引用本文： 贾瀛娴, 李尚为, 汪燕. MSCs在女性生育力保存中的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2016, 30(3): 314-319. doi: 10.7507/1002-1892.20160062 复制
生殖医学和深低温生物学的发展，使得女性生育力保存（fertility preservation，FP）技术得以实施。FP所涵盖范围较广泛，它不仅指推迟生育年龄的健康人，也包括因某些疾病影响生育的患者。目前最新的《美国临床肿瘤学会临床实践指南》已将肿瘤患者的FP纳入参考[1]。根据荷兰的一项问卷调查结果，虽然分诊至FP中心的总体人数在上升，但获得治疗的患者仅占极少部分[2]，诸多原因使需要保存生育力的女性患者未得到有效的FP治疗，导致其推迟或失去生育机会，对生活质量产生长期不良影响。除了社会因素外，疾病本身比如各种因素导致的卵泡耗竭、间质纤维化和血管损伤等，也可能使卵巢功能严重受损。如何修复受损的卵巢功能和保存女性生育能力成为国内外学者研究的重点。
自21世纪以来，人们对MSCs在组织修复再生、恢复功能、免疫抑制等诸多方面的应用进行了探究。目前，MSCs已用于治疗多种组织损伤性疾病，如神经[3-4]、心肌[5-6]、肝[7]、肺[8]、骨骼[9]、肌肉[10]等；另外，MSCs还可在特定条件下向生殖干细胞（oogonial stem cells，OSCs）或卵母细胞样细胞分化[11-13]，显示了其强大的临床应用价值。现对MSCs在FP中的研究进展进行综述，为优化该技术，提高患者生育力的研究提供参考，为预防和解决卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）、保存和恢复女性生殖内分泌功能探索新的思路。
1 女性FP的背景
1.1 女性生育力下降的原因
1.1.1 医源性因素
调查数据显示，美国每年有60万女性被确诊为癌症，其中10%患者年龄在40岁以下，12%乳腺癌患者年龄在35岁以下[14]，提示恶性肿瘤发病呈年轻化趋势。另外，目前癌症女性患者5年生存率达64%[15]，通过肿瘤诊断和治疗技术的发展显著提高了肿瘤患者的平均寿命。但卵巢组织对有细胞毒性的治疗，特别是烷化剂（如环磷酰胺）和放疗非常敏感，可导致生育能力和生殖内分泌功能丧失，使这些接受治疗的女性患者发生POF的风险增加。由于癌症患者对FP认识的缺乏，以及肿瘤医师未充分考虑治疗方案对生育力的影响等原因[16]，也可能导致女性患者错失保存生育力的机会[17]。除了肿瘤患者，因各种结缔组织疾病（如系统性红斑狼疮）、血液系统疾病（如接受自体或同种异体骨髓移植者）、神经系统疾病（如多发性硬化病）也需要服用大剂量烷化剂等化疗和/或放疗进行预处理的患者，同样面临着卵泡耗竭的危险。经造血干细胞移植、骨髓移植治疗后，患者发生生育力下降和卵巢功能不足的风险超过80%[18]。此外，利用卵巢抗原作为免疫避孕疫苗或卵巢相关疾病（如卵巢巧克力囊肿剥除）术后[19]也可能造成医源性卵巢损伤，最终导致女性生育力下降。
1.1.2 其他原因
