引用本文： 张强, 陈汇浩, 刘国辉, 宗海洋, 林浩东, 侯春林. 恒河猴坐骨神经损伤修复后胫神经和腓总神经预后差异的研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(5): 608-611. doi: 10.7507/1002-1892.20160123 复制
目前，周围神经损伤治疗效果不理想，可能导致患者畸形、功能障碍，甚至瘫痪[1-2]。影响神经功能恢复的原因较多，如患者年龄、损伤平面、损伤时间及损伤程度等[3-4]。临床研究发现不同周围神经损伤后，其再生能力和再生速度存在差异，如坐骨神经损伤后，胫神经功能恢复优于腓总神经[5-6]。本实验选择与人相似程度高的恒河猴作为研究对象，于同一平面切断胫神经和腓总神经，在排除损伤平面、损伤时间等相关因素情况下，探究胫神经和腓总神经损伤修复后功能差异是否与神经纤维退变及再生速度不同有关。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年恒河猴9只，雌雄不限，体质量3.5～4.5 kg，平均4.0 kg，由苏州西山中科实验动物有限公司提供。戊巴比妥、Luxol Fast Blue染色液（苏州西山中科药物研究开发有限公司）。显微外科器械（宁波市成和显微外科器械厂）；手术显微镜（上海精密仪器仪表有限公司）；光学显微镜（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）；冰冻切片机（Leica公司，德国）；Keypoint2/4-3.02便携式电生理仪（Alpine BioMed Aps公司，丹麦）。
1.2 实验方法
将9只实验动物以1% 戊巴比妥静脉注射（30 mg/kg）麻醉后，右后肢备皮。于右臀部至大腿后侧作长约5 cm切口，显露梨状肌下孔至腘窝部坐骨神经，于坐骨神经发出胫神经和腓总神经的平面切断，造成离断损伤。损伤后即刻随机取3只动物，于损伤平面以远5 mm处切取长5 mm的胫神经及腓总神经作为正常对照，不作修复处理；其余6只动物采用神经外膜缝合法用9-0无创缝线吻合胫神经远、近端及腓总神经远、近端，常规闭合切口。术后给予抗生素预防感染，分别于3、8周随机各取3只动物进行观测。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
观察修复术后实验动物存活、切口愈合及后肢运动情况。术后3、8 周取动物同上法麻醉后，沿原切口切开，显露坐骨神经吻合部，行大体观察。
1.3.2 神经电生理检测
术后3、8周大体观察后，以双极电极作为刺激电极分别置于神经吻合口近、远端5 mm处进行刺激，同芯针电极为记录电极，刺激胫神经时插入小腿腓肠肌，刺激腓总神经时插入胫前肌。刺激神经近、远端，记录复合肌肉动作电位（compound muscle action potential，CMAP）波幅。
1.3.3 组织学观察
术后3、8周神经电生理检测后，切取吻合口远端5 mm处长5 mm的胫神经、腓总神经，连同术中切取的正常对照神经组织置于甲醛固定，石蜡包埋、切片，片厚5～8 μm，脱蜡至水，然后行Luxol Fast Blue染色。光镜下观察胫神经和腓总神经髓鞘形态。每张切片随机取3个视野，人工计数每个视野中轴突数目，Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析每个视野神经组织面积，取均值。按照以下公式分别计算术中及术后3、8周胫神经和腓总神经的轴突密度，轴突密度=每个视野轴突数目∕每个视野神经组织面积；以及术后3、8周轴突再生率，轴突再生率=术后3周或8周平均轴突密度∕术中平均轴突密度×100%。
2 结果
2.1 大体观察
神经修复术后动物状态良好，术后第1天开始进食、水，切口愈合良好，无感染发生，右下肢瘫痪。术后3周右下肢肌肉萎缩，小腿前侧萎缩较后侧明显；8周，足趾部出现不同程度溃疡，瘫痪程度较前减轻。大体观察见吻合部神经膨大，周围结缔组织增生，粘连明显，术后3、8周吻合口粘连程度无明显差异。见图 1。
图1
术后3周神经吻合部大体观察 图 2 神经电生理检测 ⓐ术后3周腓总神经 ⓑ术后3周胫神经 ⓒ术后8周腓总神经 ⓓ术后8周胫神经 图 3 各时间点腓总神经组织学观察（Luxol Fast Blue×400） ⓐ术中 ⓑ术后3周 ⓒ术后8周 图 4 各时间点胫神经组织学观察（Luxol Fast Blue×400） ⓐ术中 ⓑ术后3周 ⓒ术后8周
Figure1.
