引用本文： 张晨, 李苗, 马骏, 张二洋, 班文瑞, 吕雷锋, 党晓谦, 王坤正. Wnt/β-catenin信号通路在大鼠早期激素性股骨头缺血性坏死中的作用机制研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(6): 661-668. doi: 10.7507/1002-1892.20160135 复制
研究表明，激素性股骨头缺血性坏死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）与成骨细胞和骨细胞的凋亡存在密切关系[1-4]。糖皮质激素促进骨细胞和成骨细胞凋亡，可能是导致SANFH发生的重要因素之一[5]。Wnt/β-catenin信号通路在多细胞动物中广泛存在，参与调控一些凋亡因子与抗凋亡因子，即Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因，主要有c-Myc、cyclin D1基因等[6-7]。研究表明，Wnt信号通路参与了骨质形成[8]以及BMSCs分化[9-14]。目前共发现了5种Wnt/β-catenin信号通路的胞外拮抗分子，分泌型卷曲相关蛋白（secreted frizzled related proteins，SFRPs）是其中一种，由SFRP1～SFRP5组成，SFRP1能与受体竞争结合Wnt蛋白，有效阻断Wnt信号通路[15]。本实验应用SFRP1作为Wnt/β-catenin信号通路的阻断剂，探讨Wnt/β-catenin信号通路在SANFH中的作用以及在应用SFRP1之后骨坏死程度的改变，为SANFH的诊治研究提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂
12月龄清洁级雄性SD大鼠72只，体质量200～230 g，由西安交通大学实验动物中心提供，实验前适应性喂养1周。脂多糖、人重组SFRP1蛋白、免疫组织化学检测试剂盒、DAB显色试剂盒（Sigma公司，美国）；甲泼尼龙（Pfizer公司，美国）；氨苄青霉素（Genview公司，美国）；TUNEL凋亡试剂盒（Promega公司，美国）；兔抗鼠β-catenin、c-Myc抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（Santa Cruz公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
采用随机数字表法将72只SD大鼠分为3组（n=24），分别为对照组（A组）、模型组（B组）和干预组（C组）。B、C组大鼠采用脂多糖联合甲泼尼龙法制备SANFH模型[16-18]。具体方法：经尾静脉注射脂多糖（10 μg/L），共3次，每次间隔24 h；脂多糖注射结束后开始肌肉注射甲泼尼龙（20 mg/kg），共7 次，每次间隔24 h。B组仅制备SANFH模型；C组在第1次注射甲泼尼龙时，开始在激素注射对侧肢体肌肉注射人重组SFRP1蛋白[1 μg/（kg·d）]，持续30 d[19]。A组于B组各注射时间点同法给予等量生理盐水。为防止感染发生，于第1次注射甲泼尼龙开始，每天肌肉注射10万U青霉素，连续7 d；之后按照相等剂量每周注射2次。实验期间动物均分笼饲养。于末次注射甲泼尼龙后2、4、8 周，各组随机取8只动物，采取脊椎脱臼法处死，切取双侧股骨头标本进行观测。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察B、C组动物造模期间以及造模后存活、饮食、活动等情况。
1.3.2 组织学观察
取左侧股骨头PBS冲洗后，置于4%多聚甲醛固定3 d，EDTA缓冲液脱钙，每2天更换1次脱钙液，观察骨标本表面颜色，应用物理法检测脱钙程度。待组织脱钙完全后，逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，片厚 5 μm。取部分切片行HE染色，镜下观察骨髓细胞以及骨髓内脂肪细胞，骨小梁以及骨细胞。每个样本取3张切片，于200倍镜下随机取10个视野，计数空骨陷窝以及总骨陷窝，并按照以下公式计算空骨陷窝率。空骨陷窝率=空骨陷窝数/总骨陷窝数×100%。取均值。
1.3.3 细胞凋亡染色观察
取部分切片根据TUNEL凋亡试剂盒说明进行染色，镜下观察骨细胞中细胞核染色为棕黄色者为阳性细胞。每个样本取3 张切片，于200倍镜下随机取10个视野，计数阳性细胞以及总细胞，并按照以下公式计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。取均值。