目前，由于经济压力、晚婚率和离婚率逐渐升高等原因，使得很多国家女性推迟生育的现象越来越普遍。据统计，这类女性将生育计划安排至35岁以后甚至更大年龄。美国生殖医学协会统计显示，2003年－2009年年龄40岁以上因不孕症就诊的女性数量从9%增长至41%[20]。高龄女性发生生理性卵巢储备低下以卵巢功能衰退为主要内分泌改变，引起一系列生理、病理变化，对这类健康女性的生育力造成不可逆转的影响。此外，越来越多研究发现环境污染对人生育力的不良影响[21-23]。目前，全球不孕症患病率达9%，其中15%病因不明[24]。由于损失时间短，不能用基因改变来解释，因此发病趋势可能与环境污染物有关[25]。学者将进入机体后能干扰体内正常内分泌物质合成、释放、转运、代谢、结合、作用和排出等过程的外源性化学物质统称为环境内分泌干扰物（endocrine disruptors，EDs）[26]。EDs在自然界中广泛存在，可通过食品、水、空气等多种途径进入食物链，因具有脂溶性及不易降解的特点，使其在人体和动物体内长期蓄积并通过食物链富集。这些有害物质可以受体激动剂或拮抗剂作用方式，模拟激活或阻断靶细胞对相应激素的反应，对女性生育力造成损害。研究发现[21, 27-29]，EDs可能通过改变卵泡微环境，使卵子质量下降，影响卵泡发育、卵母细胞成熟及卵巢功能，造成机体生殖能力下降，可见EDs毒性作用严重影响女性生殖健康。
综上述，女性生育力下降可能是一个或多个因素造成。这些因素使女性卵巢储备下降，出现窦卵泡数减少、闭经、月经期缩短、黄体功能不足等卵巢功能损伤表现，最终对生育力造成不可逆转的后果，严重影响患者生活质量。
1.2 女性FP技术介绍
目前，保存女性生育力的主要技术包括：卵子冷冻、胚胎冷冻、卵巢移位、不成熟卵母细胞的体外培养成熟、卵巢组织冷冻保存（ovarian tissue cryopreservation，OTC）及再植等[30]。其中，OTC手术操作相对简便，能一次性获得大量各阶段卵泡，且不受有无配偶的限制。其手术创伤小，患者术后即可开始肿瘤治疗（包括盆腔放疗），不延误病情，还可避免促排卵过程中引起的其他不良后果，如肿瘤恶化、肿瘤转移、卵巢过度刺激等。卵巢组织通过移植可重新启动卵泡的生长发育、月经期规律、正常性激素水平，恢复卵巢功能。有生育要求的患者多可自然受孕或求助于辅助生殖技术获得后代，对其日后生理、心理健康意义重大[31]。OTC技术也可用于其他原因引起的卵巢功能减退健康女性，最终改善其生育能力。近年来，冻存卵巢组织移植已取得了较大进展，全世界经OCT技术后的活产报道已有42例[26-27, 32-33]。但是，卵巢组织复苏后如何经体外培养获得健康成熟的卵子、如何减轻免疫排斥反应和移植后组织缺血再灌注损伤，从而促使移植物功能的早期恢复，延长移植物的生存年限等问题，仍是OTC技术有待解决的主要难点。
2 MSCs与生殖细胞损伤修复
2.1 MSCs的来源及功能
干细胞是近年来细胞生物学和医学研究中最热门的课题之一。干细胞是来自胚胎、胎儿或成人的一类特殊细胞，具有长期自我复制能力和多向分化潜能。其中，MSCs因来源丰富（几乎包括所有的器官和组织，如骨髓、肌肉、脂肪、脐带血、胎盘等[34]），易于分离获得及体外扩增[35]，具有多向分化潜能[36]、迁移能力、再生潜力，并因其在伦理道德、法律法规等方面的优势，成为目前应用最多的干细胞及细胞移植理想的种子细胞。目前MSCs临床应用广泛，如用于肺纤维化修复、类风湿和肝硬化后肝功能修复等，并可作为基因治疗的载体细胞[37-39]。由于MSCs无免疫原性，能避免移植排斥反应，可作为免疫调节剂[40]。
2.2 MSCs对生殖细胞修复应用的研究及作用机制
大多数肿瘤化疗药物都具有腺毒性。例如，顺铂是一类具有较强毒性的化疗药物，不仅抑制DNA的合成，导致DNA损害，还可引起细胞凋亡。Borovskaya等[41]发现顺铂可导致卵泡形态学破坏，细胞核裂解，卵泡上皮细胞死亡。临床上放化疗在极大程度缓解癌症病情同时，也对卵巢组织造成严重不可逆损伤，导致POF，最终使肿瘤治疗后患者生育力下降。
