引用本文： 阮洪江, 范大鹏, 陈帅, 李旭军, 范存义. miRNA219-5P靶向调控Smad4表达影响TGF-β1诱导肌腱成纤维细胞纤维化的研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(5): 641-646. doi: 10.7507/1002-1892.20160128 复制
肌腱损伤修复术后常存在肌腱与周围组织粘连，严重影响患者肢体功能。研究表明，大量细胞因子可能参与了粘连形成，其中TGF-β与组织器官纤维化关系最密切[1-3]，TGF-β/Smad信号通路是组织粘连形成中的重要作用通路。TGF-β信号通路的关键传导分子为细胞质Smads蛋白家族，它们可将TGF-β信号直接由细胞膜受体传导入细胞核内[4-5]。TGF-β与受体TβRⅠ结合后，激活TβRⅡ受体的丝氨酸/苏氨酸激酶，Smad2、3蛋白被磷酸化，活化的Smad2、3与Smad4结合形成活性转录复合物进入细胞核内，与相应DNA直接结合，启动或抑制转录因子而发挥作用，例如与胶原和纤溶酶原激活物抑制物1基因启动子结合，促进基质合成增加、降解减少[6-7]。
我们应用生物信息学预测Smad4基因3’UTR区存在理论靶位的miRNA；通过检测患者肌腱修复后腱周粘连组织发现，与正常腱周组织相比，Smad4蛋白含量增高而miRNA219-5P（miR219-5P）表达降低，二者成负相关。但Smad4的异常主要表现为蛋白表达，转录水平则无明显变化，提示Samd4异常为转录后调控，而miRNA调控可能为潜在的机制之一。为此，本研究通过过表达或抑制miR219-5P，观察TGF-β1诱导人肌腱成纤维细胞（tendon derived fibroblasts，TDFs）纤维化相关指标的变化，探讨miR219-5P通过调控靶基因Smad4表达在肌腱成纤维化过程中的作用及机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
RPMI-1640培养基、FBS、0.25%胰蛋白酶、Lipofectamine2000转染试剂、RNA提取试剂Trizol（Invitrogen公司，美国）；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、PGL3-promoter/TK表达载体（Promega公司，美国）；荧光定量检测试剂盒（宝生物工程大连有限公司）；细胞活性检测试剂盒（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；蛋白一抗及二抗（Abcam公司，美国）；Ⅰ型胶原酶（Sigma公司，美国）；TGF-β1重组蛋白、动物蛋白提取定量试剂盒、ECL发光试剂盒（Pierce公司，美国）。
细胞培养箱（SANYO公司，日本）；低温高速离心机（Ependorf公司，德国）；电泳仪、转膜仪（上海天能科技有限公司）；miRNA合成及测序由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 细胞分离培养
肌腱组织由2014年2月－2015年1月于上海交通大学附属第六人民医院行上肢截肢手术患者自愿捐赠。取手部屈肌腱中间部分，切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，每100 毫克组织样品加入3 mgⅠ型胶原酶于37℃消化1 h。室温以1 500×g离心15 min，弃上清液，使用10 mL含20% FBS的DMEM培养基重悬沉淀，接种于细胞培养瓶，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，细胞贴壁后每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态，肌腱细胞贴于培养瓶底>80%后，用0.125% 胰蛋白酶消化传代，取第3代细胞进行后续实验。
1.3 细胞转染及检测
1.3.1 细胞转染
化学合成miRNA序列：miR219-5P类似物（mimics），5'-UGAUUGUCCAAACGCAA-UUCUtt-3'；miR219-5P阻遏物（inhibitor），5'-AGAA-UUGCGUUUGGACAAUCAtt-3’；阴性对照（negative control，NC），5'-AUACUGCUCAGAAUUGUACUCtt-3'。其中mimics合成互补的2条单链，转染实验前退火形成双链。取对数生长期TDFs，使用含10%FBS的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1×105 个/mL，接种至6孔板，每孔2 mL；置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养24 h后进行RNA转染实验，转染过程严格按照转染试剂Lipofectamine2000说明书进行。根据转染引物不同，分为mimics转染组、inhibitor转染组、NC转染组，并取未转染细胞作为空白对照组。转染48 h取细胞进行相关检测。
1.3.2 实时定量PCR检测miR219-5P含量