1.3.4 免疫组织化学染色
取部分切片按照SP法行免疫组织化学染色，观测股骨头组织中活性β-catenin、c-Myc表达。镜下观察细胞膜、细胞质及细胞外基质中出现棕黄色反应产物判定为阳性。照相后采用FR-200紫外与可见光分析装置图像分析系统测量图像积分吸光度（IA）值，作为活性β-catenin、c-Myc表达量。
1.3.5 Western blot 检测
取右侧股骨头低温研磨，应用RIPA裂解液低温提取总蛋白，BCA法测定总蛋白量。经制胶、电泳、转膜、封闭后，一抗孵育过夜，二抗孵育。取出聚偏氟乙烯膜，化学发光法获得胶片后进行图像采集，目标条带A值采用 Quantity One 凝胶图像软件分析，以目标条带与β-actin条带 A值的比值作为活性β-catenin、c-Myc相对表达量。
1.4 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
B、C组造模期间共6只动物死亡，3只于注射脂多糖当天死于脂多糖引起的机体急性反应；另3 只分别于末次注射甲泼尼龙后第6、8、9天因感染死亡。同法对动物进行补充。其余动物均存活至实验完成。
注射脂多糖第1、2天B、C组动物出现寒颤、蜷缩，饮食、活动均减少，精神较差；注射甲泼尼龙1周后，各组动物活动、饮食恢复正常，四肢负重未见明显异常；6周后B、C组动物均出现轻度跛行，其余情况正常。
2.2 组织学观察
A组：各时间点骨小梁结构正常，未见紊乱或断裂，未发现空骨陷窝，其中骨陷窝中骨细胞大小、形态均正常，髓腔内造血组织与脂肪组织未见明显变性或坏死。B组：2周时骨小梁出现骨质紊乱，并有部分小梁发生断裂，骨小梁中出现少量空骨陷窝，髓腔内脂肪细胞体积增大，部分融合；4周时空骨陷窝较2周时明显增多，骨髓腔内脂肪细胞增大、增多；8 周时出现坏死骨，骨小梁严重破坏，大量空骨陷窝，骨髓腔内正常造血组织消失。C组：2周时骨组织破坏程度较B组2周时更严重，骨小梁更紊乱，出现少量空骨陷窝；4周时可见较多空骨陷窝，髓腔内造血细胞减少以及脂肪细胞增大、增多；8周时出现严重骨坏死形成，髓腔内造血组织完全消失，并有大量空骨陷窝。见图 1。各时间点C组空骨陷窝率均高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
图1
各时间点各组组织学观察（HE×200） 从左至右分别为A、B、C组 ⓐ 2周 ⓑ 4周 ⓒ 8周 图 2 各时间点各组TUNEL染色观察（×200） 从左至右分别为A、B、C组 ⓐ 2周 ⓑ 4周 ⓒ 8周
Figure1.
Histological observation in every group at each time point (HE×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ⓐ At 2 weeks ⓑ At 4 weeks ⓒ At 8 weeks Fig.2 TUNEL staining in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ⓐ At 2 weeks ⓑ At 4 weeks ⓒ At 8 weeks
表1
各时间点各组空骨陷窝率及细胞凋亡率比较（n=8，%，2.3 细胞凋亡染色观察
A组各时间点未见凋亡细胞异常增多，B、C组随时间延长凋亡细胞均逐渐增多（图 2）。各时间点C组细胞凋亡率均高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
2.4 免疫组织化学染色观察
随时间延长，A组活性β-catenin、c-Myc表达未见显著变化，B、C组活性β-catenin、c-Myc表达逐渐降低（图 3、4）。各时间点C组活性β-catenin及c-Myc表达水平均低于A、B组，B组低于A组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 5、6。
图3
各时间点各组活性β-catenin免疫组织化学染色观察（×200） 从左至右分别为A、B、C组 ⓐ 2周 ⓑ 4周 ⓒ 8周 图 4 各时间点各组活性c-Myc免疫组织化学染色观察（×200） 从左至右分别为A、B、C组 ⓐ 2周 ⓑ 4周 ⓒ 8周
Figure3.