由于MSCs具有对受损组织细胞的修复作用，近年来许多研究提出采用MSCs对化疗药物损伤的卵巢组织进行干预，其中来源于骨髓的BMSCs应用最广泛。Abd-Allah等[42]将BMSCs移植至接受环磷酰胺诱导POF的兔体内，发现卵巢体积、各级卵泡数等均较未移植细胞对照组明显增加。Guo等[43]将BMSCs和卵巢颗粒细胞共培养，发现BMSCs可降低顺铂导致的大鼠颗粒细胞凋亡，将BMSCs移植至卵巢可降低围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡。这一作用可能与BMSCs分泌IGF-1、肝细胞生长因子和VEGF等有关。这一结论与Xu等[44]研究结果一致。Ghadami等[45]通过给促卵泡激素受体基因敲除小鼠静脉移植BMSCs，发现其能到达小鼠卵巢，恢复卵泡成熟和类固醇激素产生。此外，有学者认为，BMSCs还可通过上调抗凋亡基因的表达，预防化疗药物对正常机体细胞的毒副作用[46]。
目前认为MSCs修复损伤后卵巢组织的机制可能为：①通过分泌细胞因子抑制靶细胞凋亡，修复受损组织细胞；②可采用多种分泌方式，表达相关因子，促进卵泡生长；③在特定微环境诱导下分化为受损组织的细胞，部分补偿或替代其功能。
2.3 MSCs与卵巢组织移植后的血管重建
据文献报道，卵巢组织冻融过程中有7%卵泡丢失，而在移植后血管再形成中可有65%卵泡丢失[47]。卵泡丢失的主要原因是移植后卵巢组织缺血缺氧，说明卵巢组织移植成功的关键在于移植后血管的再形成。卵巢组织移植是一种无血管吻合的卵巢组织皮质移植，由于没有血管吻合，移植后卵巢组织的血供完全依靠周围毛细血管的生长，在移植后48 h内组织处于缺血缺氧状态，会造成大量卵泡破坏损伤。而血管生成是生理性创伤修复中的一个重要环节，包括新生血管网的增殖、成熟、退化3个阶段，与一系列血管生成调节因子共同表达和参与有关，且受到严格调控。VEGF、FGF、TGF-β等多种生长因子均参与卵巢血管形成[48]。卵巢组织移植后，应尽早恢复对卵巢的供血和供氧，减少缺血再灌注损伤中的过量活性氧生成，可防止移植物功能恢复的延迟和功能衰竭，也是卵泡能否再发育的关键。
为寻找更有效方法诱导和加速移植卵巢组织的新生血管化过程，减少移植卵巢组织的缺血损伤，有研究者在卵巢培养系统中加入相关因子（如VEGF、bFGF[49]），结果显示可明显促进卵巢组织的新生血管生成、促进卵泡发育[50]。然而由于这些因子半衰期短、易降解且长期使用存在安全性因素等问题，限制了其今后在FP方面的应用。另外，研究发现促性腺激素（如重组人促卵泡刺激素、孕马血清促性腺激素[51-52]）可调节卵巢内血管生长因子水平、促进卵泡发育，但目前关于外源性促性腺激素对同种异种卵巢组织移植后卵泡发育的作用及安全性尚存在争议[51]。因此，应用生长相关因子或外源性激素促进移植后卵巢组织功能的方法有待进一步研究明确。
近年来，研究发现移植MSCs后能分泌如VEGF、bFGF、血管生成素、IL-6等多种促血管新生因子[53-56]。BMSCs与卵巢组织共培养后可明显改善卵巢组织血管再生、促进卵泡生长[53]，从而改善其功能恢复，且BMSCs作用较添加生长相关因子更显著。张芍等[57]将大鼠MSCs与窦前卵泡共培养，结果发现卵泡轮廓清楚，基底膜完整，卵母细胞中可见生发泡（germinal vesicle，GV），且较对照组（正常培养的窦前卵泡）获得了更高的GV出现率，提示MSCs可促进卵泡中的卵母细胞生长、发育，抑制早期闭锁，并能向成熟卵母细胞转化。另外，有研究发现脐带MSCs可特异性迁移归巢至炎症组织，通过旁分泌、定向分化等机制改善炎症环境，对损伤组织进行修复[58-59]。当组织损伤或引起慢性炎症时，损伤部位或炎症区域会释放特殊的内分泌信号，局部表达及分泌多种趋化因子、黏附因子、生长因子，这一系列微环境改变是MSCs归巢的始动因素，导致MSCs向损伤部位迁移[60]，同时表达特异性受体或配体引导MSCs移动并黏附于损伤处[61]。因此，向缺血或损伤组织归巢是MSCs重要的特征。