弃培养基，每孔加入1 mL 4℃预冷的dPBS，洗去细胞表面残留的培养基和血清。每孔加入1 mL 4℃预冷的Trizol，使用1 mL移液器反复吹打细胞，直至液体变得黏稠、透明，将裂解液转移至1.5 mL无菌离心管，按照Trizol说明书提取细胞总RNA。总RNA提取完成后，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带完整性，紫外分光光度计检测RNA浓度，取1 μg RNA反转录制备cDNA，使用特异性反转录引物：U6 primer，5'-GTTTAAGCACTTCGCAAGGTA-3'；miR219-5P primer，5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGAATT-3'。反转录完成后，每样本取2 μL反转录产物作为模板，进行定量PCR反应。以U6作为对照，通过Ct值进行数据分析。通过扩增曲线与阈值线的交点来计算每组样本Ct值，目的基因相对于内参基因的表达量为2ΔΔCt。
1.3.3 Western blot检测Smad4蛋白含量
弃培养基，每孔加入1 mL 4℃预冷的dPBS，洗去细胞表面残留的血清及培养基。每孔加入1 mL细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测总蛋白浓度。每组取10 μL样本进行10%SDS-PAGE垂直电泳，湿法将胶中蛋白水平转移至聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶常温封闭2 h，加入TBST稀释后的Smad4一抗（1∶500），4℃过夜；取出后TBST洗膜3次，再加入羊抗鼠二抗（1∶3 000），孵育2 h，洗膜3次，添加ECL发光液反应底物，进行X光曝片，目的条带经扫描后通过光密度分析软件进行分析，蛋白相对表达量为目的条带与GAPDH条带吸光度（A）值的比值。
1.4 靶基因鉴定实验
1.4.1 报告基因表达载体制备
根据Smad4基因序列信息（NM_005359.5），使用TargetScan软件预测Smad4基因3’UTR与miR219-5P可能存在的结合位点，结合位点5'-GACAAUCA-3'位于Smad4基因3’UTR区的第5042-5049位。设计包含结合位点在内的56个碱基序列，合成互补的2条长链DNA，长链DNA两端包含酶切位点，2条单链经退火后形成双链DNA并克隆至荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Promoter，构建野生型报告基因表达载体pGL3-WT-Smad4。使用点突变的方法对种子区序列进行突变，即将结合位点5'-GACAATCA-3'错义突变为5'-CACAAGAT-3'，构建突变型报告基因表达载体pGL3-MT-Smad4。重组载体经过序列分析后进行无内毒素质粒DNA制备。
1.4.2 双荧光素酶报告基因检测
根据转染的miRNA及重组质粒不同，将实验分为9组：空白对照组（a组）、pGL3-WT-Smad4转染组（b组）、pGL3-MT-Smad4转染组（c组）、pGL3-WT-Smad4+mimics转染组（d组）、pGL3-MT-Smad4+mimics转染组（e组）、pGL3-WT-Smad4+inhibitor转染组（f组）、pGL3-MT-Smad4+inhibitor转染组（g组）、pGL3-WT-Smad4+NC转染组（h组）以及pGL3-MT-Smad4+NC转染组（i组）。
具体方法：a组为正常培养的TDFs；其余各组分别对应取对数生长期正常TDFs及1.3中获得的转染24 h的mimics转染组、inhibitor转染组、NC转染组TDFs，0.125%胰蛋白酶消化法制备浓度为1×106 个/mL的细胞悬液，接种至96孔板，每孔100 μL。于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养24 h后，进行质粒DNA及RNA共转染实验，每组细胞转染0.1 μg pGL-TK作为荧光参照，每孔转染试剂Lipofectamine2000 4 μL、质粒DNA 0.8 μg，RNA（mimics、inhibitor和NC）为20 pmol。转染时，分别使用25 μL Opti-MEM培养基稀释转染试剂、质粒DNA及RNA；得到的稀释产物室温放置5 min后混匀，再放置20 min后加入细胞培养基（转染实验前使用含10%FBS的DMEM培养基对细胞进行换液），转染24 h后使用含10%FBS的DMEM培养基对细胞进行换液。转染48 h后使用双荧光素酶检测系统和荧光素酶检测仪进行荧光素酶含量检测。
1.5 miR219-5P表达干预实验
1.5.1 TGF-β1诱导建立纤维化模型