Immunohistochemical staining of activated β-catenin in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ⓐ At 2 weeks ⓑ At 4 weeks ⓒ At 8 weeks Fig. 4 Immunohistochemical staining of activated c-Myc in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ⓐ At 2 weeks ⓑ At 4 weeks ⓒ At 8 weeks
图5
免疫组织化学染色检测各时间点各组活性β-catenin表达量 图 6 免疫组织化学染色检测各时间点各组活性c-Myc表达量 图 7 Western blot检测各时间点各组活性β-catenin、c-Myc表达 1：A组 2：B组 3：C组 ⓐ 2周 ⓑ 4周 ⓒ 8周 图 8 各时间点各组活性β-catenin 相对表达量 图 9 各时间点各组活性c-Myc 相对表达量
Figure5.
Comparison of expression of activated β-catenin between groups at each time point by immunohistochemical staining Fig. 6 Comparison of expression of activated c-Myc between groups at each time point by immunohistochemical staining Fig. 7 Expression of activated β-catenin and c-Myc in every group at each time point by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C ⓐ At 2 weeks ⓑ At 4 weeks ⓒ At 8 weeks Fig. 8 Comparison of relative expression of activated β-catenin between groups at each time point Fig. 9 Comparison of relative expression of activated c-Myc between groups at each time point
2.5 Western blot 检测
各时间点，A组均见活性β-catenin、c-Myc表达，且表达程度无明显变化；B、C组随时间延长活性β-catenin、c-Myc表达逐渐降低（图 7）。各时间点C组活性β-catenin、c-Myc相对表达量均明显低于A、B组，B组低于A组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05) 。见图 8、9。
3 讨论
目前，SANFH的发生机制尚未阐明，由此产生了相关学说，比如脂肪栓塞学说、血管内凝血学说、骨内高压理论学说、骨质疏松学说、免疫因素紊乱学说等。Weinstein等[20]发现由激素所致的股骨头坏死组织切片中出现了大量骨细胞凋亡，而其他因素所致的股骨头坏死切片中未见或少见凋亡骨细胞。激素具有使细胞凋亡的潜在诱导作用，能促进骨细胞和成骨细胞凋亡，这可能是导致股骨头发生坏死的重要因素之一[5]。本研究中，B、C组TUNEL染色显示了明显的细胞凋亡表现，提示股骨头坏死发病过程中，细胞凋亡机制存在并产生一定作用。
Wnt/β-catenin信号通路在多细胞动物中广泛存在，是一条非常保守的信号通路，参与了机体组织动态平衡的维持以及胚胎形成中许多发育过程，同时还能调控一些凋亡因子与抗凋亡因子。Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因主要有c-Myc、cyclin D1基因等[6-7]。Wnt蛋白的主要受体为卷曲蛋白（frizzled，Frz），是一种7次跨膜的受体蛋白，另外还存在一个辅助受体，即低密度脂蛋白受体相关蛋白（lowdensity lipoprotein receptor related protein，LRP）。上述受体与骨密度变化相关，敲除LRP5基因的小鼠骨质会减少，而过度表达LRP5可以增加骨量、减少成骨细胞的凋亡[21]。Wnt/β-catenin信号通路未被抑制时，Wnt能与Frz、LPR5/6结合，进而使β-catenin降解复合物的形成受到抑制，保持β-catenin细胞质浓度在较高水平，促使一部分β-catenin能够顺利转入细胞核内，与TCF/LEF形成复合体，介导相关基因如Bcl-2、c-Myc、cyclin D1等的表达，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和活化[7]。Wnt不表达或其作用被拮抗剂抑制时，本被抑制的β-catenin降解复合物将被激活，使细胞质内的β-catenin发生降解，细胞凋亡增加。本研究结果显示，随时间延长B组活性β-catenin、c-Myc表达逐渐降低，各时间点均显著低于A组。B组Wnt/β-catenin 信号通路相关信号分子表达异常，提示异常的Wnt/β-catenin 信号通路参与了早期股骨头坏死的发生。