目前认为，MSCs促进血管生成主要有两方面作用：①产生多种细胞因子和生长因子，如VEGF、bFGF、肝细胞生长因子、IL-1等，诱导血管发生[62-64]；②通过多种受体趋化，定向移动并可能分化为血管内皮细胞，参与缺血组织的血管形成，还可通过旁分泌作用刺激周围内皮细胞增殖和迁移[64-65]。
2.4 MSCs的OSCs分化潜能
传统发育生物学认为，雌性哺乳动物只具备有限的卵母细胞储备池，卵母细胞主要发生在胎儿卵巢中，在胎儿发育期就失去了产生卵母细胞的能力，因此许多POF患者由于缺乏卵子，尚不能通过辅助生殖技术或其他治疗手段使其生育具有母源性遗传物质的子代。然而，最近一些研究结果颠覆了这一传统观点，认为动物卵巢内卵泡的数量并非完全固定，在某些条件下卵泡是可以再生的[66]。因此研究者推测与雄性动物相似，雌性动物出生后也有OSCs维持卵子发生[67-69]。但不能确定产生新卵母细胞的OSCs定位于何处。
MSCs具有多向分化潜能，在体外合适的诱导条件下可分化为中胚层及其他胚层细胞。最新研究结果表明，胚胎干细胞和成体干细胞（如BMSCs等）在特定培养条件下可向卵母细胞样细胞分化[11, 70-71]。研究还发现脐带MSCs也具有分化为卵母细胞样细胞的潜能，首先八聚体结合蛋白4、生殖胚胎干细胞富集蛋白、干扰素介导跨膜蛋白3等生殖系标记物在脐带MSCs表面有不同程度的表达，在含有5%、10%、20%等不同浓度卵泡液的诱导条件下，脐带MSCs可聚集分化形成卵母细胞样细胞的结构[13]。也有研究先将脐带MSCs进行悬滴培养，使其能够形成类胚体，进而采用类胚体与人或小鼠卵巢颗粒细胞共培养后，均能表达生殖细胞早期分化特异性标记物特殊期胚胎抗原（stage-specific embyronic antigen 1，SSEA-1）、联会复合体蛋白3和生长分化因子9 [12]。许多研究通过移植标记后的脐带MSCs[72-73]，发现其可迁移至卵巢，提示脐带MSCs移植后可在体内定位和增殖，具有修复卵巢组织并可能向生殖细胞分化的潜能。有研究从小鼠BMSCs中分离出能表达SSEA-1的多能干细胞，加入BMP-4后成功诱导其向原始生殖细胞（primordialgermcells，PGCs）分化，但未能将PGCs进一步诱导形成晚期生殖细胞[11-13]。如在体外和体内微环境条件下将MSCs诱导分化为有功能的卵母细胞，则有可能通过辅助生殖技术使POF患者重获生育能力，保存物种的多样性，并在更大程度上满足人类研究与再生医学治疗的需要。
3 小结与展望
目前，MSCs的应用逐渐广泛，其不论是作为干预因素改善卵巢组织损伤，还是作为OSCs来源诱导分化为卵母细胞样细胞，都在再生医学、生殖技术方面表现出应用潜力，为FP技术研究提供了新思路。另外，由于MSCs具有低免疫原性及免疫耐受、免疫调节等功能，是否有助于提升子宫内膜的容受性以增加不孕者的自然受孕率和辅助生殖技术的成功率，针对临床上习惯性流产尤其是免疫性流产患者的治疗，MSCs是否具有保护和治疗作用，相关研究正在积极开展。然而，将MSCs最终应用于临床仍是一漫长复杂的过程，存在许多问题有待进一步解决，如MSCs的作用是否会增加感染和肿瘤的风险，如何提高MSCs向靶器官的归巢能力，MSCs向卵母细胞样细胞分化的启动机制，如何使MSCs更易于获取和纯化鉴定，MSCs长期使用的安全性及伦理性等。相信随着基础研究的逐步深入及临床试验资料的完善，MSCs将作为一种潜力强大的细胞源，为女性改善生育力开辟一条新的技术路线。
