引用本文： 宋登新, 曹云, 丁徐, 何小文, 黄涛, 赵毅, 祁军. 高迁移率族蛋白1在骨关节炎滑膜细胞中的表达及意义. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(11): 1376-1380. doi: 10.7507/1002-1892.20150296 复制
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是目前最常见的一种关节病变，我国流行病学研究显示，OA患者主要集中在老年人群，65岁以上人群发病率＞50%，75岁以上则达到80%以上[1]。在OA不同阶段，多种细胞因子在关节组织损伤中发挥了重要作用[2]。高迁移率族蛋白1（high mobility group box chromosomal protein 1，HMGB1）是一个与慢性关节炎有关的重要炎性介质，可激活细胞内信号转导途径，启动多种炎性因子介导关节组织的炎性损伤。本研究从人膝关节组织中分离滑膜细胞，建立OA和正常膝关节滑膜细胞株，观察HMGB1的分布，利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）基因沉默技术抑制OA滑膜细胞株的HMGB1基因，通过与干扰前OA滑膜细胞株比较，研究HMGB1基因表达下调对OA滑膜细胞分泌IL-1β和TNF-α的影响，为进一步阐明OA发生的分子机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
DMEM培养液、FBS（GIBCO公司，美国）；牛胰蛋白酶（Sigma公司，美国）；兔抗人HMGB1多克隆抗体、荧光二抗FITC（深圳晶美生物工程有限公司）；IL-1β及TNF-α ELISA试剂盒（Biosource公司，美国）；Pgenesil-1质粒和大肠杆菌DH5α由华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室保存；限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ以及T4 DNA Ligase、SalⅠ（NEB）、G418（华美生物工程有限公司）；脂质体Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美国）；SP免疫组织化学试剂盒、DAB显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）；引物由上海Sangon公司合成。倒置相差显微镜、荧光显微镜（Olympus公司，日本）；Image Quant TL软件（华中科技大学同济医学院附属同济医院实验中心）。
1.2 实验标本
收集2013年1月－2015年1月于上海市第一人民医院宝山医院骨科34例行关节手术患者的关节滑膜组织。其中，OA患者23例，男8例，女15例；年龄49～70岁，平均59.6岁；患者均根据中华医学会风湿病学分会2010年版指南标准确诊为OA，接受人工膝关节表面置换。正常膝关节11例，男7例，女4例；年龄47～73岁，平均51.9岁；均为膝关节半月板损伤，行关节镜下手术；经关节镜诊断未达OA诊断标准且无其他关节病变，取镜下观察正常滑膜组织。膝关节滑膜标本取材均经患者知情同意，由上海市第一人民医院宝山分院伦理委员会批准。
1.3 滑膜细胞体外培养及观测
1.3.1 细胞培养及形态学观察
取OA及正常膝关节滑膜组织，采用组织块培养法，在超净工作台内用D-Hank液漂洗3次，剪碎至2 mm×2 mm×2 mm的小块。将组织小块以5 mm左右间距放入装有少量DMEM培养液的培养瓶内，置入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内，4 h后再缓慢加入DMEM培养液覆盖组织小块。培养3 d后更换培养液，除去未贴壁的组织块，加入新鲜培养液。倒置相差显微镜下观察细胞形态，待细胞铺满90%培养瓶底面，用牛胰蛋白酶消化细胞并调整细胞浓度为1×105 个 / mL，按每孔2 mL加入6孔板，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。培养1 d后收集OA滑膜细胞上清液，- 80℃保存待测。
1.3.2 免疫荧光染色及免疫组织化学染色观察
取OA及正常膝关节滑膜细胞，调整细胞浓度至1×104 个/mL，滴入放有盖玻片的6孔培养板内，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，爬片良好后，移除孔内液体。PBS液冲洗3次，37℃4%多聚甲醛固定30 min，滴加5%牛血清白蛋白封闭液，室温20 min，移除多余液体。滴加兔抗人HMGB 1多克隆抗体（1∶200），37℃ 孵育2 h，PBS洗3次。滴加荧光二抗FITC，室温避光反应1 h。PBS冲洗玻片3 次，缓冲甘油封片。荧光显微镜下于490 nm波长观察，细胞呈绿色荧光为阳性。