Wnt/β-catenin信号通路存在许多拮抗分子对其进行负性调节，本实验使用的SFRP1是目前可以商业化购买的Wnt/β-catenin信号通路的细胞外拮抗分子。 SFRP蛋白属于分泌性糖蛋白家族，位于染色体8p12-11.1[22-23]。SFRP 受体可以竞争性或直接抑制Wnt 蛋白，从而阻断Wnt表达。肿瘤学研究表明，SFRP1表观遗传学的改变以及表达下调会导致Wnt信号转导途径失调，进而诱发肿瘤（如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肝癌等）发生[24]。研究表明，SFRP1对Wnt/β-catenin信号通路的负性调节可以导致骨细胞凋亡，骨量丢失，介导骨质疏松发病过程[25-27]，敲除L RP1基因小鼠会出现明显的骨密度增加及骨形成活跃，同时会加速骨折愈合[28-31]。本研究使用SFRP1作为Wnt通路抑制剂，干预C组模型动物，结果提示C组空骨陷窝率、细胞凋亡率均高于B组，骨坏死以及骨细胞凋亡程度更高；同时C组活性β-catenin、c-Myc表达较B组更低，信号通路表达异常与骨坏死发生增加具有一定相关性。上述结果提示，SFRP1对Wnt/β-catenin 信号通路起到了抑制作用，加剧了股骨头坏死的发生。
通过本实验我们发现在SANFH中存在着细胞凋亡现象，激素的使用造成骨坏死，导致了更多的细胞凋亡，且引起了Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白β-catenin、c-Myc的表达降低。在使用SFRP1将Wnt/β-catenin信号通路阻断时，β-catenin、c-Myc的表达进一步下降，且出现了更多的细胞凋亡和更严重的骨坏死。提示Wnt/β-catenin信号通路的异常参与了SANFH早期病变，作用机制可能与其调控c-Myc的表达，导致骨细胞凋亡有关。然而，激素影响Wnt/β-catenin信号通路的具体机制、其他类型的股骨头缺血性坏死中是否也存在Wnt/β-catenin信号通路的异常，以及SFRP1是否通过其他通路导致骨坏死，还有待进一步实验研究。
研究表明，激素性股骨头缺血性坏死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）与成骨细胞和骨细胞的凋亡存在密切关系[1-4]。糖皮质激素促进骨细胞和成骨细胞凋亡，可能是导致SANFH发生的重要因素之一[5]。Wnt/β-catenin信号通路在多细胞动物中广泛存在，参与调控一些凋亡因子与抗凋亡因子，即Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因，主要有c-Myc、cyclin D1基因等[6-7]。研究表明，Wnt信号通路参与了骨质形成[8]以及BMSCs分化[9-14]。目前共发现了5种Wnt/β-catenin信号通路的胞外拮抗分子，分泌型卷曲相关蛋白（secreted frizzled related proteins，SFRPs）是其中一种，由SFRP1～SFRP5组成，SFRP1能与受体竞争结合Wnt蛋白，有效阻断Wnt信号通路[15]。本实验应用SFRP1作为Wnt/β-catenin信号通路的阻断剂，探讨Wnt/β-catenin信号通路在SANFH中的作用以及在应用SFRP1之后骨坏死程度的改变，为SANFH的诊治研究提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂
12月龄清洁级雄性SD大鼠72只，体质量200～230 g，由西安交通大学实验动物中心提供，实验前适应性喂养1周。脂多糖、人重组SFRP1蛋白、免疫组织化学检测试剂盒、DAB显色试剂盒（Sigma公司，美国）；甲泼尼龙（Pfizer公司，美国）；氨苄青霉素（Genview公司，美国）；TUNEL凋亡试剂盒（Promega公司，美国）；兔抗鼠β-catenin、c-Myc抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（Santa Cruz公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