生殖医学和深低温生物学的发展，使得女性生育力保存（fertility preservation，FP）技术得以实施。FP所涵盖范围较广泛，它不仅指推迟生育年龄的健康人，也包括因某些疾病影响生育的患者。目前最新的《美国临床肿瘤学会临床实践指南》已将肿瘤患者的FP纳入参考[1]。根据荷兰的一项问卷调查结果，虽然分诊至FP中心的总体人数在上升，但获得治疗的患者仅占极少部分[2]，诸多原因使需要保存生育力的女性患者未得到有效的FP治疗，导致其推迟或失去生育机会，对生活质量产生长期不良影响。除了社会因素外，疾病本身比如各种因素导致的卵泡耗竭、间质纤维化和血管损伤等，也可能使卵巢功能严重受损。如何修复受损的卵巢功能和保存女性生育能力成为国内外学者研究的重点。
自21世纪以来，人们对MSCs在组织修复再生、恢复功能、免疫抑制等诸多方面的应用进行了探究。目前，MSCs已用于治疗多种组织损伤性疾病，如神经[3-4]、心肌[5-6]、肝[7]、肺[8]、骨骼[9]、肌肉[10]等；另外，MSCs还可在特定条件下向生殖干细胞（oogonial stem cells，OSCs）或卵母细胞样细胞分化[11-13]，显示了其强大的临床应用价值。现对MSCs在FP中的研究进展进行综述，为优化该技术，提高患者生育力的研究提供参考，为预防和解决卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）、保存和恢复女性生殖内分泌功能探索新的思路。
1 女性FP的背景
1.1 女性生育力下降的原因
1.1.1 医源性因素
调查数据显示，美国每年有60万女性被确诊为癌症，其中10%患者年龄在40岁以下，12%乳腺癌患者年龄在35岁以下[14]，提示恶性肿瘤发病呈年轻化趋势。另外，目前癌症女性患者5年生存率达64%[15]，通过肿瘤诊断和治疗技术的发展显著提高了肿瘤患者的平均寿命。但卵巢组织对有细胞毒性的治疗，特别是烷化剂（如环磷酰胺）和放疗非常敏感，可导致生育能力和生殖内分泌功能丧失，使这些接受治疗的女性患者发生POF的风险增加。由于癌症患者对FP认识的缺乏，以及肿瘤医师未充分考虑治疗方案对生育力的影响等原因[16]，也可能导致女性患者错失保存生育力的机会[17]。除了肿瘤患者，因各种结缔组织疾病（如系统性红斑狼疮）、血液系统疾病（如接受自体或同种异体骨髓移植者）、神经系统疾病（如多发性硬化病）也需要服用大剂量烷化剂等化疗和/或放疗进行预处理的患者，同样面临着卵泡耗竭的危险。经造血干细胞移植、骨髓移植治疗后，患者发生生育力下降和卵巢功能不足的风险超过80%[18]。此外，利用卵巢抗原作为免疫避孕疫苗或卵巢相关疾病（如卵巢巧克力囊肿剥除）术后[19]也可能造成医源性卵巢损伤，最终导致女性生育力下降。
1.1.2 其他原因
目前，由于经济压力、晚婚率和离婚率逐渐升高等原因，使得很多国家女性推迟生育的现象越来越普遍。据统计，这类女性将生育计划安排至35岁以后甚至更大年龄。美国生殖医学协会统计显示，2003年－2009年年龄40岁以上因不孕症就诊的女性数量从9%增长至41%[20]。高龄女性发生生理性卵巢储备低下以卵巢功能衰退为主要内分泌改变，引起一系列生理、病理变化，对这类健康女性的生育力造成不可逆转的影响。此外，越来越多研究发现环境污染对人生育力的不良影响[21-23]。目前，全球不孕症患病率达9%，其中15%病因不明[24]。