引用本文： 刘泽远, 张文苹, 黄强开, 李刚, 陈治, 韦健, 梁炳生. 被动运动干预对大鼠失神经萎缩骨骼肌中miRNA-1表达和成肌细胞分化的影响. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(5): 612-618. doi: 10.7507/1002-1892.20160124 复制
失神经骨骼肌萎缩，尤其是臂丛损伤后手内在肌萎缩的防治是周围神经领域亟待解决的医学难题。虽然神经修复技术和显微外科技术日益成熟，但是对周围神经损伤后致残率的改善并不理想。这是由于周围神经修复后生长速度慢，失神经萎缩的骨骼肌即便重新获取神经支配，萎缩的骨骼肌也常难以恢复功能。因此延缓失神经骨骼肌萎缩，对于提高周围神经损伤患者的生活质量和降低致残率有重要临床价值。临床上被动运动作为一种重要的防止或延缓失神经肌萎缩的方法被广泛应用，但其确切机制仍未完全明确。近年来，研究发现miRNA在许多疾病的发生、发展以及预后过程中，对影响成肌细胞增殖、分化的关键性转录蛋白起到关键调控作用[1]。研究表明[2-3]，运动后肌肉特异性miRNA有不同程度改变，且有氧运动及抗阻运动、时间不同，其改变均有差异；同时，运动可促进肌卫星细胞的增殖及分化[4]。所以我们推测被动运动干预可影响miRNA的表达，进而调控骨骼肌的增殖分化，延缓失神经后骨骼肌萎缩；而且目前鲜有研究证实miRNA-1在失神经骨骼肌肉中的表达与被动运动的相关性。鉴于此，我们拟通过建立大鼠失神经及失神经被动运动模型，比较两者不同时间点miRNA-1、肌分化因子（myocyte differentiation factor，MyoD）以及腓肠肌萎缩程度的变化，并对三者分别行相关性分析，旨在了解失神经骨骼肌在被动运动干预后腓肠肌萎缩、miRNA-1和MyoD的趋势变化及三者之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
成年健康SD大鼠27只，雌雄不限，体质量（200±10）g，由山西医科大学实验动物中心提供。
Trizol试剂、All-in-oneTM miRNA first stand cDNA synthesis kit、All-in-oneTM miRNA PCR kit、All-in-oneTM qPCR mix（广州复能基因有限公司）；小鼠抗大鼠MyoD单抗（Santa Cruz公司，美国）；即用型辣根过氧化物酶试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。荧光显微镜、倒置显微镜（Olympus公司，日本）；IQ-50 RT-PCR仪、GS800 测量密度扫描仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 动物模型制备及实验分组
将27只SD大鼠随机分为假手术组（A组，n=3）、失神经组（B组，n=12）和失神经被动运动组（C组，n=12）。所有动物以10%水合氯醛腹腔注射（2 mL/kg）麻醉，于右股外侧经皮切开显露坐骨神经并游离，B、C组切除坐骨神经长约1 cm，A组仅显露游离神经不切除，然后逐层缝合。术后1 d起，将C组大鼠置于自制网夹内，拉出右后肢，抓住趾部，与脊柱呈45°向后外方牵拉，至右后肢完全伸直，再将右后肢推向身体，使之完全屈曲紧贴身体，每天训练2次，每次屈伸运动300下，3 min/次。A组于术后6 h，B、C组分别于术后3、7、14、28 d，采用颈椎脱臼法各处死3只大鼠，进行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 腓肠肌湿重比测定
将大鼠双侧腓肠肌自股骨内外髁起点至跟骨结节处完整取下，用电子天平准确称量腓肠肌湿重，计算失神经侧与正常侧腓肠肌湿重的比值。然后将标本快速液氮冷冻保存于— 80℃冰箱备用。
1.3.2 组织学观察
切取各组横切面标本，常规固定、脱水、浸蜡、包埋，5 μm厚连续切片，HE染色后荧光显微镜下观察腓肠肌肌细胞排列及萎缩情况。并采用Olympus图像分析软件计算腓肠肌肌细胞直径，以定量评价腓肠肌萎缩情况。
1.3.3 RT-PCR检测miRNA-1和MyoD基因表达
采用Trizol法分别提取各组各时间点腓肠肌总RNA，按All-in-oneTM miRNA first stand cDNA synthesis kit试剂盒说明操作，取总RNA 1 μL进行反转录，cDNA置于— 80℃保存。PCR扩增反应体系为20 μL：包括5倍稀释后的cDNA 1 μL、2×All-in-OneTM qPCR mix 10 μL、All-in-OneTM miRNA qPCR Primer 2 μL、Universal Adaptor PCR Primer 2 μL，用ddH2O补足20 μL。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，退火（退火温度miRNA-1 40℃、MyoD 57℃）20 s，72℃延伸20 s，40个循环。以管家基因U6为内参，RT-PCR仪读取Ct值，采用2-ΔΔCt计算目的基因mRNA相对表达量，所有样本重复3次。引物合成由广州复能基因有限公司完成，引物序列：miRNA-1 反转录5'-UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3'，上游5'-CTGTCACTCGAGCTGCTGGAATG-3'，下游5'-ACCGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-3'；MyoD上游5'-GTGCAAGCGCAAGACCACTAA-3'，下游 5'-TGCAGACCTTCAATGTAGCGG-3'；U6上游5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游5'-CGCTFCACGAATTYGCGTGTCAT- 3'。