取细胞爬片按照免疫组织化学染色试剂盒说明操作，干燥后水溶性封片剂封片，荧光显微镜下观察棕色颗粒的位置和强弱。
1.3.3 Western
blot检测取OA及正常膝关节滑膜细胞，加入RIPA裂解缓冲液在冰上裂解60 min，超声匀浆，4℃以离心半径16 cm，12 000 r/min离心3～5 min。取上清，经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭后，兔抗人HMGB1多克隆抗体4℃孵育过夜；TBS洗膜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育60 min；TBS洗膜，ECL增强发光，压片显影。以β-actin为对照。扫描后应用软件Image Quant TL进行灰度分析，测定条带吸光度（A）值，以OA或正常膝关节滑膜细胞A值与对照A值的比值作为HMGB1蛋白表达水平。
1.4 siRNA表达载体的构建、酶切鉴定及转染
将人HMGB1的DNA序列提交siRNA设计网站（www.qiagen.com）选择最佳干扰的DNA位点，本研究选取4个靶位点构建siRNA表达质粒，通过转染后Western blot筛选出最有效的质粒，筛选的靶序列为3'非编码区的5'-AGACCTGAGAATGTATCCCCAAA-3'，针对靶位点设计2条互补的寡核苷酸序列5'-GATCCAGACCTGAGAATGTATCCCCAAATTCAAGACGTTTGGGGATACATTCTCAGGTCTTTTTTTGTCGACA-3'和5'-AGCTTGTCGACAAAAAAAGACCTGAGAATGTATCCCCAAACGTCTTGAATTTGGGGATACAT-TCTCAGGTCTG-3'，构建的siRNA表达载体片段里含有SalⅠ的酶切位点，用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定，将鉴定正确的阳性克隆命名为Pgenesil-1/HMGB1 siRNA。在脂质体Lipofectamine2000的介导下，分别将Pgenesil-1/HMGB1 siRNA与Pgenesil-1质粒转染至OA滑膜细胞中，作为siRNA转染组和空载体转染组。转染48 h后，更换培养液继续培养24 h，更换浓度为1 000 μg/mL 的G418培养液筛选细胞。12 h后荧光显微镜下观察siRNA转染组细胞中绿色荧光蛋白的表达，观察转染效率（荧光阳性细胞数/同一视野内光镜下总细胞数×100%）。挑取阳性克隆继续在浓度为500 μg/mL的G418培养液中扩大培养6 d后进行观测。
1.5 观测指标
1.5.1 Western
blot检测取siRNA转染组、空载体转染组滑膜细胞以及未转染的OA滑膜细胞（未转染组），同1.3.3方法行Western blot检测HMGB1蛋白表达。
1.5.2 ELISA法检测
取siRNA转染组及空载体转染组滑膜细胞，采用胰蛋白酶消化并调整细胞浓度为1×105个/mL，以每孔2 mL加入6孔板内，培养1 d后收集上清液，-80℃保存。将保存的siRNA转染组、空载体转染组上清液及1.3.1中收集的OA滑膜细胞上清液（未转染组），置于冰盒完全解冻，每组取细胞培养上清液100 μL，采用ELISA试剂盒方法检测IL-1β和TNF-α含量。
1.6 统计学方法
采用SPSS12.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞培养观察
2.1.1 细胞形态观察
组织块原代培养5 d后可见大量滑膜细胞从滑膜组织块边缘爬出，呈长梭状极向排列，大部分为成纤维细胞样细胞，也有部分树突样细胞和巨噬细胞样细胞，7～10 d形成密集的单层细胞铺满90%瓶壁，部分区域呈漩涡状生长。原代OA及正常膝关节滑膜细胞形态无明显差异，但正常膝关节滑膜细胞更易贴壁生长。见图 1。
图1
滑膜细胞形态学观察（倒置相差显微镜×200） ⓐ OA滑膜细胞培养3 d ⓑ 正常膝关节滑膜细胞培养3 d 2.1.2 免疫荧光染色及免疫组织化学染色观察
OA滑膜细胞HMGB1标记显示细胞质呈棕色阳性反应，而细胞核多为阴性反应或浅黄色弱阳性反应；免疫荧光染色示HMGB1以细胞质分布为主，细胞核中较少。正常膝关节滑膜细胞HMGB1标记显示细胞核呈深棕色强阳性反应，而细胞质多为阴性反应或浅黄色弱阳性反应；免疫荧光染色示HMGB1以细胞核分布为主，细胞质中较少。见图 2、3。
