引用本文： 于风旭, 陈永恩, 陈枫, 夏纪毅, 刘洪端, 付勇, 李妙玲, 廖斌. Akt1基因转染对BMSCs缺氧耐受影响的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(4): 479-484. doi: 10.7507/1002-1892.20160096 复制
目前，世界范围内心肌梗死导致的心血管疾病危害严重，但预防治疗存在明显不足，探索有效治疗方法迫在眉睫。2001年Orlic等[1]报道BMSCs可再生心肌后，干细胞治疗心肌梗死成为研究热点。但在各种干细胞移植治疗心肌梗死的研究中，移植后干细胞在缺血、缺氧梗死区的存活率极低[2-3]。因此提高干细胞的耐缺血、缺氧能力可能是改善干细胞移植治疗心肌梗死的关键。Akt功能涉及细胞周期调控、凋亡的启动、血管生成、端粒酶活性和细胞侵袭性等诸多方面[4]。在PI3K/Akt途径中生成的Akt蛋白在PI3K等作用下充分活化，参与介导细胞生长、增殖等[5-6]，其既是细胞存活的信号介质，又是细胞存活的必要因素[7]，持续存在可避免细胞损伤[8]。鉴于此，本研究以BMSCs为种子细胞，Akt1为抗凋亡目的基因，经重组慢病毒（lentivirus，LVs）介导Akt1基因转染BMSCs，探讨在缺氧条件下Akt1是否能提高BMSCs的抗凋亡及增殖能力（即缺氧耐受能力），为提高干细胞移植治疗心肌梗死的疗效提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
3～5周龄SD大鼠20只，雌雄不限，体质量150～200 g，由西南医科大学实验动物中心提供。
标准FBS（HyClone公司，美国）；DMEM/F12培养基（GIBCO公司，美国）；膜联蛋白V（Annexin V）-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染色试剂盒（宝灵曼公司，德国）；过表达Akt1慢病毒载体[pLVX-增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）-3FLAG]、不含Akt1的病毒载体（pLVX-EGFP）、Polybrene（上海生博生物医药科技有限公司）；Akt1多克隆抗体（武汉艾美捷科技有限公司）；兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）多克隆抗体、内参照β-actin（北京博奥生物技术有限公司）。
超净工作台（Ibemotol公司，美国）；低温离心机（Hitachi公司，日本）；三通气孵育箱（上海力康生物医疗科技控股有限公司）；BX-70倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；S70荧光显微镜（Leica Demirb公司，德国）；超低温冰箱（Thermo公司，美国）；FACSC Alibur流式细胞仪、Kaluza流式细胞仪分析软件（B&D公司，美国）；台式高速冷冻离心机（Beckman公司，美国）； Tannon2500凝胶成像扫描系统（Bio-Rad公司，美国）； LabWorks软件（UVP公司，美国）。
1.2 大鼠BMSCs的分离培养
取SD大鼠颈椎脱臼法处死，将剪下的股骨分别剪去两端，暴露骨髓腔，吸取5 mL含15%FBS的DMEM培养液，加入10%肝素冲洗骨髓腔3～4 次，吸管吹打混匀，将滤液贴壁轻轻加入至含等体积Percoll分离液（1.073 g/mL）的离心管中，以离心半径5 cm、2 500 r/min离心20 min；收集单个核细胞于另一离心管中，DMEM/F12培养液离心（离心半径5cm、1 000 r/min，5 min）洗涤2次；用含15%FBS的DMEM重悬细胞，以（1.5～2.0）×105个/cm2密度接种于培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。待贴壁细胞达80%～90%融合后，弃培养液，PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶室温下消化，以1∶2比例传代，取第3代细胞用于实验。
1.3 细胞转染和验证
1.3.1 细胞转染
取第3代BMSCs分为3组，分别为空白对照组（A组，不添加任何转染试剂）、对照组（B组，加入pLVX-EGFP及转染增强剂Polybrene）、Akt1慢病毒载体组（C组，加入pLVX-EGFP-3FLAG及转染增强剂Polybrene）。具体步骤：实验前1 d用PBS清冼BMSCs 2遍，0.25%胰蛋白酶消化后以（3～5）×105个/cm2密度接种至6孔培养板上，每孔1 mL，DMEM培养液培养24 h。B、C组将相应病毒置于冰块上慢慢融化，根据预实验结果以感染复数10分别加入11 μL pLVX-EGFP病毒液（滴度为1.81×108 TU/mL）和7 μL pLVX-EGFP-3FLAG病毒液（滴度为2.84×108 TU/mL）；取2 μL Polybrene（1mg/ mL）稀释至400 μL，B、C组分别加入10 μL；混匀后继续培养。8～12 h后更换为新鲜DMEM培养基，转染2～3 d后荧光显微镜观察。