Gross observation at nerve anastomosis site at 3 weeks after repair Fig. 2 Neural electrophysiological detection ⓐCommon peroneal nerve at 3 weeks after repair ⓑTibial nerve at 3 weeks after repair ⓒCommon peroneal nerve at 8 weeks after repair ⓓTibial nerve at 8 weeks after repair Fig. 3 Histological observation of common peroneal nerve (Luxol Fast Blue×400) ⓐDuring operation ⓑAt 3 weeks after repair ⓒAt 8 weeks after repair Fig. 4 Histological observation of tibial nerve (Luxol Fast Blue×400) ⓐDuring operation ⓑAt 3 weeks after repair ⓒAt 8 weeks after repair
2.2 神经电生理检测
术后3周未检测到胫神经及腓总神经CMAP。术后8周可检测到胫神经及腓总神经CMAP，3只动物腓总神经CMAP波幅分别为12.0、11.0、12.2 mV，小于胫神经的18.0、19.0、19.7 mV。见图 2。
2.3 组织学观察
镜下观察示，术中切取的正常神经组织髓鞘呈蓝色，轴索不染色，髓鞘呈圆形排列包绕轴索，轴突密度均匀，排列紧密，中间无或仅有少量纤维组织分隔。3只动物胫神经轴突密度分别为2 926、2 630、2 661个/0.1 mm2，平均2 738 个 /0.1 mm2；腓总神经轴突密度分别为2 452、2 781、2 948个/0.1 mm2，平均2 727个/0.1 mm2。
术后3周，髓鞘崩解，无完整髓鞘，变性的轴突残留“空泡样”不着色区，在原轴突崩解残留区可见部分再生髓鞘，呈团状，未形成包绕轴索的管道样结构，其间纤维组织增多，分割、包绕神经纤维，此时神经纤维以变性为主，伴少量再生轴突。3只动物胫神经轴突密度分别为1 104、1 032、1 518 个/0.1 mm2，平均1 218个/0.1 mm2；腓总神经轴突密度分别为370、315、398个/0.1 mm2，平均361个/0.1 mm2。腓总神经轴突较胫神经明显减少，其轴突再生率仅为13.2%，远低于胫神经的44.5%。
术后8周，腓总神经髓鞘进一步减少，再生髓鞘少，其中仅有少数髓鞘形成包绕轴索的管道样结构，增生的纤维组织进一步增多；而胫神经再生的髓鞘已部分形成包绕轴索的管道样结构，神经再生速度较腓总神经快，神经纤维以再生轴突为主。3只动物胫神经轴突密度分别为950、978、970 个 /0.1 mm2，平均966个/0.1 mm2；腓总神经轴突密度分别为305、270、268个/0.1 mm2，平均281 个 /0.1 mm2。腓总神经轴突再生率为10.3%，明显低于胫神经的35.3%。见图 3、4。
3 讨论
与中枢神经相比，周围神经再生能力强，损伤修复后功能可得到一定程度恢复，但这种再生能力通常不足以完全修复受损神经[7-8]，如何促进神经纤维再生、提高周围神经修复效果具有重要意义。临床上发现，不同周围神经在同一平面损伤后，其预后也存在明显差异。早在上世纪，人们已发现采用同样方法修复胫神经和腓总神经后，胫神经感觉运动功能恢复优于腓总神经 [9-12]。但其原因尚未明确。近年来，坐骨神经损伤发生率逐渐增高，通常伴发于髋臼骨折[13]、髋关节脱位[14]、锐器切割伤、药物注射损伤等。其中由于解剖因素，腓总神经损伤发生率较胫神经高[15-16]。腓总神经损伤是下肢最常见的神经损伤[17]，因此研究胫神经和腓总神经损伤后功能差异原因，可为提高胫神经和腓总神经的修复效果提供理论依据。