实验分为5 组：空白对照组（A组，正常TDFs）、直接诱导组（B组，TDFs+TGF-β1）、miR219-5P过表达且诱导组（C组，TDFs+mimics+TGF-β1），miR219-5P表达抑制且诱导组（D组，TDFs+inhibitor+TGF-β1） 以及阴性对照且诱导组（E组，TDFs+NC+TGF-β1）。取正常TDFs以及1.3中获得的转染24 h的mimics转染组、inhibitor转染组、NC转染组TDFs，0.125%胰蛋白酶消化法制备浓度为1×106个/mL的细胞悬液，接种至96孔板，每孔100 μL。采用含终浓度为50 ng/ mL TGF-β1及20%FBS的DMEM培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养。空白对照组TDFs正常培养。
1.5.2 CCK-8法检测细胞活性
培养24、48、72 h各组分别取8孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内继续培养4 h，用酶标仪测定450 nm处A值，实验重复3次。
1.5.3 Western blot检测细胞纤维化相关蛋白指标
培养72 h取各组细胞提取总蛋白，同1.3.2方法检测Smad4、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原、层粘连蛋白（Laminin，LN）相对含量。
1.6 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，采用析因分析进行组间及组内比较；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 miR219-5P转染后TDFs miR219-5P及Smad4蛋白含量检测
转染48 h，实时定量PCR检测示，空白对照组、mimics转染组、inhibitor转染组、NC转染组miR219-5P相对表达量分别为1.00±0.22、4.64±0.61、0.34±0.11、1.05±0.21。与空白对照组及NC转染组比较，mimics转染组miR219-5P相对表达量明显上升，inhibitor转染组明显下降，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；NC转染组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
Western blot检测示，空白对照组、mimics转染组、inhibitor转染组、NC转染组Smad4蛋白相对表达量分别为1.00±0.18、0.42±0.15、4.32±0.47、0.91±0.21。与空白对照组及NC转染组比较，mimics转染组Smad4蛋白相对表达量明显下降，inhibitor转染组明显上升，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；NC转染组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1。
图1
Western blot检测各组TDFs Smad4蛋白表达 1：空白对照组 2：mimics转染组 3：inhibitor转染组 4：NC转染组 图 2 荧光素酶活性检测miR219-5P与Smad4 结合靶位
Figure1.
Expressions of Smad4 after miR219-5P transfection by Western blot 1: Blank control group 2: Mimics transfection group 3: Inhibitor transfection group 4: NC transfection group Fig. 2 The binding sites of miR219-5P and Smad4 by the luciferase activity detection
2.2 靶基因鉴定实验
荧光素酶活性检测结果显示，与b组比较，d组细胞内荧光素酶含量降低，f组细胞内荧光素酶含量升高，比较差异有统计学意义（P<0.05）。c、e、g组组间比较无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。b、c、h、i组间比较细胞内荧光素酶含量，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
2.3 miR219-5P表达干预实验
2.3.1 CCK-8法检测细胞活性
培养24、48 h，各组细胞A值比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。培养72 h，各组细胞增殖活性明显增强，B组A值显著高于A组，差异有统计学意义（P<0.01）；与B组比较，C组细胞增殖活性升高趋势得到抑制，而D组细胞增殖活性则进一步增强，差异均有统计学意义（P<0.01）；E组与B组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
图2
CCK-8法检测各组细胞增殖活性 图 4 Western blot检测各组细胞纤维化相关蛋白电泳图 1：A组 2：B组 3：C组 4：D组 5：E组 图 5 Western blot检测各组细胞纤维化相关蛋白相对表达量比较 ⓐSmad4 ⓑα-SMA ⓒⅠ型胶原 ⓓLN
Figure2.