1.3.2 转染后Western blot法验证Akt1蛋白表达
取转染48 h后的B、C组BMSCs，用4℃预冷1×PBS工作液轻柔洗涤细胞2次，0.25%胰蛋白酶消化提纯后重复PBS漂洗步骤，提取总蛋白，采用SDS-PAGE凝胶电泳法检测蛋白表达，以验证Akt1基因是否转染成功。
1.4 缺氧干预后相关检测
1.4.1 实验分组
将上述B、C组培养的BMSCs分别置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱进行缺氧干预（分别为B1、C1组）。
1.4.2 流式细胞仪检测细胞凋亡
取缺氧干预0、3、6、9、12 h的B1、C1组BMSCs，PBS洗涤3次，以0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞悬液于离心管中，以离心半径5cm、1 000 r/min离心10 min，弃上清。调整细胞密度为1×106个/mL，取100μL细胞悬液，用Annexin V-FITC/PI试剂盒行双染，常规调试流式细胞仪后，激发光波长为488nm，用515 nm波长通带滤器检测FITC荧光，560nm波长滤器检测PI。将对照管非特异荧光的99%以上作为本底扣除，以二维点阵图显示，记录细胞凋亡率和死亡率。在双变量流式细胞散点图上，左下象限显示活细胞（Annex inV-FITC-/PI-），右上象限为死亡细胞（AnnexinV-FITC+/PI+），而右下象限为凋亡细胞（Annexin V-FITC+/PI-），总计分析10 000个细胞。实验重复3次。
1.4.3 MTT法检测细胞增殖情况
取B、B1、C、C1组培养0、3、6、9、12 h的细胞，分别于每孔中加入0.5% MTT溶液20 μL，37℃、5%CO2条件下继续培养4 h；弃培养液，PBS清洗2～3次，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速震荡10 min，于酶联免疫检测仪波长490 nm处测吸光度（A）值，并绘制细胞生长曲线。
1.4.4 Western blot法检测Caspase-3表达
取缺氧干预0、3、6、9、12 h的B1、C1组细胞，以RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA试剂盒进行蛋白定量，取60～80 μg/孔蛋白质进行10%SDS-PAGE，将电泳分离后的蛋白电转移至聚偏二氟乙烯膜上，取出膜以5%脱脂奶粉25℃封闭1 h。封闭结束用PBS洗膜1次（10 min），加入活性Caspase-3抗体（1∶1000）及内参抗β-actin抗体（1∶2 000），4℃反应过夜；PBS洗膜3次（15 min 1次、5 min 2 次），加入辣根过氧化物酶标记抗兔IgG（1∶3000）摇床1 h；PBS洗膜3次（每次5 min），增强化学发光试剂ECL显色。以Quantity One图像分析软件对结果进行分析，以目的蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较以及组内各时间点间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；两组间比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs形态学观察
骨髓单个核细胞接种于培养瓶后呈圆形，大小不一，悬浮于培养液中；24 h后部分细胞开始贴壁，呈球形或梭形；3 d后可见少量梭形、星形或纺锤形细胞分散贴壁生长，伸出伪足呈逗点状或短棒状；7 d后细胞集落呈放射状排列，有参差不齐、粗细不一的突起伸出，细胞核较大，核仁清晰可见，混有较多杂质；约14 d细胞融合达80%～90%，呈漩涡状。传代细胞贴壁快，24 h内全部贴壁、伸展，增殖迅速，均匀分布生长；5～6 d细胞贴壁融合率达80%～90%，形态均一，呈长梭形，铺满培养皿形成单层，呈“鱼群状”排列。见图 1。
图1
大鼠BMSCs形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 原代培养7 d ⓑ 原代培养14 d ⓒ 第3代细胞培养5 d 图 2 B、C组细胞转染后荧光显微镜观察（×100） ⓐ B组 ⓑ C组 图 3 Western blot 检测转染48 h后B、C组Akt1蛋白表达 1：C组 2：B组 图 4 流式细胞仪检测缺氧干预各时间点B1、C1组细胞凋亡及死亡情况 ⓐ B1组0 h ⓑ B1组3 h ⓒ B1组6 h ⓓ B1组9 h ⓔ B1组12h ⓕ C1组0 h ⓖ C1组3 h ⓗ C1组6 h ⓘ C1组9 h ⓙ C1组12 h
Figure1.