2.1.3 Western
blot检测 OA滑膜细胞中HMGB1高表达，表达量为0.687±0.025，显著高于正常膝关节滑膜细胞的0.172±0.030，比较差异有统计学意义（t=32.159，P=0.000）。见图 4。
2.2 细胞转染观测
2.2.1 Pgenesil-1/HMGB1
siRNA真核表达载体的酶切鉴定及转染效率 Pgenesil-1/HMGB1 siRNA载体目的基因片段里含SalⅠ的酶切位点，用BamHⅠ 和SalⅠ酶切后，1.5%琼脂糖凝胶电泳，显示1条约400 bp的条带，表明Pgenesil-1/HMGB1 siRNA真核表达载体构建成功（图 5）。Pgenesil-1/HMGB1 siRNA转染OA滑膜细胞后，荧光显微镜下观察见绿色荧光，转染率达 89%。见图 6。
2.2.2 Western
blot检测 siRNA转染组HMGB1蛋白表达为0.134±0.048，显著低于空载体转染组的0.581±0.032及未转染组的0.514±0.069，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；空载体转染组与未转染组HMGB1蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 7。
2.2.3 ELISA法检测
siRNA转染组、空载体转染组及未转染组IL-1β含量分别为（27.165±0.953）、（65.433±1.453）、（67.510±1.236）pg/mL，TNF-α含量为（253.462±13.435）、（635.470±17.380）、（571.743± 16.848）pg/mL。siRNA转染组IL-1β及TNF-α含量均显著低于空载体转染组及未转染组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空载体转染组与未转染组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
3 讨论
OA的发生过程是一种生物力学改建过程，是机械性损伤因素和生物因素相互作用引起的软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡的结果[3-4]。在OA的发展病程中，各种致病因素刺激关节滑膜引起滑膜炎症，释放多种趋化因子[5]和炎性介质，进一步介导关节软骨和滑膜中各种蛋白酶产生，引起关节软骨降解，并形成恶性循环。有学者认为滑膜炎症的存在是导致OA关节软骨退变的重要原因[6-7]，因此探讨滑膜细胞的炎性因子释放机制成为OA研究重点。
HMGB1是与染色体结合的非组蛋白成分之一，是一种特殊的炎性因子，具有分泌晚、持续时间长的特点，因而被界定为晚期炎性介质，与炎症性疾病的发生密切相关[8]。有研究证实HMGB1通过与配体结合，激活包括NF-κB在内的细胞内信号转导途径，启动多种炎性因子（包括TNF-α、IL-1、IL-6、黏附分子等）转录介导炎性反应[9]，针对多种组织发挥作用[10-12]。近年来发现它在多种骨关节炎性疾病中高表达[8, 13]，研究发现OA患者关节软骨及滑膜组织中的HMGB1上调，同时关节液及血清中也存在较高浓度[4, 13]，提示关节组织细胞中的HMGB1在OA发生，发展过程中起重要作用。本研究结果也提示OA滑膜细胞中HMGB1表达上调，以细胞质分布为主；而正常膝关节滑膜细胞HMGB1以细胞核分布为主。因此细胞核外的HMGB1可能是OA炎症过程中的重要影响因素[14]，但其从细胞核内移出的具体机制及与OA发生、发展的关系目前还不清楚，进一步研究其功能具有十分重要的意义。
为进一步研究HMGB1的功能，本研究利用siRNA技术构建了HMGB1基因siRNA表达载体Pgenesil-1/HMGB1 siRNA并转染OA滑膜细胞，发现转染后OA滑膜细胞HMGB1下调，同时分泌IL-1β和TNF-α能力明显下降。提示其可能的机制是Pgenesil-1/HMGB1 siRNA真核表达载体抑制了HMGB1基因的表达，进而影响其下游的信号传导通路，抑制炎性因子IL-1β和TNF-α转录和释放。IL-lβ和TNF-α是关节组织损伤发生的主要启动因子，二者可增加骨吸收，激活基质金属蛋白酶，降解软骨胶原及蛋白多糖，增加一氧化氮生成，加快软骨细胞凋亡，导致滑膜炎症和软骨退变[15-17]。本研究结果提示OA滑膜细胞中的HMGB1上调对OA的发生发挥着重要作用，抑制关节滑膜细胞中的HMGB1基因，可减少IL-1β和TNF-α的产生，减缓OA炎性反应进程。目前对于HMGB1参与OA的研究尚处于起步阶段，其中许多问题，如HMGB1从细胞核转移至细胞质的具体时期、其释放的调节机制等需进行深入研究和阐明。随着这一系列问题的逐步解决，有望为OA治疗提供一种新的思路。