Cell proliferation assay in each group by CCK-8 Fig. 4 Electrophoresis of relative proteins of TDFs fibrosis by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E Fig. 5 Relative expressions of relative proteins of TDFs fibrosis by Western blot ⓐSmad4 ⓑα-SMA ⓒCollagen type I ⓓLN
2.3.2 Western blot检测细胞纤维化相关蛋白指标
培养72 h，B组Smad4、α-SMA、Ⅰ型胶原和LN蛋白相对表达量均显著高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）；与B组比较，C组以上蛋白相对表达量降低，D组相对表达量增加，差异均有统计学意义（P<0.05）；E组与B组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 4、5。
3 讨论
临床肌腱粘连防治疗效的提高有赖于对其发生机制的深入研究。目前，通过调控细胞因子的表达、抑制组织纤维细胞增殖来预防肌腱粘连的研究较多[8-14]。TGF-β/Smad信号转导通路是组织纤维化进程中的重要通路，其分子组成及调节比较复杂，与其他信号通路存在广泛的交互影响。随着对miRNA研究的深入，研究者发现miRNA在纤维化相关疾病中起到了极其重要的作用，不仅参与纤维化的发生过程，其表达变化还与纤维化程度密切相关。miRNA是一类长度为18～24个核苷酸的非编码单链RNA分子[15]。目前Sanger miR Base16.0收录的miRNA已有15 000多个，涉及140多个物种。其中人类miRNA已超过1 000个，虽然仅占人类基因组序列的1%～3%，却参与了30%基因表达的调控[16]。
miRNA可以影响TGF-β信号通路的不同位点，Smad4是其中一个重要靶基因[17]。Smad4的MH1 结构域中也存在类似受体激活的Smads (receptor actived Smads，R-Smads)结构中的β发夹结构，具有结合DNA的能力。R-Smads被磷酸化后，Smad4 便与其形成杂聚体，并转位至细胞核调节靶基因的转录。Smad4参与所有的TGF-β超家族信号转导，故称之为共同介体性Smads。近年来，越来越多研究证实miRNA和Smad4表达失调与多种疾病，如癌症、心血管疾病、纤维化疾病等密切相关。Hao等[18- 19]报道在胰腺癌组织中高表达的miRNA-483-3p、miRNA-421与DPC4/Smad4 成负相关，miRNA-483-3p、miRNA-421通过负调控DPC4/Smad4蛋白水平的表达，调节细胞生长及克隆形成率，以及对Smad4下游的TGF-β/BMP通路有抑制作用。He等[20]报道miRNA-146a可通过抑制Smad4的表达来阻断TGF-β/Smad信号通路，进而抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖。因此，miRNA及Smad4在肌腱粘连过程中可能也起着与上述同样的重要作用。但是，国内外尚未检索到肌腱粘连防治领域miRNA和Smad4在TGF-β/Smad通路中的具体调控机制及相关研究的报道。
我们根据Smad4基因序列信息（NM_005359.5），使用TargetScan软件预测Smad4基因3’UTR与miR219-5P可能存在的结合位点，为明确Smad4 是否为miR219-5P调控的靶基因，本研究使用双荧光素酶检测系统，检测细胞干预前后荧光素酶的变化趋势，通过荧光素酶活性变化判断预测的理论靶位是否存在。结果显示，与pGL3-WT-Smad4转染组比较，miR219-5P mimic能够明显抑制细胞内荧光素酶活性，而miR219-5P inhibitor则会增强荧光素酶表达，且组间比较差异有统计学意义；pGL3-MT-Smad4相关转染组中，miR219-5P mimic和miR219-5P inhibitor对于细胞内荧光素酶活性无明显影响；无论pGL3-WT-Smad4还是pGL3-MT-Smad4，NC共转染组与报告基因表达载体单独转染组细胞内荧光素酶活性均无明显差异。由此表明，Smad4 可能是miR219-5P的靶基因。
为进一步验证miR219-5P与Smad4 在生理状态下是否具有上述靶向调控关系，本研究通过TGF-β1诱导TDFs建立纤维化模型，CCK-8法检测细胞活性，Western blot检测过表达及抑制miR219-5P表达后细胞纤维化相关蛋白指标变化。结果显示，TGF-β1诱导培养72 h后细胞会发生纤维化，具体表现为细胞增殖活性增强及纤维化标志蛋白表达明显增强。过表达miR219-5P可明显抑制TGF-β1诱导的细胞纤维化，这可能与miR219-5P抑制其靶蛋白Smad4的表达有关。Smad4蛋白含量降低，导致其与Smad2/3形成复合物并将其转运至细胞核的能力明显降低，从而抑制了TGF-β1/Smad信号在细胞内的传递，最终抑制了TDFs被诱导的纤维化。