Morphological observation of rat BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ Primary BMSCs cultured for 7 days ⓑ Primary BMSCs cultured for 14 days ⓒ The 3rd generation BMSCs cultured for 5 days Fig. 2 Fluorescence microscope observation of BMSCs in groups B and C after transfection (×100) ⓐ Group B ⓑ Group C Fig. 3 Akt1 protein expression in groups B and C at 48 hours after transfecion by Western blot 1: Group C 2: Group B Fig. 4 Apoptosis and cell death observation of groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention by flow cytometry ⓐ Group B1 at 0 hour ⓑ Group B1 at 3 hours ⓒ Group B1 at 6 hours ⓓ Group B1 at 9 hours ⓔ Group B1 at 12 hours ⓕ Group C1 at 0 hour ⓖ Group C1 at 3 hours ⓗ Group C1 at 6 hours ⓘ Group C1 at 9 hours ⓙ Group C1 at 12 hours
2.2 细胞转染后荧光显微镜观察及蛋白检测
转染后A组均未见绿色荧光表达；B、C组可见表达量较高的绿色荧光，转染率约60%。见图 2。Western blot检测示，转染后48 h，C组可见Akt1蛋白条带表达，B组条带表达很微弱（图 3）。C组灰度值为33.76±0.42，显著高于B组的23.40±0.34，差异有统计学意义（t=17.525，P=0.013）。
2.3 缺氧干预后相关检测
2.3.1 流式细胞仪检测细胞凋亡率和死亡率
组内比较：B1组缺氧干预后各时间点细胞凋亡率和死亡率均逐渐增高，各时间点间比较差异有统计学意义（P<0.05）；C1组细胞凋亡率和死亡率在缺氧干预后3 h短暂下降，之后随时间延长逐渐增高，各时间点间比较差异有统计学意义（P<0.05）。组间比较：除0h B1、C1组间比较细胞凋亡率和死亡率差异无统计学意义（t=1.009，P=0.185；t=1.380，P=0.119）外，其余各时间点C1组细胞凋亡率和死亡率均显著低于 B1组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4，表 1、2。
表1
缺氧干预各时间点B1、C1组细胞凋亡率比较（n=3，%，
表2
缺氧干预各时间点B1、C1细胞死亡率比较（n=3，%，2.3.2 MTT法检测细胞增殖情况
B、C组各时间点A值均显著高于B1、C1组，差异有统计学意义（P<0.05）；C组各时间点A值均显著高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）；B1组缺氧干预后6、9、12 h A值显著低于C1组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
常氧和缺氧培养各时间点各组细胞生长曲线 图 6 Western blot检测B1、C1组缺氧干预各时间点Caspase-3表达 1：0 h 2：3 h 3：6 h 4：9 h 5：12 h 图 7 Western blot检测B1、C1组缺氧干预各时间点Caspase-3相对表达量
Figure5.