1.3.4 免疫组织化学染色观察MyoD蛋白表达
取上述部分切片，PBS冲洗，抗原修复，滴加一抗小鼠抗大鼠MyoD单抗（1∶100）4℃过夜；PBS反复冲洗3次，去除多余一抗，加入二抗（1∶2 000）20 min；PBS反复冲洗3次，DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片，倒置显微镜观察。
1.4 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；采用Pearson相关分析miRNA-1、MyoD基因相对表达量与腓肠肌湿重比的相关性以及miRNA-1、MyoD基因相对表达量间的相关性；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 腓肠肌湿重比测定
B、C组腓肠肌失神经后均有不同程度萎缩，随时间延长，腓肠肌湿重比逐渐下降，但C组被动运动可延缓失神经肌萎缩程度。与A组腓肠肌湿重比0.987±0.018相比，B、C组术后各时间点腓肠肌湿重比均小于A组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间除术后3 d比较差异无统计学意义（P>0.05）外，术后7、14、28 d C组腓肠肌湿重比均大于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
B、C组大鼠术后各时间点腓肠肌湿重比比较（n=3，2.2 组织学观察
显微镜观察示，A组肌细胞形态正常，肌纤维排列整齐；B、C组随失神经时间延长，肌纤维排列逐渐紊乱，肌细胞直径逐渐减小，失去正常的结构形态，B组较C组变化明显。见图 1。
图1
各组术后各时间点腓肠肌HE染色观察（倒置显微镜×200） ⓐA组术后6 h ⓑB组术后3 d ⓒB组术后7 d ⓓB组术后14 d ⓔB组术后28 d ⓕC组术后3 d ⓖC组术后7 d ⓗC组术后14 d ⓘC组术后28 d
Figure1.
HE staining observation of gastrocnemius in each group at different time points after operation (Inverted microscope×200) ⓐGroup A at 6 hours ⓑGroup B at 3 days ⓒGroup B at 7 days ⓓGroup B at 14 days ⓔGroup B at 28 days ⓕGroup C at 3 days ⓖGroup C at 7 days ⓗGroup C at 14 days ⓘGroup C at 28 days
与A组腓肠肌肌细胞直径（18.348±0.782）μm相比，B、C组术后各时间点肌细胞直径均小于A组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间除术后3、28 d比较差异无统计学意义（P>0.05）外，术后7、14 d C组肌细胞直径均大于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
B、C组大鼠术后各时间点腓肠肌肌细胞直径比较（n=3，μm，2.3 RT-PCR检测miRNA-1和MyoD基因表达
术后随时间延长，B、C组miRNA-1和MyoD基因相对表达量呈逐渐升高趋势，但各时间点均显著低于A组（miRNA-1和MyoD mRNA相对表达量分别为0.213±0.056、0.130±0.035），差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间除术后3 d比较差异无统计学意义（P>0.05）外，术后7、14、28 d C组miRNA-1和MyoD mRNA相对表达量均高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 3、4。
表3
B、C组大鼠术后各时间点腓肠肌miRNA-1基因相对表达量比较（n=3，
表4
B、C组大鼠术后各时间点腓肠肌MyoD基因相对表达量比较（n=3，2.4 免疫组织化学染色观察MyoD蛋白表达
A、B、C组各时间点免疫组织化学染色均可见MyoD呈棕色阳性表达，其中A组阳性表达少于B、C组；B、C组随失神经时间延长，阳性表达逐渐增多，C组各时间点阳性表达均多于B组。见图 2。
图2
各组术后各时间点腓肠肌MyoD免疫组织化学染色观察（倒置显微镜×200） ⓐA组术后6 h ⓑB组术后3 d ⓒB组术后7 d ⓓB组术后14 d ⓔB组术后28 d ⓕC组术后3 d ⓖC组术后7 d ⓗC组术后14 d ⓘC组术后28 d
Figure2.
