell proliferation cultured for 24 hours
2.2 茜素红染色
培养6 d时A组细胞死亡；21 d时B、C、D组均可见茜素红阳性染色，且逐渐增强。见图 2。
图2
培养21 d B、C、D组钙结节形成观察（茜素红染色×40） ⓐ B组 ⓑ C组 ⓒ D组 图 3 Western blot检测细胞内RUNX2、Osteocalcin蛋白表达 1：A组 2：B组 3：C组 4：D组 ⓐ RUNX2 ⓑ Osteocalcin
Figure2.
Observation of calcium nodules formation in groups B, C, and D at 21 days (Alizarin red staining×40) ⓐ Group B ⓑ Group C ⓒ Group D Fig. 3 The protein expressions of RUNX2 and Osteocalcin by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ⓐ RUNX2 ⓑ Osteocalcin
2.3 细胞内ALP含量测定
培养24 h后，A、B、C、D组ALP含量分别为3.870±0.135、2.443±0.101、3.310±0.161和3.580±0.155。B、C、D组ALP含量均显著低于A组，B组低于C、D组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.4 Western blot检测细胞内RUNX2、Osteocalcin蛋白表达
培养24 h后，A、B、C、D组RUNX2蛋白相对表达量分别为0.725±0.055、0.590±0.067、0.662±0.052、0.723±0.038，B组显著低于A、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；A、C、D组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。A、B、C、D组Osteocalcin蛋白相对表达量分别为0.691±0.084、0.343±0.043、0.688±0.106、1.286±0.125，B组显著低于A、C、D组，A、C组低于D组，差异均有统计学意义（P < 0.05）； A、C组间差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 3。
2.5 RT-qPCR检测细胞内RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因表达
B、C、D组RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因相对表达量均显著低于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）。D组RUNX2、Osteocalcin、ALP基因相对表达量均显著高于B、C组，C组显著高于B 组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；D组COL1A1基因相对表达量显著高于B组（P < 0.05），B、C组间及C、D组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
表2
RT-qPCR检测细胞内各基因相对表达量（n=5，3 讨论
激素性骨坏死已成为临床上常见的骨骼疾病，然而其发病机制尚未完全阐明。Ogoshi等[17]发现地塞米松能诱导成骨细胞凋亡，这种作用与地塞米松的浓度密切相关。Weinstein等[18]通过对7月龄鼠连续注射泼尼松龙约4周后，发现鼠椎体成骨细胞凋亡增加3倍，28%的皮质骨干骺端骨细胞凋亡。已有大量研究表明，糖皮质激素能抑制成骨细胞的骨生成活性，促进破骨细胞的骨吸收活性，最终导致骨量不可逆丢失，形成骨质疏松症[19-21]。
BMSCs移植被认为是一项具有前景的治疗骨坏死方法。移植后BMSCs除分化为功能细胞外，其旁分泌作用对周围环境中的细胞亦有重要影响。研究表明，BMSCs的旁分泌作用能促进细胞增殖[22]，并有抗炎、抑制凋亡的作用[23-24]。但BMSCs移植后对糖皮质激素作用的成骨细胞的影响，尚未见文献报道。
成骨细胞功能标志指标较多，其中ALP高表达是成骨细胞分化的特异性标志[25-26]，其含量可间接反映成骨细胞的功能。RUNX2被认为是成骨细胞骨形成过程中其他成骨因子调节的主开关[27]。COL1A1是骨组织中最丰富的细胞外蛋白，并在成骨细胞发育的所有阶段表达[28]。Osteocalcin由成骨细胞分泌，是成骨细胞骨形成的重要标志物[29]。对这些指标的测定能了解成骨细胞的功能。本研究以MC3T3-E1细胞为研究对象，观察BMSCs条件培养基对地塞米松作用MC3T3-E1细胞后，细胞内ALP含量，RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因表达，RUNX2、Osteocalcin蛋白和钙结节形成的影响。结果发现，地塞米松作用后成骨细胞内ALP含量，RUNX2、Osteocalcin蛋白相对表达量及COL1A1、RUNX2、ALP、Osteocalcin基因相对表达量均下降，21 d后钙结节染色减少；同时用BMSCs条件培养基干预时，呈现逆转效应，表现为成骨细胞内ALP含量和上述蛋白、基因表达增多，钙化结节染色增强等效应。因此可认为，BMSCs旁分泌作用能够改善地塞米松所致的成骨细胞成骨功能抑制效应。