Cell growth curve at each time point under normoxia and hypoxia conditions Fig. 6 Caspase-3 expression in groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention 1: 0 h 2: 3 h 3: 6 h 4: 9 h 5: 12 h Fig. 7 Relative expression of Caspase-3 in groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention
2.3.3 Western blot法检测Caspase-3表达
缺氧干预后B1组Caspase-3表达明显上调，3 h时Caspase-3表达达峰值，显著高于其余各时间点，差异有统计学意义（P<0.05），随时间推移逐渐下调；而C1组缺氧干预后Caspase-3表达呈先缓慢上升后下降趋势，各时间点间比较差异无统计学意义（P>0.05）。与B1组比较，除0h外C1组缺氧干预后各时间点Caspase-3表达均显著下调，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 6、7。
3 讨论
急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，临床表现多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，可并发恶性心律失常、休克或心力衰竭，已成为全球首位死因。目前的标准疗法包括药物治疗（溶栓）、介入治疗（支架植入）和外科手术（冠状动脉搭桥），这些方法虽然能改善患者症状甚至实现冠状动脉的血运重建，但不能使已死亡的心肌细胞获得再生[9]。理论上最理想的治疗方法是重生梗死区域心肌细胞，目前研究最多的是干细胞移植。BMSCs因具有取材方便、低免疫原性、多向分化潜能和增殖能力、无伦理学问题并且无致癌性等优点[10]，是目前使用最多的组织工程种子细 胞。
Perin等[11]将BMSCs移植于14例慢性心肌梗死患者，证实干细胞移植能改善心肌血供和左心室功能。Chen等[12]应用自体血清培养的BMSCs移植至经皮冠脉介入术后18 d的患者，随访3个月发现BMSCs移植可明显改善左心室功能，SPECT扫描显示移植组的灌注缺损比未移植对照组显著改善。但移植干细胞的低存活率是公认难题，因此，Moon等[13]通过VEGF基因转染BMSCs同种异体移植治疗大鼠急性心肌梗死，结果表明转染加细胞移植对大鼠心功能改善优于单纯细胞移植，可能与VEGF的新生血管作用提高了移植细胞存活率有关。Mangi等[14]在体外应用反转录病毒转导Akt1前体基因对BMSCs进行修饰并移植至大鼠缺血心肌中，引起梗死心肌再生而使梗死面积减小，心脏功能几乎恢复至正常水平，但其具体机制尚不清楚。鉴于Akt既是细胞存活的信号介质又是细胞存活的必要因素[15]，本研究选择Akt基因作为目的基因，通过对分裂细胞和非分裂细胞均具有很好的感染能力，且能将目的基因整合到细胞核，使其具有长效稳定表达能力[16-18]的LVs作为载体转染BMSCs，观察其可否减少BMSCs的凋亡和死亡，从而为通过干细胞修饰提高BMSCs治疗心肌梗死的效果提供依据。
我们在预实验中发现脂质体介导转染Akt1基因在转染后不能形成稳定有效的表达，且随时间推移转染后荧光表达水平逐渐减弱。故本研究选择LVs作为转染载体，结果显示Akt1基因成功转入BMSCs内，并稳定表达绿色荧光。通过流式细胞仪及MTT检测分析发现，转染Akt1基因的BMSCs较未转染的BMSCs在缺氧条件下能显著抑制细胞凋亡并促进细胞增殖，说明Akt1基因能提高BMSCs的缺氧耐受。Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活与超常表达均会引起细胞凋亡，因此又称为死亡蛋白酶，可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡[19]。Caspase-3是处于凋亡反应的下游元件，是最重要的效应型Caspase，是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一。本实验通过Western blot检测凋亡相关因子Caspase-3的表达水平发现，缺氧条件下未转染Akt1基因的细胞Caspase-3表达水平明显上调，且呈时间依耐性，转染Akt1基因的BMSCs较未转染的BMSCs在缺氧干预各时间点Caspase-3表达水平明显下调。进一步说明Akt1基因在缺氧条件下能通过抑制凋亡相关因子的表达而抑制细胞凋亡。