The expression of MyoD by immunohistochemistry staining in each group at different time points after operation (Inverted microscope×200) ⓐGroup A at 6 hours ⓑGroup B at 3 days ⓒGroup B at 7 days ⓓGroup B at 14 days ⓔGroup B at 28 days ⓕGroup C at 3 days ⓖGroup C at 7 days ⓗGroup C at 14 days ⓘGroup C at 28 days
2.5 相关性分析
失神经腓肠肌中miRNA-1、MyoD基因相对表达量与腓肠肌湿重比在术后3 d（r=0.030，P=0.955；r=0.019，P=0.971）、7 d（r=0.179，P=0.734；r=0.027，P=0.960）时无相关性；14 d（r=0.816，P=0.039；r=0.753，P=0.047）、28 d（r=0.929，P=0.007；r=0.941，P=0.005）时成正相关。各时间点MyoD与miRNA-1基因相对表达量成正相关（3、7、14、28 d分别为r=0.842，P=0.035；r=0.823，P=0.048；r=0.841，P=0.036；r=0.841，P=0.036）。
3 讨论
失神经肌萎缩的治疗是周围神经损伤领域亟待解决的难题。近年来，随着分子生物学和后基因组学的发展，肌肉特异性miRNA为治疗失神经肌萎缩提供了一种新思路。Townley-Tilson等[5]发现，在骨骼肌中存在组织特异性miRNA（miRNA-1、miRNA-133、miRNA-206）参与了肌细胞再生、功能和疾病发生的过程。Koutsoulidou等[6]研究发现人类胚胎发育阶段的不同时期，骨骼肌的发生发育过程中miRNA-1、miRNA-133a表达明显增加。研究证明[7]，miRNA-1、miRNA-133a在肌再生、肌分化过程中对MyoD、血清反应因子（serum response factor，SRF）、肌细胞增强因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）等关键蛋白具有重要调节作用，miRNA-1、miRNA-133a通过调节细胞信号通路的某个环节从而参与延缓失神经快、慢肌肌萎缩的过程。离体细胞实验证明[8]，miRNA-1可促进成肌细胞分化。本实验结果表明，miRNA-1与MyoD的表达有相关性，说明在活体大鼠骨骼肌内，miRNA-1在骨骼肌失神经萎缩后参与成肌细胞的分化过程。
MyoD是成肌调节因子家族（myogenic regulatory factor，MRF）四成员（MyoD、MRF5、Myogenin、MRF4）之一，成肌细胞激活后即上调MRF家族成员表达。同时实验证明成肌细胞通过MyoD和/或MRF5信号通路激活并开始成肌分化过程[9]；并且MyoD促进成肌细胞增殖，在细胞修复中起重要作用[10]。研究显示，小鼠骨骼肌再生时成肌细胞激活早期表达的MyoD和/或MRF5，随后所有增生的成肌细胞均表达MyoD，说明MyoD对成肌细胞增殖有促进作用，并可作为反映肌肉再生的指标[11]。MyoD调节成肌细胞增殖转向最终分化，而缺乏MyoD的小鼠则分化延迟[12]。上述MyoD的这些作用不是独立完成的，其需与MEF2共同作用，进而激活靶基因的启动子来完成[13]；而SRF则与MyoD基因远端调节区域中的CArG元件结合，进一步促使MyoD激活骨骼肌成肌细胞和肌卫星细胞[14]。结合本实验结果，即失神经及被动运动干预后各时间点miRNA-1、MyoD和成肌细胞分化趋势相应变化，我们推测miRNA-1促进成肌细胞分化可能是通过MEF2和SRF形成负性调节环路来实现的，而在这两个负性调节环路中MyoD起到十分重要的作用，通过下调MyoD的抑制因子而上调MyoD基因，这种miRNA与成肌转录调节因子之间的反馈调节可使平衡向肌分化方向转化，导致肌细胞永久分化，以延缓或治疗失神经骨骼肌萎缩。骨骼肌萎缩在早期（失神经3、7 d时）主要表现为蛋白质分解，因而促成肌细胞分化延缓失神经骨骼肌萎缩的作用不明显，随着时间延长，这种作用发挥越来越明显。