周围神经损伤后再生是一个复杂而协调的过程，在这一过程中最初表现为受损神经远端轴突和髓鞘变性崩解，发生瓦勒变性，仅留下包裹神经纤维的基膜，之后轴突远端雪旺细胞增生，在基膜围成的神经膜管内形成一条实心的细胞索Büngher带，包绕再生轴突形成髓鞘[18-19]。本实验采用神经缝合修复坐骨神经后，在术中及术后3、8周取材计算胫神经和腓总神经轴突密度，发现术中切取的正常胫神经和腓总神经轴突密度相似；术后3周胫神经和腓总神经纤维以变性为主，轴突再生率分别为44.5%和13.2%，此时胫神经和腓总神经轴突均较正常神经组织减少，其中腓总神经减少尤其明显，胫神经和腓总神经CMAP均未测到；术后8周，胫神经和腓总神经得到不同程度再生，轴突再生率分别为35.3%和10.3%，此时可测到胫神经和腓总神经CMAP，但胫神经CMAP波幅较腓总神经大，提示胫神经恢复较快。胫神经在损伤后神经轴突变性较腓总神经慢，而轴突再生又早于腓总神经，两种神经存在轴突退变与再生时间上的差异可能是导致坐骨神经损伤修复后，胫神经功能恢复优于腓总神经的原因，但有待进一步研究。另外，因恒河猴价格昂贵，观测样本量少，观察指标也较少，这些均需在后期研究中加以完善。
目前，周围神经损伤治疗效果不理想，可能导致患者畸形、功能障碍，甚至瘫痪[1-2]。影响神经功能恢复的原因较多，如患者年龄、损伤平面、损伤时间及损伤程度等[3-4]。临床研究发现不同周围神经损伤后，其再生能力和再生速度存在差异，如坐骨神经损伤后，胫神经功能恢复优于腓总神经[5-6]。本实验选择与人相似程度高的恒河猴作为研究对象，于同一平面切断胫神经和腓总神经，在排除损伤平面、损伤时间等相关因素情况下，探究胫神经和腓总神经损伤修复后功能差异是否与神经纤维退变及再生速度不同有关。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年恒河猴9只，雌雄不限，体质量3.5～4.5 kg，平均4.0 kg，由苏州西山中科实验动物有限公司提供。戊巴比妥、Luxol Fast Blue染色液（苏州西山中科药物研究开发有限公司）。显微外科器械（宁波市成和显微外科器械厂）；手术显微镜（上海精密仪器仪表有限公司）；光学显微镜（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus 6.0图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）；冰冻切片机（Leica公司，德国）；Keypoint2/4-3.02便携式电生理仪（Alpine BioMed Aps公司，丹麦）。
1.2 实验方法
将9只实验动物以1% 戊巴比妥静脉注射（30 mg/kg）麻醉后，右后肢备皮。于右臀部至大腿后侧作长约5 cm切口，显露梨状肌下孔至腘窝部坐骨神经，于坐骨神经发出胫神经和腓总神经的平面切断，造成离断损伤。损伤后即刻随机取3只动物，于损伤平面以远5 mm处切取长5 mm的胫神经及腓总神经作为正常对照，不作修复处理；其余6只动物采用神经外膜缝合法用9-0无创缝线吻合胫神经远、近端及腓总神经远、近端，常规闭合切口。术后给予抗生素预防感染，分别于3、8周随机各取3只动物进行观测。
1.3 观测指标
1.3.1 大体观察