综上述，本研究提示Akt1基因转染BMSCs可显著提高BMSCs的缺氧耐受能力，可能是通过转染Akt1基因提高BMSCs移植后存活率，从而提高了干细胞移植治疗急性心肌梗死的疗效。另外，Akt1基因转染BMSCs提高BMSCs耐缺氧能力可能涉及到改善BMSCs缺氧时摄糖改变等方面，均有待进一步研究明确。
目前，世界范围内心肌梗死导致的心血管疾病危害严重，但预防治疗存在明显不足，探索有效治疗方法迫在眉睫。2001年Orlic等[1]报道BMSCs可再生心肌后，干细胞治疗心肌梗死成为研究热点。但在各种干细胞移植治疗心肌梗死的研究中，移植后干细胞在缺血、缺氧梗死区的存活率极低[2-3]。因此提高干细胞的耐缺血、缺氧能力可能是改善干细胞移植治疗心肌梗死的关键。Akt功能涉及细胞周期调控、凋亡的启动、血管生成、端粒酶活性和细胞侵袭性等诸多方面[4]。在PI3K/Akt途径中生成的Akt蛋白在PI3K等作用下充分活化，参与介导细胞生长、增殖等[5-6]，其既是细胞存活的信号介质，又是细胞存活的必要因素[7]，持续存在可避免细胞损伤[8]。鉴于此，本研究以BMSCs为种子细胞，Akt1为抗凋亡目的基因，经重组慢病毒（lentivirus，LVs）介导Akt1基因转染BMSCs，探讨在缺氧条件下Akt1是否能提高BMSCs的抗凋亡及增殖能力（即缺氧耐受能力），为提高干细胞移植治疗心肌梗死的疗效提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
3～5周龄SD大鼠20只，雌雄不限，体质量150～200 g，由西南医科大学实验动物中心提供。
标准FBS（HyClone公司，美国）；DMEM/F12培养基（GIBCO公司，美国）；膜联蛋白V（Annexin V）-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染色试剂盒（宝灵曼公司，德国）；过表达Akt1慢病毒载体[pLVX-增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）-3FLAG]、不含Akt1的病毒载体（pLVX-EGFP）、Polybrene（上海生博生物医药科技有限公司）；Akt1多克隆抗体（武汉艾美捷科技有限公司）；兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）多克隆抗体、内参照β-actin（北京博奥生物技术有限公司）。
超净工作台（Ibemotol公司，美国）；低温离心机（Hitachi公司，日本）；三通气孵育箱（上海力康生物医疗科技控股有限公司）；BX-70倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；S70荧光显微镜（Leica Demirb公司，德国）；超低温冰箱（Thermo公司，美国）；FACSC Alibur流式细胞仪、Kaluza流式细胞仪分析软件（B&D公司，美国）；台式高速冷冻离心机（Beckman公司，美国）； Tannon2500凝胶成像扫描系统（Bio-Rad公司，美国）； LabWorks软件（UVP公司，美国）。
1.2 大鼠BMSCs的分离培养
取SD大鼠颈椎脱臼法处死，将剪下的股骨分别剪去两端，暴露骨髓腔，吸取5 mL含15%FBS的DMEM培养液，加入10%肝素冲洗骨髓腔3～4 次，吸管吹打混匀，将滤液贴壁轻轻加入至含等体积Percoll分离液（1.073 g/mL）的离心管中，以离心半径5 cm、2 500 r/min离心20 min；收集单个核细胞于另一离心管中，DMEM/F12培养液离心（离心半径5cm、1 000 r/min，5 min）洗涤2次；用含15%FBS的DMEM重悬细胞，以（1.5～2.0）×105个/cm2密度接种于培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。待贴壁细胞达80%～90%融合后，弃培养液，PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶室温下消化，以1∶2比例传代，取第3代细胞用于实验。
1.3 细胞转染和验证
1.3.1 细胞转染
取第3代BMSCs分为3组，分别为空白对照组（A组，不添加任何转染试剂）、对照组（B组，加入pLVX-EGFP及转染增强剂Polybrene）、Akt1慢病毒载体组（C组，加入pLVX-EGFP-3FLAG及转染增强剂Polybrene）。具体步骤：实验前1 d用PBS清冼BMSCs 2遍，0.25%胰蛋白酶消化后以（3～5）×105个/cm2密度接种至6孔培养板上，每孔1 mL，DMEM培养液培养24 h。B、C组将相应病毒置于冰块上慢慢融化，根据预实验结果以感染复数10分别加入11 μL pLVX-EGFP病毒液（滴度为1.81×108 TU/mL）和7 μL pLVX-EGFP-3FLAG病毒液（滴度为2.84×108 TU/mL）；取2 μL Polybrene（1mg/ mL）稀释至400 μL，B、C组分别加入10 μL；混匀后继续培养。8～12 h后更换为新鲜DMEM培养基，转染2～3 d后荧光显微镜观察。