力学刺激是维持细胞生存和生长的重要细胞外刺激，在成肌细胞的激活、增殖与分化中扮演重要角色。目前有研究表明，运动的性质、强度、时间、运动后恢复期的活动形式以及运动营养等，可能对成肌细胞与运动的反应机制有着重要影响[15]；持续重复运动刺激可使活化状态的卫星细胞募集完成增殖[16]。但上述研究对象是正常人体或动物骨骼肌。本实验研究对象为失神经萎缩骨骼肌，可进一步为力学刺激或被动运动对骨骼肌或成肌细胞的影响提供实验依据。随着研究的深入，成肌细胞活化、增殖及分化过程中新的调控机制不断被发现，如miRNA、DNA甲基化等调控成肌细胞分化[17-19]。有研究表明[20]，肌肉特异性miRNA与人体伸膝肌肉活动强度成正相关，考虑是由于肌肉特异性miRNA在调节肌肉特定基因表达和蛋白质翻译过程中起到关键作用。本实验结果显示，被动运动干预后，miRNA-1表达与失神经组比较有显著差异，我们推测被动运动的干预可能通过改变细胞微环境或力学刺激骨骼肌，增强miRNA-1的表达，从而促进成肌细胞的分化。
综上述，被动运动是延缓肌萎缩的一种有效防治方法，它可通过多种作用机制来延缓失神经骨骼肌萎缩，本实验结果表明miRNA-1促进成肌细胞分化是其一个重要机制。但miRNA-1促进成肌细胞分化在失神经骨骼肌肌萎缩防治中发挥的具体分子机制及通路尚需进一步研究，以便为临床上miRNA-1治疗骨骼肌失神经肌萎缩提供更好的思路及依据。
失神经骨骼肌萎缩，尤其是臂丛损伤后手内在肌萎缩的防治是周围神经领域亟待解决的医学难题。虽然神经修复技术和显微外科技术日益成熟，但是对周围神经损伤后致残率的改善并不理想。这是由于周围神经修复后生长速度慢，失神经萎缩的骨骼肌即便重新获取神经支配，萎缩的骨骼肌也常难以恢复功能。因此延缓失神经骨骼肌萎缩，对于提高周围神经损伤患者的生活质量和降低致残率有重要临床价值。临床上被动运动作为一种重要的防止或延缓失神经肌萎缩的方法被广泛应用，但其确切机制仍未完全明确。近年来，研究发现miRNA在许多疾病的发生、发展以及预后过程中，对影响成肌细胞增殖、分化的关键性转录蛋白起到关键调控作用[1]。研究表明[2-3]，运动后肌肉特异性miRNA有不同程度改变，且有氧运动及抗阻运动、时间不同，其改变均有差异；同时，运动可促进肌卫星细胞的增殖及分化[4]。所以我们推测被动运动干预可影响miRNA的表达，进而调控骨骼肌的增殖分化，延缓失神经后骨骼肌萎缩；而且目前鲜有研究证实miRNA-1在失神经骨骼肌肉中的表达与被动运动的相关性。鉴于此，我们拟通过建立大鼠失神经及失神经被动运动模型，比较两者不同时间点miRNA-1、肌分化因子（myocyte differentiation factor，MyoD）以及腓肠肌萎缩程度的变化，并对三者分别行相关性分析，旨在了解失神经骨骼肌在被动运动干预后腓肠肌萎缩、miRNA-1和MyoD的趋势变化及三者之间的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
成年健康SD大鼠27只，雌雄不限，体质量（200±10）g，由山西医科大学实验动物中心提供。
Trizol试剂、All-in-oneTM miRNA first stand cDNA synthesis kit、All-in-oneTM miRNA PCR kit、All-in-oneTM qPCR mix（广州复能基因有限公司）；小鼠抗大鼠MyoD单抗（Santa Cruz公司，美国）；即用型辣根过氧化物酶试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。荧光显微镜、倒置显微镜（Olympus公司，日本）；IQ-50 RT-PCR仪、GS800 测量密度扫描仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 动物模型制备及实验分组
将27只SD大鼠随机分为假手术组（A组，n=3）、失神经组（B组，n=12）和失神经被动运动组（C组，n=12）。所有动物以10%水合氯醛腹腔注射（2 mL/kg）麻醉，于右股外侧经皮切开显露坐骨神经并游离，B、C组切除坐骨神经长约1 cm，A组仅显露游离神经不切除，然后逐层缝合。术后1 d起，将C组大鼠置于自制网夹内，拉出右后肢，抓住趾部，与脊柱呈45°向后外方牵拉，至右后肢完全伸直，再将右后肢推向身体，使之完全屈曲紧贴身体，每天训练2次，每次屈伸运动300下，3 min/次。A组于术后6 h，B、C组分别于术后3、7、14、28 d，采用颈椎脱臼法各处死3只大鼠，进行以下观测。