目前研究提示miRNA激动剂或拮抗剂可作为一种新的潜在治疗工具，这为未来miRNA作为一种新的治疗靶点提供了可能。因此，深入探讨miRNA在TGF-β/Smads信号转导通路中信息反馈及交叉调控的机制，有助于进一步揭示肌腱粘连的发生机制奠定基础，可能对肌腱粘连的治疗靶点选择和临床药物开发起到重要作用。
肌腱损伤修复术后常存在肌腱与周围组织粘连，严重影响患者肢体功能。研究表明，大量细胞因子可能参与了粘连形成，其中TGF-β与组织器官纤维化关系最密切[1-3]，TGF-β/Smad信号通路是组织粘连形成中的重要作用通路。TGF-β信号通路的关键传导分子为细胞质Smads蛋白家族，它们可将TGF-β信号直接由细胞膜受体传导入细胞核内[4-5]。TGF-β与受体TβRⅠ结合后，激活TβRⅡ受体的丝氨酸/苏氨酸激酶，Smad2、3蛋白被磷酸化，活化的Smad2、3与Smad4结合形成活性转录复合物进入细胞核内，与相应DNA直接结合，启动或抑制转录因子而发挥作用，例如与胶原和纤溶酶原激活物抑制物1基因启动子结合，促进基质合成增加、降解减少[6-7]。
我们应用生物信息学预测Smad4基因3’UTR区存在理论靶位的miRNA；通过检测患者肌腱修复后腱周粘连组织发现，与正常腱周组织相比，Smad4蛋白含量增高而miRNA219-5P（miR219-5P）表达降低，二者成负相关。但Smad4的异常主要表现为蛋白表达，转录水平则无明显变化，提示Samd4异常为转录后调控，而miRNA调控可能为潜在的机制之一。为此，本研究通过过表达或抑制miR219-5P，观察TGF-β1诱导人肌腱成纤维细胞（tendon derived fibroblasts，TDFs）纤维化相关指标的变化，探讨miR219-5P通过调控靶基因Smad4表达在肌腱成纤维化过程中的作用及机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
RPMI-1640培养基、FBS、0.25%胰蛋白酶、Lipofectamine2000转染试剂、RNA提取试剂Trizol（Invitrogen公司，美国）；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、PGL3-promoter/TK表达载体（Promega公司，美国）；荧光定量检测试剂盒（宝生物工程大连有限公司）；细胞活性检测试剂盒（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；蛋白一抗及二抗（Abcam公司，美国）；Ⅰ型胶原酶（Sigma公司，美国）；TGF-β1重组蛋白、动物蛋白提取定量试剂盒、ECL发光试剂盒（Pierce公司，美国）。
细胞培养箱（SANYO公司，日本）；低温高速离心机（Ependorf公司，德国）；电泳仪、转膜仪（上海天能科技有限公司）；miRNA合成及测序由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 细胞分离培养
肌腱组织由2014年2月－2015年1月于上海交通大学附属第六人民医院行上肢截肢手术患者自愿捐赠。取手部屈肌腱中间部分，切成1 mm×1 mm×1 mm的小块，每100 毫克组织样品加入3 mgⅠ型胶原酶于37℃消化1 h。室温以1 500×g离心15 min，弃上清液，使用10 mL含20% FBS的DMEM培养基重悬沉淀，接种于细胞培养瓶，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养，细胞贴壁后每3天换液1次。倒置相差显微镜下观察细胞形态，肌腱细胞贴于培养瓶底>80%后，用0.125% 胰蛋白酶消化传代，取第3代细胞进行后续实验。
1.3 细胞转染及检测
1.3.1 细胞转染
化学合成miRNA序列：miR219-5P类似物（mimics），5'-UGAUUGUCCAAACGCAA-UUCUtt-3'；miR219-5P阻遏物（inhibitor），5'-AGAA-UUGCGUUUGGACAAUCAtt-3’；阴性对照（negative control，NC），5'-AUACUGCUCAGAAUUGUACUCtt-3'。其中mimics合成互补的2条单链，转染实验前退火形成双链。取对数生长期TDFs，使用含10%FBS的RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1×105 个/mL，接种至6孔板，每孔2 mL；置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养24 h后进行RNA转染实验，转染过程严格按照转染试剂Lipofectamine2000说明书进行。根据转染引物不同，分为mimics转染组、inhibitor转染组、NC转染组，并取未转染细胞作为空白对照组。转染48 h取细胞进行相关检测。
1.3.2 实时定量PCR检测miR219-5P含量