综上述，BMSCs条件培养基能够逆转地塞米松所致MC3T3-E1细胞成骨能力下降，BMSCs具有保护成骨细胞免受激素损害而抑制骨坏死的发生，提示BMSCs在移植治疗激素性骨坏死方面具有巨大潜力，但其作用机制尚需进一步研究探讨。
目前，糖皮质激素已广泛用于治疗过敏性、自身免疫性和炎症性疾病，但长时间应用会引起不同程度骨量丢失，甚至发生骨坏死[1-2]。而由糖皮质激素导致的骨坏死发病机制仍不明确。成骨细胞在调节骨生长和形成中具有至关重要的作用，是糖皮质激素作用的重要靶细胞[3-4]，体外实验证明糖皮质激素能抑制成骨细胞功能[5-7]。BMSCs 来源于中胚层，具有自我更新和多向分化能力，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、成纤维细胞等[8]。BMSCs移植治疗激素性股骨头缺血性坏死已成为研究热点，这种治疗作用可能是通过细胞和细胞间分泌的某种因子产生的[9-10]。这些生物活性因子包括小分子蛋白、生长因子、细胞因子和其他细胞调节剂[9, 11]，有调节多种细胞生理活性的能力，包括诱导骨形成及血管发生、发育[12-14]。目前，关于BMSCs旁分泌作用对糖皮质激素造成的成骨细胞成骨能力改变是否存在影响，尚无研究报道。MC3T3-E1细胞是从C57BL/6小鼠颅顶骨细胞中建株的成骨细胞，常作为骨代谢研究的细胞模型[15]。本实验以MC3T3-E1细胞为研究对象，初步探讨BMSCs条件培养基对地塞米松所致成骨细胞成骨功能抑制效应的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
MC3T3-E1细胞购自上海生命科学院；C57BL/6小鼠BMSCs购自赛业（广州）生物科技有限公司。地塞米松（Sigma公司，美国）；C57BL/6小鼠BMSCs完全培养基（含10%FBS、1%青霉素/链霉素双抗和1%谷氨酰胺）、茜素红S[赛业（广州）生物科技有限公司]；α-MEM培养基（HyClone公司，美国）；青霉素/链霉素双抗、FBS（GIBCO公司，美国）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（Dojindo公司，日本）；ALP活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；SYBR?Green qPCR荧光染料（大连宝生物公司）；兔抗鼠RUNX2一抗、鼠抗鼠骨钙素（Osteocalcin）一抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。Roche LightCycler480荧光定量PCR仪[罗氏（上海）有限公司]；酶标仪（Thermofisher公司，美国）；倒置显微镜（Olympus公司，日本）。
1.2 MC3T3-E1细胞培养及BMSCs条件培养基制备
取MC3T3-E1细胞，用含10%FBS和1%青霉素/链霉素双抗的α-MEM培养基，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，待细胞生长达80%～90%时传代。
取C57BL/6小鼠BMSCs，用C57BL/6小鼠BMSCs完全培养基，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，待细胞生长达80%～90%时传代。取对数生长期BMSCs，以5.5×106个/皿的密度接种于10 cm培养皿中，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养 ，待细胞生长达80%后弃培养基，加入BMSCs基础培养基，24 h后收集上清，4℃保存，3 d内使用。
1.3 地塞米松对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响
取对数生长期MC3T3-E1细胞，以5×103个/孔接种于96孔板，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养6 h，使细胞完全贴壁。分别以浓度为0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L地塞米松100 μL培养24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培养箱内孵育1 h，用酶标仪测定450 nm处吸光度（A）值，比较不同浓度地塞米松对MC3T3-E1细胞增殖的抑制作用，选择对细胞增殖影响最小的最大浓度用于后续实验。每个浓度设5个复孔。
1.4 实验分组及方法
1.4.1 实验分组