1.3 观测指标
1.3.1 腓肠肌湿重比测定
将大鼠双侧腓肠肌自股骨内外髁起点至跟骨结节处完整取下，用电子天平准确称量腓肠肌湿重，计算失神经侧与正常侧腓肠肌湿重的比值。然后将标本快速液氮冷冻保存于— 80℃冰箱备用。
1.3.2 组织学观察
切取各组横切面标本，常规固定、脱水、浸蜡、包埋，5 μm厚连续切片，HE染色后荧光显微镜下观察腓肠肌肌细胞排列及萎缩情况。并采用Olympus图像分析软件计算腓肠肌肌细胞直径，以定量评价腓肠肌萎缩情况。
1.3.3 RT-PCR检测miRNA-1和MyoD基因表达
采用Trizol法分别提取各组各时间点腓肠肌总RNA，按All-in-oneTM miRNA first stand cDNA synthesis kit试剂盒说明操作，取总RNA 1 μL进行反转录，cDNA置于— 80℃保存。PCR扩增反应体系为20 μL：包括5倍稀释后的cDNA 1 μL、2×All-in-OneTM qPCR mix 10 μL、All-in-OneTM miRNA qPCR Primer 2 μL、Universal Adaptor PCR Primer 2 μL，用ddH2O补足20 μL。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，退火（退火温度miRNA-1 40℃、MyoD 57℃）20 s，72℃延伸20 s，40个循环。以管家基因U6为内参，RT-PCR仪读取Ct值，采用2-ΔΔCt计算目的基因mRNA相对表达量，所有样本重复3次。引物合成由广州复能基因有限公司完成，引物序列：miRNA-1 反转录5'-UGGAAUGUAAAGAAGUGUGUAU-3'，上游5'-CTGTCACTCGAGCTGCTGGAATG-3'，下游5'-ACCGTGTCGTGGAGTCGGCAATT-3'；MyoD上游5'-GTGCAAGCGCAAGACCACTAA-3'，下游 5'-TGCAGACCTTCAATGTAGCGG-3'；U6上游5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游5'-CGCTFCACGAATTYGCGTGTCAT- 3'。
1.3.4 免疫组织化学染色观察MyoD蛋白表达
取上述部分切片，PBS冲洗，抗原修复，滴加一抗小鼠抗大鼠MyoD单抗（1∶100）4℃过夜；PBS反复冲洗3次，去除多余一抗，加入二抗（1∶2 000）20 min；PBS反复冲洗3次，DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片，倒置显微镜观察。
1.4 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；采用Pearson相关分析miRNA-1、MyoD基因相对表达量与腓肠肌湿重比的相关性以及miRNA-1、MyoD基因相对表达量间的相关性；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 腓肠肌湿重比测定
B、C组腓肠肌失神经后均有不同程度萎缩，随时间延长，腓肠肌湿重比逐渐下降，但C组被动运动可延缓失神经肌萎缩程度。与A组腓肠肌湿重比0.987±0.018相比，B、C组术后各时间点腓肠肌湿重比均小于A组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间除术后3 d比较差异无统计学意义（P>0.05）外，术后7、14、28 d C组腓肠肌湿重比均大于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 1。
表1
B、C组大鼠术后各时间点腓肠肌湿重比比较（n=3，2.2 组织学观察
显微镜观察示，A组肌细胞形态正常，肌纤维排列整齐；B、C组随失神经时间延长，肌纤维排列逐渐紊乱，肌细胞直径逐渐减小，失去正常的结构形态，B组较C组变化明显。见图 1。
图1
各组术后各时间点腓肠肌HE染色观察（倒置显微镜×200） ⓐA组术后6 h ⓑB组术后3 d ⓒB组术后7 d ⓓB组术后14 d ⓔB组术后28 d ⓕC组术后3 d ⓖC组术后7 d ⓗC组术后14 d ⓘC组术后28 d
Figure1.