由于损失时间短，不能用基因改变来解释，因此发病趋势可能与环境污染物有关[25]。学者将进入机体后能干扰体内正常内分泌物质合成、释放、转运、代谢、结合、作用和排出等过程的外源性化学物质统称为环境内分泌干扰物（endocrine disruptors，EDs）[26]。EDs在自然界中广泛存在，可通过食品、水、空气等多种途径进入食物链，因具有脂溶性及不易降解的特点，使其在人体和动物体内长期蓄积并通过食物链富集。这些有害物质可以受体激动剂或拮抗剂作用方式，模拟激活或阻断靶细胞对相应激素的反应，对女性生育力造成损害。研究发现[21, 27-29]，EDs可能通过改变卵泡微环境，使卵子质量下降，影响卵泡发育、卵母细胞成熟及卵巢功能，造成机体生殖能力下降，可见EDs毒性作用严重影响女性生殖健康。
综上述，女性生育力下降可能是一个或多个因素造成。这些因素使女性卵巢储备下降，出现窦卵泡数减少、闭经、月经期缩短、黄体功能不足等卵巢功能损伤表现，最终对生育力造成不可逆转的后果，严重影响患者生活质量。
1.2 女性FP技术介绍
目前，保存女性生育力的主要技术包括：卵子冷冻、胚胎冷冻、卵巢移位、不成熟卵母细胞的体外培养成熟、卵巢组织冷冻保存（ovarian tissue cryopreservation，OTC）及再植等[30]。其中，OTC手术操作相对简便，能一次性获得大量各阶段卵泡，且不受有无配偶的限制。其手术创伤小，患者术后即可开始肿瘤治疗（包括盆腔放疗），不延误病情，还可避免促排卵过程中引起的其他不良后果，如肿瘤恶化、肿瘤转移、卵巢过度刺激等。卵巢组织通过移植可重新启动卵泡的生长发育、月经期规律、正常性激素水平，恢复卵巢功能。有生育要求的患者多可自然受孕或求助于辅助生殖技术获得后代，对其日后生理、心理健康意义重大[31]。OTC技术也可用于其他原因引起的卵巢功能减退健康女性，最终改善其生育能力。近年来，冻存卵巢组织移植已取得了较大进展，全世界经OCT技术后的活产报道已有42例[26-27, 32-33]。但是，卵巢组织复苏后如何经体外培养获得健康成熟的卵子、如何减轻免疫排斥反应和移植后组织缺血再灌注损伤，从而促使移植物功能的早期恢复，延长移植物的生存年限等问题，仍是OTC技术有待解决的主要难点。
2 MSCs与生殖细胞损伤修复
2.1 MSCs的来源及功能
干细胞是近年来细胞生物学和医学研究中最热门的课题之一。干细胞是来自胚胎、胎儿或成人的一类特殊细胞，具有长期自我复制能力和多向分化潜能。其中，MSCs因来源丰富（几乎包括所有的器官和组织，如骨髓、肌肉、脂肪、脐带血、胎盘等[34]），易于分离获得及体外扩增[35]，具有多向分化潜能[36]、迁移能力、再生潜力，并因其在伦理道德、法律法规等方面的优势，成为目前应用最多的干细胞及细胞移植理想的种子细胞。目前MSCs临床应用广泛，如用于肺纤维化修复、类风湿和肝硬化后肝功能修复等，并可作为基因治疗的载体细胞[37-39]。由于MSCs无免疫原性，能避免移植排斥反应，可作为免疫调节剂[40]。
2.2 MSCs对生殖细胞修复应用的研究及作用机制
大多数肿瘤化疗药物都具有腺毒性。例如，顺铂是一类具有较强毒性的化疗药物，不仅抑制DNA的合成，导致DNA损害，还可引起细胞凋亡。Borovskaya等[41]发现顺铂可导致卵泡形态学破坏，细胞核裂解，卵泡上皮细胞死亡。临床上放化疗在极大程度缓解癌症病情同时，也对卵巢组织造成严重不可逆损伤，导致POF，最终使肿瘤治疗后患者生育力下降。