1.3.2 转染后Western blot法验证Akt1蛋白表达
取转染48 h后的B、C组BMSCs，用4℃预冷1×PBS工作液轻柔洗涤细胞2次，0.25%胰蛋白酶消化提纯后重复PBS漂洗步骤，提取总蛋白，采用SDS-PAGE凝胶电泳法检测蛋白表达，以验证Akt1基因是否转染成功。
1.4 缺氧干预后相关检测
1.4.1 实验分组
将上述B、C组培养的BMSCs分别置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱进行缺氧干预（分别为B1、C1组）。
1.4.2 流式细胞仪检测细胞凋亡
取缺氧干预0、3、6、9、12 h的B1、C1组BMSCs，PBS洗涤3次，以0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞悬液于离心管中，以离心半径5cm、1 000 r/min离心10 min，弃上清。调整细胞密度为1×106个/mL，取100μL细胞悬液，用Annexin V-FITC/PI试剂盒行双染，常规调试流式细胞仪后，激发光波长为488nm，用515 nm波长通带滤器检测FITC荧光，560nm波长滤器检测PI。将对照管非特异荧光的99%以上作为本底扣除，以二维点阵图显示，记录细胞凋亡率和死亡率。在双变量流式细胞散点图上，左下象限显示活细胞（Annex inV-FITC-/PI-），右上象限为死亡细胞（AnnexinV-FITC+/PI+），而右下象限为凋亡细胞（Annexin V-FITC+/PI-），总计分析10 000个细胞。实验重复3次。
1.4.3 MTT法检测细胞增殖情况
取B、B1、C、C1组培养0、3、6、9、12 h的细胞，分别于每孔中加入0.5% MTT溶液20 μL，37℃、5%CO2条件下继续培养4 h；弃培养液，PBS清洗2～3次，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速震荡10 min，于酶联免疫检测仪波长490 nm处测吸光度（A）值，并绘制细胞生长曲线。
1.4.4 Western blot法检测Caspase-3表达
取缺氧干预0、3、6、9、12 h的B1、C1组细胞，以RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA试剂盒进行蛋白定量，取60～80 μg/孔蛋白质进行10%SDS-PAGE，将电泳分离后的蛋白电转移至聚偏二氟乙烯膜上，取出膜以5%脱脂奶粉25℃封闭1 h。封闭结束用PBS洗膜1次（10 min），加入活性Caspase-3抗体（1∶1000）及内参抗β-actin抗体（1∶2 000），4℃反应过夜；PBS洗膜3次（15 min 1次、5 min 2 次），加入辣根过氧化物酶标记抗兔IgG（1∶3000）摇床1 h；PBS洗膜3次（每次5 min），增强化学发光试剂ECL显色。以Quantity One图像分析软件对结果进行分析，以目的蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较以及组内各时间点间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验；两组间比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 BMSCs形态学观察
骨髓单个核细胞接种于培养瓶后呈圆形，大小不一，悬浮于培养液中；24 h后部分细胞开始贴壁，呈球形或梭形；3 d后可见少量梭形、星形或纺锤形细胞分散贴壁生长，伸出伪足呈逗点状或短棒状；7 d后细胞集落呈放射状排列，有参差不齐、粗细不一的突起伸出，细胞核较大，核仁清晰可见，混有较多杂质；约14 d细胞融合达80%～90%，呈漩涡状。传代细胞贴壁快，24 h内全部贴壁、伸展，增殖迅速，均匀分布生长；5～6 d细胞贴壁融合率达80%～90%，形态均一，呈长梭形，铺满培养皿形成单层，呈“鱼群状”排列。见图 1。
图1
大鼠BMSCs形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 原代培养7 d ⓑ 原代培养14 d ⓒ 第3代细胞培养5 d 图 2 B、C组细胞转染后荧光显微镜观察（×100） ⓐ B组 ⓑ C组 图 3 Western blot 检测转染48 h后B、C组Akt1蛋白表达 1：C组 2：B组 图 4 流式细胞仪检测缺氧干预各时间点B1、C1组细胞凋亡及死亡情况 ⓐ B1组0 h ⓑ B1组3 h ⓒ B1组6 h ⓓ B1组9 h ⓔ B1组12h ⓕ C1组0 h ⓖ C1组3 h ⓗ C1组6 h ⓘ C1组9 h ⓙ C1组12 h
Figure1.