弃培养基，每孔加入1 mL 4℃预冷的dPBS，洗去细胞表面残留的培养基和血清。每孔加入1 mL 4℃预冷的Trizol，使用1 mL移液器反复吹打细胞，直至液体变得黏稠、透明，将裂解液转移至1.5 mL无菌离心管，按照Trizol说明书提取细胞总RNA。总RNA提取完成后，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带完整性，紫外分光光度计检测RNA浓度，取1 μg RNA反转录制备cDNA，使用特异性反转录引物：U6 primer，5'-GTTTAAGCACTTCGCAAGGTA-3'；miR219-5P primer，5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGAATT-3'。反转录完成后，每样本取2 μL反转录产物作为模板，进行定量PCR反应。以U6作为对照，通过Ct值进行数据分析。通过扩增曲线与阈值线的交点来计算每组样本Ct值，目的基因相对于内参基因的表达量为2ΔΔCt。
1.3.3 Western blot检测Smad4蛋白含量
弃培养基，每孔加入1 mL 4℃预冷的dPBS，洗去细胞表面残留的血清及培养基。每孔加入1 mL细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测总蛋白浓度。每组取10 μL样本进行10%SDS-PAGE垂直电泳，湿法将胶中蛋白水平转移至聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶常温封闭2 h，加入TBST稀释后的Smad4一抗（1∶500），4℃过夜；取出后TBST洗膜3次，再加入羊抗鼠二抗（1∶3 000），孵育2 h，洗膜3次，添加ECL发光液反应底物，进行X光曝片，目的条带经扫描后通过光密度分析软件进行分析，蛋白相对表达量为目的条带与GAPDH条带吸光度（A）值的比值。
1.4 靶基因鉴定实验
1.4.1 报告基因表达载体制备
根据Smad4基因序列信息（NM_005359.5），使用TargetScan软件预测Smad4基因3’UTR与miR219-5P可能存在的结合位点，结合位点5'-GACAAUCA-3'位于Smad4基因3’UTR区的第5042-5049位。设计包含结合位点在内的56个碱基序列，合成互补的2条长链DNA，长链DNA两端包含酶切位点，2条单链经退火后形成双链DNA并克隆至荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Promoter，构建野生型报告基因表达载体pGL3-WT-Smad4。使用点突变的方法对种子区序列进行突变，即将结合位点5'-GACAATCA-3'错义突变为5'-CACAAGAT-3'，构建突变型报告基因表达载体pGL3-MT-Smad4。重组载体经过序列分析后进行无内毒素质粒DNA制备。
1.4.2 双荧光素酶报告基因检测
根据转染的miRNA及重组质粒不同，将实验分为9组：空白对照组（a组）、pGL3-WT-Smad4转染组（b组）、pGL3-MT-Smad4转染组（c组）、pGL3-WT-Smad4+mimics转染组（d组）、pGL3-MT-Smad4+mimics转染组（e组）、pGL3-WT-Smad4+inhibitor转染组（f组）、pGL3-MT-Smad4+inhibitor转染组（g组）、pGL3-WT-Smad4+NC转染组（h组）以及pGL3-MT-Smad4+NC转染组（i组）。
具体方法：a组为正常培养的TDFs；其余各组分别对应取对数生长期正常TDFs及1.3中获得的转染24 h的mimics转染组、inhibitor转染组、NC转染组TDFs，0.125%胰蛋白酶消化法制备浓度为1×106 个/mL的细胞悬液，接种至96孔板，每孔100 μL。于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养24 h后，进行质粒DNA及RNA共转染实验，每组细胞转染0.1 μg pGL-TK作为荧光参照，每孔转染试剂Lipofectamine2000 4 μL、质粒DNA 0.8 μg，RNA（mimics、inhibitor和NC）为20 pmol。转染时，分别使用25 μL Opti-MEM培养基稀释转染试剂、质粒DNA及RNA；得到的稀释产物室温放置5 min后混匀，再放置20 min后加入细胞培养基（转染实验前使用含10%FBS的DMEM培养基对细胞进行换液），转染24 h后使用含10%FBS的DMEM培养基对细胞进行换液。转染48 h后使用双荧光素酶检测系统和荧光素酶检测仪进行荧光素酶含量检测。
1.5 miR219-5P表达干预实验
1.5.1 TGF-β1诱导建立纤维化模型