HE staining observation of gastrocnemius in each group at different time points after operation (Inverted microscope×200) ⓐGroup A at 6 hours ⓑGroup B at 3 days ⓒGroup B at 7 days ⓓGroup B at 14 days ⓔGroup B at 28 days ⓕGroup C at 3 days ⓖGroup C at 7 days ⓗGroup C at 14 days ⓘGroup C at 28 days
与A组腓肠肌肌细胞直径（18.348±0.782）μm相比，B、C组术后各时间点肌细胞直径均小于A组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间除术后3、28 d比较差异无统计学意义（P>0.05）外，术后7、14 d C组肌细胞直径均大于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 2。
表2
B、C组大鼠术后各时间点腓肠肌肌细胞直径比较（n=3，μm，2.3 RT-PCR检测miRNA-1和MyoD基因表达
术后随时间延长，B、C组miRNA-1和MyoD基因相对表达量呈逐渐升高趋势，但各时间点均显著低于A组（miRNA-1和MyoD mRNA相对表达量分别为0.213±0.056、0.130±0.035），差异有统计学意义（P<0.05）；B、C组间除术后3 d比较差异无统计学意义（P>0.05）外，术后7、14、28 d C组miRNA-1和MyoD mRNA相对表达量均高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表 3、4。
表3
B、C组大鼠术后各时间点腓肠肌miRNA-1基因相对表达量比较（n=3，
表4
B、C组大鼠术后各时间点腓肠肌MyoD基因相对表达量比较（n=3，2.4 免疫组织化学染色观察MyoD蛋白表达
A、B、C组各时间点免疫组织化学染色均可见MyoD呈棕色阳性表达，其中A组阳性表达少于B、C组；B、C组随失神经时间延长，阳性表达逐渐增多，C组各时间点阳性表达均多于B组。见图 2。
图2
各组术后各时间点腓肠肌MyoD免疫组织化学染色观察（倒置显微镜×200） ⓐA组术后6 h ⓑB组术后3 d ⓒB组术后7 d ⓓB组术后14 d ⓔB组术后28 d ⓕC组术后3 d ⓖC组术后7 d ⓗC组术后14 d ⓘC组术后28 d
Figure2.
The expression of MyoD by immunohistochemistry staining in each group at different time points after operation (Inverted microscope×200) ⓐGroup A at 6 hours ⓑGroup B at 3 days ⓒGroup B at 7 days ⓓGroup B at 14 days ⓔGroup B at 28 days ⓕGroup C at 3 days ⓖGroup C at 7 days ⓗGroup C at 14 days ⓘGroup C at 28 days
2.5 相关性分析
失神经腓肠肌中miRNA-1、MyoD基因相对表达量与腓肠肌湿重比在术后3 d（r=0.030，P=0.955；r=0.019，P=0.971）、7 d（r=0.179，P=0.734；r=0.027，P=0.960）时无相关性；14 d（r=0.816，P=0.039；r=0.753，P=0.047）、28 d（r=0.929，P=0.007；r=0.941，P=0.005）时成正相关。各时间点MyoD与miRNA-1基因相对表达量成正相关（3、7、14、28 d分别为r=0.842，P=0.035；r=0.823，P=0.048；r=0.841，P=0.036；r=0.841，P=0.036）。
3 讨论