Morphological observation of rat BMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ Primary BMSCs cultured for 7 days ⓑ Primary BMSCs cultured for 14 days ⓒ The 3rd generation BMSCs cultured for 5 days Fig. 2 Fluorescence microscope observation of BMSCs in groups B and C after transfection (×100) ⓐ Group B ⓑ Group C Fig. 3 Akt1 protein expression in groups B and C at 48 hours after transfecion by Western blot 1: Group C 2: Group B Fig. 4 Apoptosis and cell death observation of groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention by flow cytometry ⓐ Group B1 at 0 hour ⓑ Group B1 at 3 hours ⓒ Group B1 at 6 hours ⓓ Group B1 at 9 hours ⓔ Group B1 at 12 hours ⓕ Group C1 at 0 hour ⓖ Group C1 at 3 hours ⓗ Group C1 at 6 hours ⓘ Group C1 at 9 hours ⓙ Group C1 at 12 hours
2.2 细胞转染后荧光显微镜观察及蛋白检测
转染后A组均未见绿色荧光表达；B、C组可见表达量较高的绿色荧光，转染率约60%。见图 2。Western blot检测示，转染后48 h，C组可见Akt1蛋白条带表达，B组条带表达很微弱（图 3）。C组灰度值为33.76±0.42，显著高于B组的23.40±0.34，差异有统计学意义（t=17.525，P=0.013）。
2.3 缺氧干预后相关检测
2.3.1 流式细胞仪检测细胞凋亡率和死亡率
组内比较：B1组缺氧干预后各时间点细胞凋亡率和死亡率均逐渐增高，各时间点间比较差异有统计学意义（P<0.05）；C1组细胞凋亡率和死亡率在缺氧干预后3 h短暂下降，之后随时间延长逐渐增高，各时间点间比较差异有统计学意义（P<0.05）。组间比较：除0h B1、C1组间比较细胞凋亡率和死亡率差异无统计学意义（t=1.009，P=0.185；t=1.380，P=0.119）外，其余各时间点C1组细胞凋亡率和死亡率均显著低于 B1组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 4，表 1、2。
表1
缺氧干预各时间点B1、C1组细胞凋亡率比较（n=3，%，
表2
缺氧干预各时间点B1、C1细胞死亡率比较（n=3，%，2.3.2 MTT法检测细胞增殖情况
B、C组各时间点A值均显著高于B1、C1组，差异有统计学意义（P<0.05）；C组各时间点A值均显著高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）；B1组缺氧干预后6、9、12 h A值显著低于C1组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 5。
图5
常氧和缺氧培养各时间点各组细胞生长曲线 图 6 Western blot检测B1、C1组缺氧干预各时间点Caspase-3表达 1：0 h 2：3 h 3：6 h 4：9 h 5：12 h 图 7 Western blot检测B1、C1组缺氧干预各时间点Caspase-3相对表达量
Figure5.