实验分为5 组：空白对照组（A组，正常TDFs）、直接诱导组（B组，TDFs+TGF-β1）、miR219-5P过表达且诱导组（C组，TDFs+mimics+TGF-β1），miR219-5P表达抑制且诱导组（D组，TDFs+inhibitor+TGF-β1） 以及阴性对照且诱导组（E组，TDFs+NC+TGF-β1）。取正常TDFs以及1.3中获得的转染24 h的mimics转染组、inhibitor转染组、NC转染组TDFs，0.125%胰蛋白酶消化法制备浓度为1×106个/mL的细胞悬液，接种至96孔板，每孔100 μL。采用含终浓度为50 ng/ mL TGF-β1及20%FBS的DMEM培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养。空白对照组TDFs正常培养。
1.5.2 CCK-8法检测细胞活性
培养24、48、72 h各组分别取8孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内继续培养4 h，用酶标仪测定450 nm处A值，实验重复3次。
1.5.3 Western blot检测细胞纤维化相关蛋白指标
培养72 h取各组细胞提取总蛋白，同1.3.2方法检测Smad4、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原、层粘连蛋白（Laminin，LN）相对含量。
1.6 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，采用析因分析进行组间及组内比较；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 miR219-5P转染后TDFs miR219-5P及Smad4蛋白含量检测
转染48 h，实时定量PCR检测示，空白对照组、mimics转染组、inhibitor转染组、NC转染组miR219-5P相对表达量分别为1.00±0.22、4.64±0.61、0.34±0.11、1.05±0.21。与空白对照组及NC转染组比较，mimics转染组miR219-5P相对表达量明显上升，inhibitor转染组明显下降，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；NC转染组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
Western blot检测示，空白对照组、mimics转染组、inhibitor转染组、NC转染组Smad4蛋白相对表达量分别为1.00±0.18、0.42±0.15、4.32±0.47、0.91±0.21。与空白对照组及NC转染组比较，mimics转染组Smad4蛋白相对表达量明显下降，inhibitor转染组明显上升，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；NC转染组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1。
图1
Western blot检测各组TDFs Smad4蛋白表达 1：空白对照组 2：mimics转染组 3：inhibitor转染组 4：NC转染组 图 2 荧光素酶活性检测miR219-5P与Smad4 结合靶位
Figure1.
Expressions of Smad4 after miR219-5P transfection by Western blot 1: Blank control group 2: Mimics transfection group 3: Inhibitor transfection group 4: NC transfection group Fig. 2 The binding sites of miR219-5P and Smad4 by the luciferase activity detection
2.2 靶基因鉴定实验
荧光素酶活性检测结果显示，与b组比较，d组细胞内荧光素酶含量降低，f组细胞内荧光素酶含量升高，比较差异有统计学意义（P<0.05）。c、e、g组组间比较无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。b、c、h、i组间比较细胞内荧光素酶含量，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
2.3 miR219-5P表达干预实验
2.3.1 CCK-8法检测细胞活性
培养24、48 h，各组细胞A值比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。培养72 h，各组细胞增殖活性明显增强，B组A值显著高于A组，差异有统计学意义（P<0.01）；与B组比较，C组细胞增殖活性升高趋势得到抑制，而D组细胞增殖活性则进一步增强，差异均有统计学意义（P<0.01）；E组与B组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
图2
CCK-8法检测各组细胞增殖活性 图 4 Western blot检测各组细胞纤维化相关蛋白电泳图 1：A组 2：B组 3：C组 4：D组 5：E组 图 5 Western blot检测各组细胞纤维化相关蛋白相对表达量比较 ⓐSmad4 ⓑα-SMA ⓒⅠ型胶原 ⓓLN
Figure2.