采用随机数字表法将72只SD大鼠分为3组（n=24），分别为对照组（A组）、模型组（B组）和干预组（C组）。B、C组大鼠采用脂多糖联合甲泼尼龙法制备SANFH模型[16-18]。具体方法：经尾静脉注射脂多糖（10 μg/L），共3次，每次间隔24 h；脂多糖注射结束后开始肌肉注射甲泼尼龙（20 mg/kg），共7 次，每次间隔24 h。B组仅制备SANFH模型；C组在第1次注射甲泼尼龙时，开始在激素注射对侧肢体肌肉注射人重组SFRP1蛋白[1 μg/（kg·d）]，持续30 d[19]。A组于B组各注射时间点同法给予等量生理盐水。为防止感染发生，于第1次注射甲泼尼龙开始，每天肌肉注射10万U青霉素，连续7 d；之后按照相等剂量每周注射2次。实验期间动物均分笼饲养。于末次注射甲泼尼龙后2、4、8 周，各组随机取8只动物，采取脊椎脱臼法处死，切取双侧股骨头标本进行观测。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察B、C组动物造模期间以及造模后存活、饮食、活动等情况。
1.3.2 组织学观察
取左侧股骨头PBS冲洗后，置于4%多聚甲醛固定3 d，EDTA缓冲液脱钙，每2天更换1次脱钙液，观察骨标本表面颜色，应用物理法检测脱钙程度。待组织脱钙完全后，逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，片厚 5 μm。取部分切片行HE染色，镜下观察骨髓细胞以及骨髓内脂肪细胞，骨小梁以及骨细胞。每个样本取3张切片，于200倍镜下随机取10个视野，计数空骨陷窝以及总骨陷窝，并按照以下公式计算空骨陷窝率。空骨陷窝率=空骨陷窝数/总骨陷窝数×100%。取均值。
1.3.3 细胞凋亡染色观察
取部分切片根据TUNEL凋亡试剂盒说明进行染色，镜下观察骨细胞中细胞核染色为棕黄色者为阳性细胞。每个样本取3 张切片，于200倍镜下随机取10个视野，计数阳性细胞以及总细胞，并按照以下公式计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。取均值。
1.3.4 免疫组织化学染色
取部分切片按照SP法行免疫组织化学染色，观测股骨头组织中活性β-catenin、c-Myc表达。镜下观察细胞膜、细胞质及细胞外基质中出现棕黄色反应产物判定为阳性。照相后采用FR-200紫外与可见光分析装置图像分析系统测量图像积分吸光度（IA）值，作为活性β-catenin、c-Myc表达量。
1.3.5 Western blot 检测
取右侧股骨头低温研磨，应用RIPA裂解液低温提取总蛋白，BCA法测定总蛋白量。经制胶、电泳、转膜、封闭后，一抗孵育过夜，二抗孵育。取出聚偏氟乙烯膜，化学发光法获得胶片后进行图像采集，目标条带A值采用 Quantity One 凝胶图像软件分析，以目标条带与β-actin条带 A值的比值作为活性β-catenin、c-Myc相对表达量。
1.4 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
B、C组造模期间共6只动物死亡，3只于注射脂多糖当天死于脂多糖引起的机体急性反应；另3 只分别于末次注射甲泼尼龙后第6、8、9天因感染死亡。同法对动物进行补充。其余动物均存活至实验完成。
注射脂多糖第1、2天B、C组动物出现寒颤、蜷缩，饮食、活动均减少，精神较差；注射甲泼尼龙1周后，各组动物活动、饮食恢复正常，四肢负重未见明显异常；6周后B、C组动物均出现轻度跛行，其余情况正常。
2.2 组织学观察
A组：各时间点骨小梁结构正常，未见紊乱或断裂，未发现空骨陷窝，其中骨陷窝中骨细胞大小、形态均正常，髓腔内造血组织与脂肪组织未见明显变性或坏死。B组：2周时骨小梁出现骨质紊乱，并有部分小梁发生断裂，骨小梁中出现少量空骨陷窝，髓腔内脂肪细胞体积增大，部分融合；4周时空骨陷窝较2周时明显增多，骨髓腔内脂肪细胞增大、增多；8 周时出现坏死骨，骨小梁严重破坏，大量空骨陷窝，骨髓腔内正常造血组织消失。C组：2周时骨组织破坏程度较B组2周时更严重，骨小梁更紊乱，出现少量空骨陷窝；4周时可见较多空骨陷窝，髓腔内造血细胞减少以及脂肪细胞增大、增多；8周时出现严重骨坏死形成，髓腔内造血组织完全消失，并有大量空骨陷窝。见图 1。各时间点C组空骨陷窝率均高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
图1
各时间点各组组织学观察（HE×200） 从左至右分别为A、B、C组 ⓐ 2周 ⓑ 4周 ⓒ 8周 图 2 各时间点各组TUNEL染色观察（×200） 从左至右分别为A、B、C组 ⓐ 2周 ⓑ 4周 ⓒ 8周
Figure1.