失神经肌萎缩的治疗是周围神经损伤领域亟待解决的难题。近年来，随着分子生物学和后基因组学的发展，肌肉特异性miRNA为治疗失神经肌萎缩提供了一种新思路。Townley-Tilson等[5]发现，在骨骼肌中存在组织特异性miRNA（miRNA-1、miRNA-133、miRNA-206）参与了肌细胞再生、功能和疾病发生的过程。Koutsoulidou等[6]研究发现人类胚胎发育阶段的不同时期，骨骼肌的发生发育过程中miRNA-1、miRNA-133a表达明显增加。研究证明[7]，miRNA-1、miRNA-133a在肌再生、肌分化过程中对MyoD、血清反应因子（serum response factor，SRF）、肌细胞增强因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）等关键蛋白具有重要调节作用，miRNA-1、miRNA-133a通过调节细胞信号通路的某个环节从而参与延缓失神经快、慢肌肌萎缩的过程。离体细胞实验证明[8]，miRNA-1可促进成肌细胞分化。本实验结果表明，miRNA-1与MyoD的表达有相关性，说明在活体大鼠骨骼肌内，miRNA-1在骨骼肌失神经萎缩后参与成肌细胞的分化过程。
MyoD是成肌调节因子家族（myogenic regulatory factor，MRF）四成员（MyoD、MRF5、Myogenin、MRF4）之一，成肌细胞激活后即上调MRF家族成员表达。同时实验证明成肌细胞通过MyoD和/或MRF5信号通路激活并开始成肌分化过程[9]；并且MyoD促进成肌细胞增殖，在细胞修复中起重要作用[10]。研究显示，小鼠骨骼肌再生时成肌细胞激活早期表达的MyoD和/或MRF5，随后所有增生的成肌细胞均表达MyoD，说明MyoD对成肌细胞增殖有促进作用，并可作为反映肌肉再生的指标[11]。MyoD调节成肌细胞增殖转向最终分化，而缺乏MyoD的小鼠则分化延迟[12]。上述MyoD的这些作用不是独立完成的，其需与MEF2共同作用，进而激活靶基因的启动子来完成[13]；而SRF则与MyoD基因远端调节区域中的CArG元件结合，进一步促使MyoD激活骨骼肌成肌细胞和肌卫星细胞[14]。结合本实验结果，即失神经及被动运动干预后各时间点miRNA-1、MyoD和成肌细胞分化趋势相应变化，我们推测miRNA-1促进成肌细胞分化可能是通过MEF2和SRF形成负性调节环路来实现的，而在这两个负性调节环路中MyoD起到十分重要的作用，通过下调MyoD的抑制因子而上调MyoD基因，这种miRNA与成肌转录调节因子之间的反馈调节可使平衡向肌分化方向转化，导致肌细胞永久分化，以延缓或治疗失神经骨骼肌萎缩。骨骼肌萎缩在早期（失神经3、7 d时）主要表现为蛋白质分解，因而促成肌细胞分化延缓失神经骨骼肌萎缩的作用不明显，随着时间延长，这种作用发挥越来越明显。
力学刺激是维持细胞生存和生长的重要细胞外刺激，在成肌细胞的激活、增殖与分化中扮演重要角色。目前有研究表明，运动的性质、强度、时间、运动后恢复期的活动形式以及运动营养等，可能对成肌细胞与运动的反应机制有着重要影响[15]；持续重复运动刺激可使活化状态的卫星细胞募集完成增殖[16]。但上述研究对象是正常人体或动物骨骼肌。本实验研究对象为失神经萎缩骨骼肌，可进一步为力学刺激或被动运动对骨骼肌或成肌细胞的影响提供实验依据。随着研究的深入，成肌细胞活化、增殖及分化过程中新的调控机制不断被发现，如miRNA、DNA甲基化等调控成肌细胞分化[17-19]。有研究表明[20]，肌肉特异性miRNA与人体伸膝肌肉活动强度成正相关，考虑是由于肌肉特异性miRNA在调节肌肉特定基因表达和蛋白质翻译过程中起到关键作用。本实验结果显示，被动运动干预后，miRNA-1表达与失神经组比较有显著差异，我们推测被动运动的干预可能通过改变细胞微环境或力学刺激骨骼肌，增强miRNA-1的表达，从而促进成肌细胞的分化。
综上述，被动运动是延缓肌萎缩的一种有效防治方法，它可通过多种作用机制来延缓失神经骨骼肌萎缩，本实验结果表明miRNA-1促进成肌细胞分化是其一个重要机制。但miRNA-1促进成肌细胞分化在失神经骨骼肌肌萎缩防治中发挥的具体分子机制及通路尚需进一步研究，以便为临床上miRNA-1治疗骨骼肌失神经肌萎缩提供更好的思路及依据。