Cell proliferation assay in each group by CCK-8 Fig. 4 Electrophoresis of relative proteins of TDFs fibrosis by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E Fig. 5 Relative expressions of relative proteins of TDFs fibrosis by Western blot ⓐSmad4 ⓑα-SMA ⓒCollagen type I ⓓLN
2.3.2 Western blot检测细胞纤维化相关蛋白指标
培养72 h，B组Smad4、α-SMA、Ⅰ型胶原和LN蛋白相对表达量均显著高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）；与B组比较，C组以上蛋白相对表达量降低，D组相对表达量增加，差异均有统计学意义（P<0.05）；E组与B组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 4、5。
3 讨论
临床肌腱粘连防治疗效的提高有赖于对其发生机制的深入研究。目前，通过调控细胞因子的表达、抑制组织纤维细胞增殖来预防肌腱粘连的研究较多[8-14]。TGF-β/Smad信号转导通路是组织纤维化进程中的重要通路，其分子组成及调节比较复杂，与其他信号通路存在广泛的交互影响。随着对miRNA研究的深入，研究者发现miRNA在纤维化相关疾病中起到了极其重要的作用，不仅参与纤维化的发生过程，其表达变化还与纤维化程度密切相关。miRNA是一类长度为18～24个核苷酸的非编码单链RNA分子[15]。目前Sanger miR Base16.0收录的miRNA已有15 000多个，涉及140多个物种。其中人类miRNA已超过1 000个，虽然仅占人类基因组序列的1%～3%，却参与了30%基因表达的调控[16]。
miRNA可以影响TGF-β信号通路的不同位点，Smad4是其中一个重要靶基因[17]。Smad4的MH1 结构域中也存在类似受体激活的Smads (receptor actived Smads，R-Smads)结构中的β发夹结构，具有结合DNA的能力。R-Smads被磷酸化后，Smad4 便与其形成杂聚体，并转位至细胞核调节靶基因的转录。Smad4参与所有的TGF-β超家族信号转导，故称之为共同介体性Smads。近年来，越来越多研究证实miRNA和Smad4表达失调与多种疾病，如癌症、心血管疾病、纤维化疾病等密切相关。Hao等[18- 19]报道在胰腺癌组织中高表达的miRNA-483-3p、miRNA-421与DPC4/Smad4 成负相关，miRNA-483-3p、miRNA-421通过负调控DPC4/Smad4蛋白水平的表达，调节细胞生长及克隆形成率，以及对Smad4下游的TGF-β/BMP通路有抑制作用。He等[20]报道miRNA-146a可通过抑制Smad4的表达来阻断TGF-β/Smad信号通路，进而抑制TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖。因此，miRNA及Smad4在肌腱粘连过程中可能也起着与上述同样的重要作用。但是，国内外尚未检索到肌腱粘连防治领域miRNA和Smad4在TGF-β/Smad通路中的具体调控机制及相关研究的报道。
我们根据Smad4基因序列信息（NM_005359.5），使用TargetScan软件预测Smad4基因3’UTR与miR219-5P可能存在的结合位点，为明确Smad4 是否为miR219-5P调控的靶基因，本研究使用双荧光素酶检测系统，检测细胞干预前后荧光素酶的变化趋势，通过荧光素酶活性变化判断预测的理论靶位是否存在。结果显示，与pGL3-WT-Smad4转染组比较，miR219-5P mimic能够明显抑制细胞内荧光素酶活性，而miR219-5P inhibitor则会增强荧光素酶表达，且组间比较差异有统计学意义；pGL3-MT-Smad4相关转染组中，miR219-5P mimic和miR219-5P inhibitor对于细胞内荧光素酶活性无明显影响；无论pGL3-WT-Smad4还是pGL3-MT-Smad4，NC共转染组与报告基因表达载体单独转染组细胞内荧光素酶活性均无明显差异。由此表明，Smad4 可能是miR219-5P的靶基因。
为进一步验证miR219-5P与Smad4 在生理状态下是否具有上述靶向调控关系，本研究通过TGF-β1诱导TDFs建立纤维化模型，CCK-8法检测细胞活性，Western blot检测过表达及抑制miR219-5P表达后细胞纤维化相关蛋白指标变化。结果显示，TGF-β1诱导培养72 h后细胞会发生纤维化，具体表现为细胞增殖活性增强及纤维化标志蛋白表达明显增强。过表达miR219-5P可明显抑制TGF-β1诱导的细胞纤维化，这可能与miR219-5P抑制其靶蛋白Smad4的表达有关。Smad4蛋白含量降低，导致其与Smad2/3形成复合物并将其转运至细胞核的能力明显降低，从而抑制了TGF-β1/Smad信号在细胞内的传递，最终抑制了TDFs被诱导的纤维化。
目前研究提示miRNA激动剂或拮抗剂可作为一种新的潜在治疗工具，这为未来miRNA作为一种新的治疗靶点提供了可能。因此，深入探讨miRNA在TGF-β/Smads信号转导通路中信息反馈及交叉调控的机制，有助于进一步揭示肌腱粘连的发生机制奠定基础，可能对肌腱粘连的治疗靶点选择和临床药物开发起到重要作用。