Cell growth curve at each time point under normoxia and hypoxia conditions Fig. 6 Caspase-3 expression in groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention 1: 0 h 2: 3 h 3: 6 h 4: 9 h 5: 12 h Fig. 7 Relative expression of Caspase-3 in groups B1 and C1 at different time points after hypoxia intervention
2.3.3 Western blot法检测Caspase-3表达
缺氧干预后B1组Caspase-3表达明显上调，3 h时Caspase-3表达达峰值，显著高于其余各时间点，差异有统计学意义（P<0.05），随时间推移逐渐下调；而C1组缺氧干预后Caspase-3表达呈先缓慢上升后下降趋势，各时间点间比较差异无统计学意义（P>0.05）。与B1组比较，除0h外C1组缺氧干预后各时间点Caspase-3表达均显著下调，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 6、7。
3 讨论
急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，临床表现多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，可并发恶性心律失常、休克或心力衰竭，已成为全球首位死因。目前的标准疗法包括药物治疗（溶栓）、介入治疗（支架植入）和外科手术（冠状动脉搭桥），这些方法虽然能改善患者症状甚至实现冠状动脉的血运重建，但不能使已死亡的心肌细胞获得再生[9]。理论上最理想的治疗方法是重生梗死区域心肌细胞，目前研究最多的是干细胞移植。BMSCs因具有取材方便、低免疫原性、多向分化潜能和增殖能力、无伦理学问题并且无致癌性等优点[10]，是目前使用最多的组织工程种子细 胞。
Perin等[11]将BMSCs移植于14例慢性心肌梗死患者，证实干细胞移植能改善心肌血供和左心室功能。Chen等[12]应用自体血清培养的BMSCs移植至经皮冠脉介入术后18 d的患者，随访3个月发现BMSCs移植可明显改善左心室功能，SPECT扫描显示移植组的灌注缺损比未移植对照组显著改善。但移植干细胞的低存活率是公认难题，因此，Moon等[13]通过VEGF基因转染BMSCs同种异体移植治疗大鼠急性心肌梗死，结果表明转染加细胞移植对大鼠心功能改善优于单纯细胞移植，可能与VEGF的新生血管作用提高了移植细胞存活率有关。Mangi等[14]在体外应用反转录病毒转导Akt1前体基因对BMSCs进行修饰并移植至大鼠缺血心肌中，引起梗死心肌再生而使梗死面积减小，心脏功能几乎恢复至正常水平，但其具体机制尚不清楚。鉴于Akt既是细胞存活的信号介质又是细胞存活的必要因素[15]，本研究选择Akt基因作为目的基因，通过对分裂细胞和非分裂细胞均具有很好的感染能力，且能将目的基因整合到细胞核，使其具有长效稳定表达能力[16-18]的LVs作为载体转染BMSCs，观察其可否减少BMSCs的凋亡和死亡，从而为通过干细胞修饰提高BMSCs治疗心肌梗死的效果提供依据。
我们在预实验中发现脂质体介导转染Akt1基因在转染后不能形成稳定有效的表达，且随时间推移转染后荧光表达水平逐渐减弱。故本研究选择LVs作为转染载体，结果显示Akt1基因成功转入BMSCs内，并稳定表达绿色荧光。通过流式细胞仪及MTT检测分析发现，转染Akt1基因的BMSCs较未转染的BMSCs在缺氧条件下能显著抑制细胞凋亡并促进细胞增殖，说明Akt1基因能提高BMSCs的缺氧耐受。Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活与超常表达均会引起细胞凋亡，因此又称为死亡蛋白酶，可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡[19]。Caspase-3是处于凋亡反应的下游元件，是最重要的效应型Caspase，是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一。本实验通过Western blot检测凋亡相关因子Caspase-3的表达水平发现，缺氧条件下未转染Akt1基因的细胞Caspase-3表达水平明显上调，且呈时间依耐性，转染Akt1基因的BMSCs较未转染的BMSCs在缺氧干预各时间点Caspase-3表达水平明显下调。进一步说明Akt1基因在缺氧条件下能通过抑制凋亡相关因子的表达而抑制细胞凋亡。
综上述，本研究提示Akt1基因转染BMSCs可显著提高BMSCs的缺氧耐受能力，可能是通过转染Akt1基因提高BMSCs移植后存活率，从而提高了干细胞移植治疗急性心肌梗死的疗效。另外，Akt1基因转染BMSCs提高BMSCs耐缺氧能力可能涉及到改善BMSCs缺氧时摄糖改变等方面，均有待进一步研究明确。