Histological observation in every group at each time point (HE×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ⓐ At 2 weeks ⓑ At 4 weeks ⓒ At 8 weeks Fig.2 TUNEL staining in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ⓐ At 2 weeks ⓑ At 4 weeks ⓒ At 8 weeks
表1
各时间点各组空骨陷窝率及细胞凋亡率比较（n=8，%，2.3 细胞凋亡染色观察
A组各时间点未见凋亡细胞异常增多，B、C组随时间延长凋亡细胞均逐渐增多（图 2）。各时间点C组细胞凋亡率均高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
2.4 免疫组织化学染色观察
随时间延长，A组活性β-catenin、c-Myc表达未见显著变化，B、C组活性β-catenin、c-Myc表达逐渐降低（图 3、4）。各时间点C组活性β-catenin及c-Myc表达水平均低于A、B组，B组低于A组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图 5、6。
图3
各时间点各组活性β-catenin免疫组织化学染色观察（×200） 从左至右分别为A、B、C组 ⓐ 2周 ⓑ 4周 ⓒ 8周 图 4 各时间点各组活性c-Myc免疫组织化学染色观察（×200） 从左至右分别为A、B、C组 ⓐ 2周 ⓑ 4周 ⓒ 8周
Figure3.
Immunohistochemical staining of activated β-catenin in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ⓐ At 2 weeks ⓑ At 4 weeks ⓒ At 8 weeks Fig. 4 Immunohistochemical staining of activated c-Myc in every group at each time point (×200) From left to right was groups A, B, and C, respectively ⓐ At 2 weeks ⓑ At 4 weeks ⓒ At 8 weeks
图5
免疫组织化学染色检测各时间点各组活性β-catenin表达量 图 6 免疫组织化学染色检测各时间点各组活性c-Myc表达量 图 7 Western blot检测各时间点各组活性β-catenin、c-Myc表达 1：A组 2：B组 3：C组 ⓐ 2周 ⓑ 4周 ⓒ 8周 图 8 各时间点各组活性β-catenin 相对表达量 图 9 各时间点各组活性c-Myc 相对表达量
Figure5.
Comparison of expression of activated β-catenin between groups at each time point by immunohistochemical staining Fig. 6 Comparison of expression of activated c-Myc between groups at each time point by immunohistochemical staining Fig. 7 Expression of activated β-catenin and c-Myc in every group at each time point by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C ⓐ At 2 weeks ⓑ At 4 weeks ⓒ At 8 weeks Fig. 8 Comparison of relative expression of activated β-catenin between groups at each time point Fig. 9 Comparison of relative expression of activated c-Myc between groups at each time point
2.5 Western blot 检测
各时间点，A组均见活性β-catenin、c-Myc表达，且表达程度无明显变化；B、C组随时间延长活性β-catenin、c-Myc表达逐渐降低（图 7）。各时间点C组活性β-catenin、c-Myc相对表达量均明显低于A、B组，B组低于A组，比较差异均有统计学意义（P < 0.05) 。见图 8、9。