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是目前最常见的一种关节病变，我国流行病学研究显示，OA患者主要集中在老年人群，65岁以上人群发病率＞50%，75岁以上则达到80%以上[1]。在OA不同阶段，多种细胞因子在关节组织损伤中发挥了重要作用[2]。高迁移率族蛋白1（high mobility group box chromosomal protein 1，HMGB1）是一个与慢性关节炎有关的重要炎性介质，可激活细胞内信号转导途径，启动多种炎性因子介导关节组织的炎性损伤。本研究从人膝关节组织中分离滑膜细胞，建立OA和正常膝关节滑膜细胞株，观察HMGB1的分布，利用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）基因沉默技术抑制OA滑膜细胞株的HMGB1基因，通过与干扰前OA滑膜细胞株比较，研究HMGB1基因表达下调对OA滑膜细胞分泌IL-1β和TNF-α的影响，为进一步阐明OA发生的分子机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
DMEM培养液、FBS（GIBCO公司，美国）；牛胰蛋白酶（Sigma公司，美国）；兔抗人HMGB1多克隆抗体、荧光二抗FITC（深圳晶美生物工程有限公司）；IL-1β及TNF-α ELISA试剂盒（Biosource公司，美国）；Pgenesil-1质粒和大肠杆菌DH5α由华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室保存；限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ以及T4 DNA Ligase、SalⅠ（NEB）、G418（华美生物工程有限公司）；脂质体Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美国）；SP免疫组织化学试剂盒、DAB显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）；引物由上海Sangon公司合成。倒置相差显微镜、荧光显微镜（Olympus公司，日本）；Image Quant TL软件（华中科技大学同济医学院附属同济医院实验中心）。
1.2 实验标本
收集2013年1月－2015年1月于上海市第一人民医院宝山医院骨科34例行关节手术患者的关节滑膜组织。其中，OA患者23例，男8例，女15例；年龄49～70岁，平均59.6岁；患者均根据中华医学会风湿病学分会2010年版指南标准确诊为OA，接受人工膝关节表面置换。正常膝关节11例，男7例，女4例；年龄47～73岁，平均51.9岁；均为膝关节半月板损伤，行关节镜下手术；经关节镜诊断未达OA诊断标准且无其他关节病变，取镜下观察正常滑膜组织。膝关节滑膜标本取材均经患者知情同意，由上海市第一人民医院宝山分院伦理委员会批准。
1.3 滑膜细胞体外培养及观测
1.3.1 细胞培养及形态学观察
取OA及正常膝关节滑膜组织，采用组织块培养法，在超净工作台内用D-Hank液漂洗3次，剪碎至2 mm×2 mm×2 mm的小块。将组织小块以5 mm左右间距放入装有少量DMEM培养液的培养瓶内，置入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内，4 h后再缓慢加入DMEM培养液覆盖组织小块。培养3 d后更换培养液，除去未贴壁的组织块，加入新鲜培养液。倒置相差显微镜下观察细胞形态，待细胞铺满90%培养瓶底面，用牛胰蛋白酶消化细胞并调整细胞浓度为1×105 个 / mL，按每孔2 mL加入6孔板，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。培养1 d后收集OA滑膜细胞上清液，- 80℃保存待测。
1.3.2 免疫荧光染色及免疫组织化学染色观察
取OA及正常膝关节滑膜细胞，调整细胞浓度至1×104 个/mL，滴入放有盖玻片的6孔培养板内，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，爬片良好后，移除孔内液体。PBS液冲洗3次，37℃4%多聚甲醛固定30 min，滴加5%牛血清白蛋白封闭液，室温20 min，移除多余液体。滴加兔抗人HMGB 1多克隆抗体（1∶200），37℃ 孵育2 h，PBS洗3次。滴加荧光二抗FITC，室温避光反应1 h。PBS冲洗玻片3 次，缓冲甘油封片。荧光显微镜下于490 nm波长观察，细胞呈绿色荧光为阳性。