观察修复术后实验动物存活、切口愈合及后肢运动情况。术后3、8 周取动物同上法麻醉后，沿原切口切开，显露坐骨神经吻合部，行大体观察。
1.3.2 神经电生理检测
术后3、8周大体观察后，以双极电极作为刺激电极分别置于神经吻合口近、远端5 mm处进行刺激，同芯针电极为记录电极，刺激胫神经时插入小腿腓肠肌，刺激腓总神经时插入胫前肌。刺激神经近、远端，记录复合肌肉动作电位（compound muscle action potential，CMAP）波幅。
1.3.3 组织学观察
术后3、8周神经电生理检测后，切取吻合口远端5 mm处长5 mm的胫神经、腓总神经，连同术中切取的正常对照神经组织置于甲醛固定，石蜡包埋、切片，片厚5～8 μm，脱蜡至水，然后行Luxol Fast Blue染色。光镜下观察胫神经和腓总神经髓鞘形态。每张切片随机取3个视野，人工计数每个视野中轴突数目，Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析每个视野神经组织面积，取均值。按照以下公式分别计算术中及术后3、8周胫神经和腓总神经的轴突密度，轴突密度=每个视野轴突数目∕每个视野神经组织面积；以及术后3、8周轴突再生率，轴突再生率=术后3周或8周平均轴突密度∕术中平均轴突密度×100%。
2 结果
2.1 大体观察
神经修复术后动物状态良好，术后第1天开始进食、水，切口愈合良好，无感染发生，右下肢瘫痪。术后3周右下肢肌肉萎缩，小腿前侧萎缩较后侧明显；8周，足趾部出现不同程度溃疡，瘫痪程度较前减轻。大体观察见吻合部神经膨大，周围结缔组织增生，粘连明显，术后3、8周吻合口粘连程度无明显差异。见图 1。
图1
术后3周神经吻合部大体观察 图 2 神经电生理检测 ⓐ术后3周腓总神经 ⓑ术后3周胫神经 ⓒ术后8周腓总神经 ⓓ术后8周胫神经 图 3 各时间点腓总神经组织学观察（Luxol Fast Blue×400） ⓐ术中 ⓑ术后3周 ⓒ术后8周 图 4 各时间点胫神经组织学观察（Luxol Fast Blue×400） ⓐ术中 ⓑ术后3周 ⓒ术后8周
Figure1.
Gross observation at nerve anastomosis site at 3 weeks after repair Fig. 2 Neural electrophysiological detection ⓐCommon peroneal nerve at 3 weeks after repair ⓑTibial nerve at 3 weeks after repair ⓒCommon peroneal nerve at 8 weeks after repair ⓓTibial nerve at 8 weeks after repair Fig. 3 Histological observation of common peroneal nerve (Luxol Fast Blue×400) ⓐDuring operation ⓑAt 3 weeks after repair ⓒAt 8 weeks after repair Fig. 4 Histological observation of tibial nerve (Luxol Fast Blue×400) ⓐDuring operation ⓑAt 3 weeks after repair ⓒAt 8 weeks after repair
2.2 神经电生理检测
术后3周未检测到胫神经及腓总神经CMAP。术后8周可检测到胫神经及腓总神经CMAP，3只动物腓总神经CMAP波幅分别为12.0、11.0、12.2 mV，小于胫神经的18.0、19.0、19.7 mV。见图 2。