根据不同培养条件，实验分为4 组。A组为对照组，以α-MEM培养基培养；B组添加1 μmol/L地塞米松；C组按1:1比例添加1 μmol/L地塞米松和BMSCs条件培养基；D组仅添加BMSCs条件培养基。
1.4.2 茜素红染色
将第3代MC3T3-E1细胞以5×104个/孔接种于6孔板中，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养6 h后，按上述分组方法分别培养，每隔3 d换液。培养21 d后PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗2遍，0.1%茜素红溶液染色5 min，PBS冲洗2遍[16]，倒置显微镜下观察钙结节形成情况。
1.4.3 细胞内ALP含量测定
按1.4.2方法分组培养细胞24 h后测定蛋白浓度，按以下步骤测定细胞内ALP含量。在96孔板中设置空白孔（双蒸水5 μL）、标准孔（0.1 mg/mL酚标准应用液5 μL）和测定孔（样本5 μL），测定孔设5个复孔；再依次加入缓冲液、基质液各50 μL，摇床混匀后在37℃水浴中放置15 min（待测样品中ALP活性较低时，可适当延长孵育时间至30 min），各孔加入显色剂150 μL，混匀后用酶标仪测定520 nm处A值，根据以下公式计算ALP含量： （测定孔A值－空白孔A值） /（标准孔A值－空白孔A值）×校准品浓度×待测样本蛋白浓度。
1.4.4 Western blot检测
按1.4.2方法分组培养细胞24 h后，PBS冲洗3遍，冰上用裂解液裂解30 min后提取细胞总蛋白。蛋白浓度用BCA法测定，与5×上样缓冲液混合，100℃变性5 min。取等量蛋白经SDS-PAGE电泳后，将凝胶转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封闭过夜。加入兔抗鼠RUNX2一抗、鼠抗鼠Osteocalcin一抗（1:1 000）和内参GAPDH（1:2 000），4℃过夜，室温孵育1 h，洗膜后经相应二抗（1:5 000）孵育1 h，洗膜后ECL显影液显影，曝光成像，Image J软件分析目的条带，以目的蛋白与GAPDH比值作为蛋白相对表达量。
1.4.5 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测
将生长状态良好的第3代MC3T3-E1细胞以 1×105个/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁后按分组方法培养24 h后，用Trizol试剂提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，分光光度计测定浓度，逆转录为cDNA，获得反应体系模版。α1-Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ-α 1，COL1A1）、RUNX2、ALP、Osteocalcin和内参β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表 1。采用两步法进行分析，反应总体系20 μL，反应条件：预变性95℃、2 min，95℃、15 s，60℃、30 s，40个循环。每个样本设5个复孔。采用2-ΔΔCt标准化法计算各目的基因相对表达量。
表1
RT-qPCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for RT-qPCR
1.5 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 地塞米松对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响
各浓度地塞米松对MC3T3-E1细胞增殖均有抑制作用，且随着浓度增加，细胞活性逐渐降低。0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L浓度组细胞存活率均低于0 μmol/L浓度组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 1。其中0.5、1.0 μmol/L浓度组培养细胞存活率超过80%，故选择1.0 μmol/L作为后续实验用浓度。
图1
不同浓度地塞米松培养24 h后对MC3T3-E1细胞增殖的影响
Figure1.
Effect of different concentrations of dexamethasone on MC3T3-E1 cell proliferation cultured for 24 hours
2.2 茜素红染色
培养6 d时A组细胞死亡；21 d时B、C、D组均可见茜素红阳性染色，且逐渐增强。见图 2。
图2
培养21 d B、C、D组钙结节形成观察（茜素红染色×40） ⓐ B组 ⓑ C组 ⓒ D组 图 3 Western blot检测细胞内RUNX2、Osteocalcin蛋白表达 1：A组 2：B组 3：C组 4：D组 ⓐ RUNX2 ⓑ Osteocalcin
Figure2.