取细胞爬片按照免疫组织化学染色试剂盒说明操作，干燥后水溶性封片剂封片，荧光显微镜下观察棕色颗粒的位置和强弱。
1.3.3 Western
blot检测取OA及正常膝关节滑膜细胞，加入RIPA裂解缓冲液在冰上裂解60 min，超声匀浆，4℃以离心半径16 cm，12 000 r/min离心3～5 min。取上清，经15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭后，兔抗人HMGB1多克隆抗体4℃孵育过夜；TBS洗膜，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育60 min；TBS洗膜，ECL增强发光，压片显影。以β-actin为对照。扫描后应用软件Image Quant TL进行灰度分析，测定条带吸光度（A）值，以OA或正常膝关节滑膜细胞A值与对照A值的比值作为HMGB1蛋白表达水平。
1.4 siRNA表达载体的构建、酶切鉴定及转染
将人HMGB1的DNA序列提交siRNA设计网站（www.qiagen.com）选择最佳干扰的DNA位点，本研究选取4个靶位点构建siRNA表达质粒，通过转染后Western blot筛选出最有效的质粒，筛选的靶序列为3'非编码区的5'-AGACCTGAGAATGTATCCCCAAA-3'，针对靶位点设计2条互补的寡核苷酸序列5'-GATCCAGACCTGAGAATGTATCCCCAAATTCAAGACGTTTGGGGATACATTCTCAGGTCTTTTTTTGTCGACA-3'和5'-AGCTTGTCGACAAAAAAAGACCTGAGAATGTATCCCCAAACGTCTTGAATTTGGGGATACAT-TCTCAGGTCTG-3'，构建的siRNA表达载体片段里含有SalⅠ的酶切位点，用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定，将鉴定正确的阳性克隆命名为Pgenesil-1/HMGB1 siRNA。在脂质体Lipofectamine2000的介导下，分别将Pgenesil-1/HMGB1 siRNA与Pgenesil-1质粒转染至OA滑膜细胞中，作为siRNA转染组和空载体转染组。转染48 h后，更换培养液继续培养24 h，更换浓度为1 000 μg/mL 的G418培养液筛选细胞。12 h后荧光显微镜下观察siRNA转染组细胞中绿色荧光蛋白的表达，观察转染效率（荧光阳性细胞数/同一视野内光镜下总细胞数×100%）。挑取阳性克隆继续在浓度为500 μg/mL的G418培养液中扩大培养6 d后进行观测。
1.5 观测指标
1.5.1 Western
blot检测取siRNA转染组、空载体转染组滑膜细胞以及未转染的OA滑膜细胞（未转染组），同1.3.3方法行Western blot检测HMGB1蛋白表达。
1.5.2 ELISA法检测
取siRNA转染组及空载体转染组滑膜细胞，采用胰蛋白酶消化并调整细胞浓度为1×105个/mL，以每孔2 mL加入6孔板内，培养1 d后收集上清液，-80℃保存。将保存的siRNA转染组、空载体转染组上清液及1.3.1中收集的OA滑膜细胞上清液（未转染组），置于冰盒完全解冻，每组取细胞培养上清液100 μL，采用ELISA试剂盒方法检测IL-1β和TNF-α含量。
1.6 统计学方法
采用SPSS12.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞培养观察
2.1.1 细胞形态观察
组织块原代培养5 d后可见大量滑膜细胞从滑膜组织块边缘爬出，呈长梭状极向排列，大部分为成纤维细胞样细胞，也有部分树突样细胞和巨噬细胞样细胞，7～10 d形成密集的单层细胞铺满90%瓶壁，部分区域呈漩涡状生长。原代OA及正常膝关节滑膜细胞形态无明显差异，但正常膝关节滑膜细胞更易贴壁生长。见图 1。
图1
滑膜细胞形态学观察（倒置相差显微镜×200） ⓐ OA滑膜细胞培养3 d ⓑ 正常膝关节滑膜细胞培养3 d 2.1.2 免疫荧光染色及免疫组织化学染色观察
OA滑膜细胞HMGB1标记显示细胞质呈棕色阳性反应，而细胞核多为阴性反应或浅黄色弱阳性反应；免疫荧光染色示HMGB1以细胞质分布为主，细胞核中较少。正常膝关节滑膜细胞HMGB1标记显示细胞核呈深棕色强阳性反应，而细胞质多为阴性反应或浅黄色弱阳性反应；免疫荧光染色示HMGB1以细胞核分布为主，细胞质中较少。见图 2、3。
2.1.3 Western