由于MSCs具有对受损组织细胞的修复作用，近年来许多研究提出采用MSCs对化疗药物损伤的卵巢组织进行干预，其中来源于骨髓的BMSCs应用最广泛。Abd-Allah等[42]将BMSCs移植至接受环磷酰胺诱导POF的兔体内，发现卵巢体积、各级卵泡数等均较未移植细胞对照组明显增加。Guo等[43]将BMSCs和卵巢颗粒细胞共培养，发现BMSCs可降低顺铂导致的大鼠颗粒细胞凋亡，将BMSCs移植至卵巢可降低围绝经期大鼠卵巢颗粒细胞凋亡。这一作用可能与BMSCs分泌IGF-1、肝细胞生长因子和VEGF等有关。这一结论与Xu等[44]研究结果一致。Ghadami等[45]通过给促卵泡激素受体基因敲除小鼠静脉移植BMSCs，发现其能到达小鼠卵巢，恢复卵泡成熟和类固醇激素产生。此外，有学者认为，BMSCs还可通过上调抗凋亡基因的表达，预防化疗药物对正常机体细胞的毒副作用[46]。
目前认为MSCs修复损伤后卵巢组织的机制可能为：①通过分泌细胞因子抑制靶细胞凋亡，修复受损组织细胞；②可采用多种分泌方式，表达相关因子，促进卵泡生长；③在特定微环境诱导下分化为受损组织的细胞，部分补偿或替代其功能。
2.3 MSCs与卵巢组织移植后的血管重建
据文献报道，卵巢组织冻融过程中有7%卵泡丢失，而在移植后血管再形成中可有65%卵泡丢失[47]。卵泡丢失的主要原因是移植后卵巢组织缺血缺氧，说明卵巢组织移植成功的关键在于移植后血管的再形成。卵巢组织移植是一种无血管吻合的卵巢组织皮质移植，由于没有血管吻合，移植后卵巢组织的血供完全依靠周围毛细血管的生长，在移植后48 h内组织处于缺血缺氧状态，会造成大量卵泡破坏损伤。而血管生成是生理性创伤修复中的一个重要环节，包括新生血管网的增殖、成熟、退化3个阶段，与一系列血管生成调节因子共同表达和参与有关，且受到严格调控。VEGF、FGF、TGF-β等多种生长因子均参与卵巢血管形成[48]。卵巢组织移植后，应尽早恢复对卵巢的供血和供氧，减少缺血再灌注损伤中的过量活性氧生成，可防止移植物功能恢复的延迟和功能衰竭，也是卵泡能否再发育的关键。
为寻找更有效方法诱导和加速移植卵巢组织的新生血管化过程，减少移植卵巢组织的缺血损伤，有研究者在卵巢培养系统中加入相关因子（如VEGF、bFGF[49]），结果显示可明显促进卵巢组织的新生血管生成、促进卵泡发育[50]。然而由于这些因子半衰期短、易降解且长期使用存在安全性因素等问题，限制了其今后在FP方面的应用。另外，研究发现促性腺激素（如重组人促卵泡刺激素、孕马血清促性腺激素[51-52]）可调节卵巢内血管生长因子水平、促进卵泡发育，但目前关于外源性促性腺激素对同种异种卵巢组织移植后卵泡发育的作用及安全性尚存在争议[51]。因此，应用生长相关因子或外源性激素促进移植后卵巢组织功能的方法有待进一步研究明确。
近年来，研究发现移植MSCs后能分泌如VEGF、bFGF、血管生成素、IL-6等多种促血管新生因子[53-56]。BMSCs与卵巢组织共培养后可明显改善卵巢组织血管再生、促进卵泡生长[53]，从而改善其功能恢复，且BMSCs作用较添加生长相关因子更显著。张芍等[57]将大鼠MSCs与窦前卵泡共培养，结果发现卵泡轮廓清楚，基底膜完整，卵母细胞中可见生发泡（germinal vesicle，GV），且较对照组（正常培养的窦前卵泡）获得了更高的GV出现率，提示MSCs可促进卵泡中的卵母细胞生长、发育，抑制早期闭锁，并能向成熟卵母细胞转化。另外，有研究发现脐带MSCs可特异性迁移归巢至炎症组织，通过旁分泌、定向分化等机制改善炎症环境，对损伤组织进行修复[58-59]。当组织损伤或引起慢性炎症时，损伤部位或炎症区域会释放特殊的内分泌信号，局部表达及分泌多种趋化因子、黏附因子、生长因子，这一系列微环境改变是MSCs归巢的始动因素，导致MSCs向损伤部位迁移[60]，同时表达特异性受体或配体引导MSCs移动并黏附于损伤处[61]。因此，向缺血或损伤组织归巢是MSCs重要的特征。