Observation of calcium nodules formation in groups B, C, and D at 21 days (Alizarin red staining×40) ⓐ Group B ⓑ Group C ⓒ Group D Fig. 3 The protein expressions of RUNX2 and Osteocalcin by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ⓐ RUNX2 ⓑ Osteocalcin
2.3 细胞内ALP含量测定
培养24 h后，A、B、C、D组ALP含量分别为3.870±0.135、2.443±0.101、3.310±0.161和3.580±0.155。B、C、D组ALP含量均显著低于A组，B组低于C、D组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；C、D组间差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.4 Western blot检测细胞内RUNX2、Osteocalcin蛋白表达
培养24 h后，A、B、C、D组RUNX2蛋白相对表达量分别为0.725±0.055、0.590±0.067、0.662±0.052、0.723±0.038，B组显著低于A、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；A、C、D组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。A、B、C、D组Osteocalcin蛋白相对表达量分别为0.691±0.084、0.343±0.043、0.688±0.106、1.286±0.125，B组显著低于A、C、D组，A、C组低于D组，差异均有统计学意义（P < 0.05）； A、C组间差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 3。
2.5 RT-qPCR检测细胞内RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因表达
B、C、D组RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因相对表达量均显著低于A组，差异有统计学意义（P < 0.05）。D组RUNX2、Osteocalcin、ALP基因相对表达量均显著高于B、C组，C组显著高于B 组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；D组COL1A1基因相对表达量显著高于B组（P < 0.05），B、C组间及C、D组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
表2
RT-qPCR检测细胞内各基因相对表达量（n=5，3 讨论
激素性骨坏死已成为临床上常见的骨骼疾病，然而其发病机制尚未完全阐明。Ogoshi等[17]发现地塞米松能诱导成骨细胞凋亡，这种作用与地塞米松的浓度密切相关。Weinstein等[18]通过对7月龄鼠连续注射泼尼松龙约4周后，发现鼠椎体成骨细胞凋亡增加3倍，28%的皮质骨干骺端骨细胞凋亡。已有大量研究表明，糖皮质激素能抑制成骨细胞的骨生成活性，促进破骨细胞的骨吸收活性，最终导致骨量不可逆丢失，形成骨质疏松症[19-21]。
BMSCs移植被认为是一项具有前景的治疗骨坏死方法。移植后BMSCs除分化为功能细胞外，其旁分泌作用对周围环境中的细胞亦有重要影响。研究表明，BMSCs的旁分泌作用能促进细胞增殖[22]，并有抗炎、抑制凋亡的作用[23-24]。但BMSCs移植后对糖皮质激素作用的成骨细胞的影响，尚未见文献报道。
成骨细胞功能标志指标较多，其中ALP高表达是成骨细胞分化的特异性标志[25-26]，其含量可间接反映成骨细胞的功能。RUNX2被认为是成骨细胞骨形成过程中其他成骨因子调节的主开关[27]。COL1A1是骨组织中最丰富的细胞外蛋白，并在成骨细胞发育的所有阶段表达[28]。Osteocalcin由成骨细胞分泌，是成骨细胞骨形成的重要标志物[29]。对这些指标的测定能了解成骨细胞的功能。本研究以MC3T3-E1细胞为研究对象，观察BMSCs条件培养基对地塞米松作用MC3T3-E1细胞后，细胞内ALP含量，RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因表达，RUNX2、Osteocalcin蛋白和钙结节形成的影响。结果发现，地塞米松作用后成骨细胞内ALP含量，RUNX2、Osteocalcin蛋白相对表达量及COL1A1、RUNX2、ALP、Osteocalcin基因相对表达量均下降，21 d后钙结节染色减少；同时用BMSCs条件培养基干预时，呈现逆转效应，表现为成骨细胞内ALP含量和上述蛋白、基因表达增多，钙化结节染色增强等效应。因此可认为，BMSCs旁分泌作用能够改善地塞米松所致的成骨细胞成骨功能抑制效应。
综上述，BMSCs条件培养基能够逆转地塞米松所致MC3T3-E1细胞成骨能力下降，BMSCs具有保护成骨细胞免受激素损害而抑制骨坏死的发生，提示BMSCs在移植治疗激素性骨坏死方面具有巨大潜力，但其作用机制尚需进一步研究探讨。