blot检测 OA滑膜细胞中HMGB1高表达，表达量为0.687±0.025，显著高于正常膝关节滑膜细胞的0.172±0.030，比较差异有统计学意义（t=32.159，P=0.000）。见图 4。
2.2 细胞转染观测
2.2.1 Pgenesil-1/HMGB1
siRNA真核表达载体的酶切鉴定及转染效率 Pgenesil-1/HMGB1 siRNA载体目的基因片段里含SalⅠ的酶切位点，用BamHⅠ 和SalⅠ酶切后，1.5%琼脂糖凝胶电泳，显示1条约400 bp的条带，表明Pgenesil-1/HMGB1 siRNA真核表达载体构建成功（图 5）。Pgenesil-1/HMGB1 siRNA转染OA滑膜细胞后，荧光显微镜下观察见绿色荧光，转染率达 89%。见图 6。
2.2.2 Western
blot检测 siRNA转染组HMGB1蛋白表达为0.134±0.048，显著低于空载体转染组的0.581±0.032及未转染组的0.514±0.069，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；空载体转染组与未转染组HMGB1蛋白表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 7。
2.2.3 ELISA法检测
siRNA转染组、空载体转染组及未转染组IL-1β含量分别为（27.165±0.953）、（65.433±1.453）、（67.510±1.236）pg/mL，TNF-α含量为（253.462±13.435）、（635.470±17.380）、（571.743± 16.848）pg/mL。siRNA转染组IL-1β及TNF-α含量均显著低于空载体转染组及未转染组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空载体转染组与未转染组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
3 讨论
OA的发生过程是一种生物力学改建过程，是机械性损伤因素和生物因素相互作用引起的软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者降解和合成正常偶联失衡的结果[3-4]。在OA的发展病程中，各种致病因素刺激关节滑膜引起滑膜炎症，释放多种趋化因子[5]和炎性介质，进一步介导关节软骨和滑膜中各种蛋白酶产生，引起关节软骨降解，并形成恶性循环。有学者认为滑膜炎症的存在是导致OA关节软骨退变的重要原因[6-7]，因此探讨滑膜细胞的炎性因子释放机制成为OA研究重点。
HMGB1是与染色体结合的非组蛋白成分之一，是一种特殊的炎性因子，具有分泌晚、持续时间长的特点，因而被界定为晚期炎性介质，与炎症性疾病的发生密切相关[8]。有研究证实HMGB1通过与配体结合，激活包括NF-κB在内的细胞内信号转导途径，启动多种炎性因子（包括TNF-α、IL-1、IL-6、黏附分子等）转录介导炎性反应[9]，针对多种组织发挥作用[10-12]。近年来发现它在多种骨关节炎性疾病中高表达[8, 13]，研究发现OA患者关节软骨及滑膜组织中的HMGB1上调，同时关节液及血清中也存在较高浓度[4, 13]，提示关节组织细胞中的HMGB1在OA发生，发展过程中起重要作用。本研究结果也提示OA滑膜细胞中HMGB1表达上调，以细胞质分布为主；而正常膝关节滑膜细胞HMGB1以细胞核分布为主。因此细胞核外的HMGB1可能是OA炎症过程中的重要影响因素[14]，但其从细胞核内移出的具体机制及与OA发生、发展的关系目前还不清楚，进一步研究其功能具有十分重要的意义。
为进一步研究HMGB1的功能，本研究利用siRNA技术构建了HMGB1基因siRNA表达载体Pgenesil-1/HMGB1 siRNA并转染OA滑膜细胞，发现转染后OA滑膜细胞HMGB1下调，同时分泌IL-1β和TNF-α能力明显下降。提示其可能的机制是Pgenesil-1/HMGB1 siRNA真核表达载体抑制了HMGB1基因的表达，进而影响其下游的信号传导通路，抑制炎性因子IL-1β和TNF-α转录和释放。IL-lβ和TNF-α是关节组织损伤发生的主要启动因子，二者可增加骨吸收，激活基质金属蛋白酶，降解软骨胶原及蛋白多糖，增加一氧化氮生成，加快软骨细胞凋亡，导致滑膜炎症和软骨退变[15-17]。本研究结果提示OA滑膜细胞中的HMGB1上调对OA的发生发挥着重要作用，抑制关节滑膜细胞中的HMGB1基因，可减少IL-1β和TNF-α的产生，减缓OA炎性反应进程。目前对于HMGB1参与OA的研究尚处于起步阶段，其中许多问题，如HMGB1从细胞核转移至细胞质的具体时期、其释放的调节机制等需进行深入研究和阐明。随着这一系列问题的逐步解决，有望为OA治疗提供一种新的思路。