目前认为，MSCs促进血管生成主要有两方面作用：①产生多种细胞因子和生长因子，如VEGF、bFGF、肝细胞生长因子、IL-1等，诱导血管发生[62-64]；②通过多种受体趋化，定向移动并可能分化为血管内皮细胞，参与缺血组织的血管形成，还可通过旁分泌作用刺激周围内皮细胞增殖和迁移[64-65]。
2.4 MSCs的OSCs分化潜能
传统发育生物学认为，雌性哺乳动物只具备有限的卵母细胞储备池，卵母细胞主要发生在胎儿卵巢中，在胎儿发育期就失去了产生卵母细胞的能力，因此许多POF患者由于缺乏卵子，尚不能通过辅助生殖技术或其他治疗手段使其生育具有母源性遗传物质的子代。然而，最近一些研究结果颠覆了这一传统观点，认为动物卵巢内卵泡的数量并非完全固定，在某些条件下卵泡是可以再生的[66]。因此研究者推测与雄性动物相似，雌性动物出生后也有OSCs维持卵子发生[67-69]。但不能确定产生新卵母细胞的OSCs定位于何处。
MSCs具有多向分化潜能，在体外合适的诱导条件下可分化为中胚层及其他胚层细胞。最新研究结果表明，胚胎干细胞和成体干细胞（如BMSCs等）在特定培养条件下可向卵母细胞样细胞分化[11, 70-71]。研究还发现脐带MSCs也具有分化为卵母细胞样细胞的潜能，首先八聚体结合蛋白4、生殖胚胎干细胞富集蛋白、干扰素介导跨膜蛋白3等生殖系标记物在脐带MSCs表面有不同程度的表达，在含有5%、10%、20%等不同浓度卵泡液的诱导条件下，脐带MSCs可聚集分化形成卵母细胞样细胞的结构[13]。也有研究先将脐带MSCs进行悬滴培养，使其能够形成类胚体，进而采用类胚体与人或小鼠卵巢颗粒细胞共培养后，均能表达生殖细胞早期分化特异性标记物特殊期胚胎抗原（stage-specific embyronic antigen 1，SSEA-1）、联会复合体蛋白3和生长分化因子9 [12]。许多研究通过移植标记后的脐带MSCs[72-73]，发现其可迁移至卵巢，提示脐带MSCs移植后可在体内定位和增殖，具有修复卵巢组织并可能向生殖细胞分化的潜能。有研究从小鼠BMSCs中分离出能表达SSEA-1的多能干细胞，加入BMP-4后成功诱导其向原始生殖细胞（primordialgermcells，PGCs）分化，但未能将PGCs进一步诱导形成晚期生殖细胞[11-13]。如在体外和体内微环境条件下将MSCs诱导分化为有功能的卵母细胞，则有可能通过辅助生殖技术使POF患者重获生育能力，保存物种的多样性，并在更大程度上满足人类研究与再生医学治疗的需要。
3 小结与展望
目前，MSCs的应用逐渐广泛，其不论是作为干预因素改善卵巢组织损伤，还是作为OSCs来源诱导分化为卵母细胞样细胞，都在再生医学、生殖技术方面表现出应用潜力，为FP技术研究提供了新思路。另外，由于MSCs具有低免疫原性及免疫耐受、免疫调节等功能，是否有助于提升子宫内膜的容受性以增加不孕者的自然受孕率和辅助生殖技术的成功率，针对临床上习惯性流产尤其是免疫性流产患者的治疗，MSCs是否具有保护和治疗作用，相关研究正在积极开展。然而，将MSCs最终应用于临床仍是一漫长复杂的过程，存在许多问题有待进一步解决，如MSCs的作用是否会增加感染和肿瘤的风险，如何提高MSCs向靶器官的归巢能力，MSCs向卵母细胞样细胞分化的启动机制，如何使MSCs更易于获取和纯化鉴定，MSCs长期使用的安全性及伦理性等。相信随着基础研究的逐步深入及临床试验资料的完善，MSCs将作为一种潜力强大的细胞源，为女性改善生育力开辟一条新的技术路线。