3 讨论
目前，SANFH的发生机制尚未阐明，由此产生了相关学说，比如脂肪栓塞学说、血管内凝血学说、骨内高压理论学说、骨质疏松学说、免疫因素紊乱学说等。Weinstein等[20]发现由激素所致的股骨头坏死组织切片中出现了大量骨细胞凋亡，而其他因素所致的股骨头坏死切片中未见或少见凋亡骨细胞。激素具有使细胞凋亡的潜在诱导作用，能促进骨细胞和成骨细胞凋亡，这可能是导致股骨头发生坏死的重要因素之一[5]。本研究中，B、C组TUNEL染色显示了明显的细胞凋亡表现，提示股骨头坏死发病过程中，细胞凋亡机制存在并产生一定作用。
Wnt/β-catenin信号通路在多细胞动物中广泛存在，是一条非常保守的信号通路，参与了机体组织动态平衡的维持以及胚胎形成中许多发育过程，同时还能调控一些凋亡因子与抗凋亡因子。Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因主要有c-Myc、cyclin D1基因等[6-7]。Wnt蛋白的主要受体为卷曲蛋白（frizzled，Frz），是一种7次跨膜的受体蛋白，另外还存在一个辅助受体，即低密度脂蛋白受体相关蛋白（lowdensity lipoprotein receptor related protein，LRP）。上述受体与骨密度变化相关，敲除LRP5基因的小鼠骨质会减少，而过度表达LRP5可以增加骨量、减少成骨细胞的凋亡[21]。Wnt/β-catenin信号通路未被抑制时，Wnt能与Frz、LPR5/6结合，进而使β-catenin降解复合物的形成受到抑制，保持β-catenin细胞质浓度在较高水平，促使一部分β-catenin能够顺利转入细胞核内，与TCF/LEF形成复合体，介导相关基因如Bcl-2、c-Myc、cyclin D1等的表达，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和活化[7]。Wnt不表达或其作用被拮抗剂抑制时，本被抑制的β-catenin降解复合物将被激活，使细胞质内的β-catenin发生降解，细胞凋亡增加。本研究结果显示，随时间延长B组活性β-catenin、c-Myc表达逐渐降低，各时间点均显著低于A组。B组Wnt/β-catenin 信号通路相关信号分子表达异常，提示异常的Wnt/β-catenin 信号通路参与了早期股骨头坏死的发生。
Wnt/β-catenin信号通路存在许多拮抗分子对其进行负性调节，本实验使用的SFRP1是目前可以商业化购买的Wnt/β-catenin信号通路的细胞外拮抗分子。 SFRP蛋白属于分泌性糖蛋白家族，位于染色体8p12-11.1[22-23]。SFRP 受体可以竞争性或直接抑制Wnt 蛋白，从而阻断Wnt表达。肿瘤学研究表明，SFRP1表观遗传学的改变以及表达下调会导致Wnt信号转导途径失调，进而诱发肿瘤（如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肝癌等）发生[24]。研究表明，SFRP1对Wnt/β-catenin信号通路的负性调节可以导致骨细胞凋亡，骨量丢失，介导骨质疏松发病过程[25-27]，敲除L RP1基因小鼠会出现明显的骨密度增加及骨形成活跃，同时会加速骨折愈合[28-31]。本研究使用SFRP1作为Wnt通路抑制剂，干预C组模型动物，结果提示C组空骨陷窝率、细胞凋亡率均高于B组，骨坏死以及骨细胞凋亡程度更高；同时C组活性β-catenin、c-Myc表达较B组更低，信号通路表达异常与骨坏死发生增加具有一定相关性。上述结果提示，SFRP1对Wnt/β-catenin 信号通路起到了抑制作用，加剧了股骨头坏死的发生。
通过本实验我们发现在SANFH中存在着细胞凋亡现象，激素的使用造成骨坏死，导致了更多的细胞凋亡，且引起了Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白β-catenin、c-Myc的表达降低。在使用SFRP1将Wnt/β-catenin信号通路阻断时，β-catenin、c-Myc的表达进一步下降，且出现了更多的细胞凋亡和更严重的骨坏死。提示Wnt/β-catenin信号通路的异常参与了SANFH早期病变，作用机制可能与其调控c-Myc的表达，导致骨细胞凋亡有关。然而，激素影响Wnt/β-catenin信号通路的具体机制、其他类型的股骨头缺血性坏死中是否也存在Wnt/β-catenin信号通路的异常，以及SFRP1是否通过其他通路导致骨坏死，还有待进一步实验研究。