2.3 组织学观察
镜下观察示，术中切取的正常神经组织髓鞘呈蓝色，轴索不染色，髓鞘呈圆形排列包绕轴索，轴突密度均匀，排列紧密，中间无或仅有少量纤维组织分隔。3只动物胫神经轴突密度分别为2 926、2 630、2 661个/0.1 mm2，平均2 738 个 /0.1 mm2；腓总神经轴突密度分别为2 452、2 781、2 948个/0.1 mm2，平均2 727个/0.1 mm2。
术后3周，髓鞘崩解，无完整髓鞘，变性的轴突残留“空泡样”不着色区，在原轴突崩解残留区可见部分再生髓鞘，呈团状，未形成包绕轴索的管道样结构，其间纤维组织增多，分割、包绕神经纤维，此时神经纤维以变性为主，伴少量再生轴突。3只动物胫神经轴突密度分别为1 104、1 032、1 518 个/0.1 mm2，平均1 218个/0.1 mm2；腓总神经轴突密度分别为370、315、398个/0.1 mm2，平均361个/0.1 mm2。腓总神经轴突较胫神经明显减少，其轴突再生率仅为13.2%，远低于胫神经的44.5%。
术后8周，腓总神经髓鞘进一步减少，再生髓鞘少，其中仅有少数髓鞘形成包绕轴索的管道样结构，增生的纤维组织进一步增多；而胫神经再生的髓鞘已部分形成包绕轴索的管道样结构，神经再生速度较腓总神经快，神经纤维以再生轴突为主。3只动物胫神经轴突密度分别为950、978、970 个 /0.1 mm2，平均966个/0.1 mm2；腓总神经轴突密度分别为305、270、268个/0.1 mm2，平均281 个 /0.1 mm2。腓总神经轴突再生率为10.3%，明显低于胫神经的35.3%。见图 3、4。
3 讨论
与中枢神经相比，周围神经再生能力强，损伤修复后功能可得到一定程度恢复，但这种再生能力通常不足以完全修复受损神经[7-8]，如何促进神经纤维再生、提高周围神经修复效果具有重要意义。临床上发现，不同周围神经在同一平面损伤后，其预后也存在明显差异。早在上世纪，人们已发现采用同样方法修复胫神经和腓总神经后，胫神经感觉运动功能恢复优于腓总神经 [9-12]。但其原因尚未明确。近年来，坐骨神经损伤发生率逐渐增高，通常伴发于髋臼骨折[13]、髋关节脱位[14]、锐器切割伤、药物注射损伤等。其中由于解剖因素，腓总神经损伤发生率较胫神经高[15-16]。腓总神经损伤是下肢最常见的神经损伤[17]，因此研究胫神经和腓总神经损伤后功能差异原因，可为提高胫神经和腓总神经的修复效果提供理论依据。
周围神经损伤后再生是一个复杂而协调的过程，在这一过程中最初表现为受损神经远端轴突和髓鞘变性崩解，发生瓦勒变性，仅留下包裹神经纤维的基膜，之后轴突远端雪旺细胞增生，在基膜围成的神经膜管内形成一条实心的细胞索Büngher带，包绕再生轴突形成髓鞘[18-19]。本实验采用神经缝合修复坐骨神经后，在术中及术后3、8周取材计算胫神经和腓总神经轴突密度，发现术中切取的正常胫神经和腓总神经轴突密度相似；术后3周胫神经和腓总神经纤维以变性为主，轴突再生率分别为44.5%和13.2%，此时胫神经和腓总神经轴突均较正常神经组织减少，其中腓总神经减少尤其明显，胫神经和腓总神经CMAP均未测到；术后8周，胫神经和腓总神经得到不同程度再生，轴突再生率分别为35.3%和10.3%，此时可测到胫神经和腓总神经CMAP，但胫神经CMAP波幅较腓总神经大，提示胫神经恢复较快。胫神经在损伤后神经轴突变性较腓总神经慢，而轴突再生又早于腓总神经，两种神经存在轴突退变与再生时间上的差异可能是导致坐骨神经损伤修复后，胫神经功能恢复优于腓总神经的原因，但有待进一步研究。另外，因恒河猴价格昂贵，观测样本量少，观察指标也较少，这些均需在后期研究中加以完善。
