引用本文： 廖烨晖, 钟德君, 康敏, 姚帅辉, 张毅, 余永涛. 全反式维甲酸干预鼠胚神经干细胞联合胶质细胞源性神经营养因子及硫酸软骨素酶ABC移植修复大鼠脊髓损伤的研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(8): 1009-1015. doi: 10.7507/1002-1892.20150216 复制
神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是存在于哺乳动物脊髓、海马和室管膜下层，具有分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞潜力的神经前体细胞[1]。研究发现，将NSCs移植至小鼠脊髓损伤部位后，小鼠运动功能显著恢复，免疫组织学观察发现移植的NSCs在损伤脊髓部位存活并向损伤区域迁移[2-3]。然而，相关动物实验研究发现，NSCs移植至损伤脊髓后分化为神经元数量有限，这可能与移植局部NGF缺乏、神经抑制因子增加相关[4-5]。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）是轴突再生的一种重要神经营养因子，对于促进脊髓损伤后神经修复具有重要作用[6-7]。研究发现，GDNF可通过激活细胞内的胞浆蛋白酪氨酸激酶Fyn和FAK等信号途径促进轴突延长[8-9]。星形胶质细胞可在硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulphate proteoglycans，CSPGs）的刺激下形成胶质瘢痕，从而阻碍神经轴突延长和神经功能恢复[10-11]。而硫酸软骨素酶ABC （chondroitinase ABC，ChABC）是催化分解CSPGs的一种酶类，Starkey等[12]研究认为，ChABC可通过降低损伤脊髓局部CSPGs含量等相关途径，促进脊髓功能恢复。脊髓损伤后神经功能修复是由多种细胞因子和信号途径相互作用形成复杂网络调控，GDNF、ChABC通过不同信号途径促进轴突再生和神经功能恢复，二者在神经修复过程中是否具有相互作用，目前仍不清楚。本研究将全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）干预培养的鼠胚NSCs联合GDNF和ChABC移植至大鼠脊髓损伤部位，采用BBB评分、体感诱发电位（somatosensory evoked potentials，SEP）检测和免疫组织荧光染色观察评估大鼠脊髓功能恢复情况，探索促进脊髓损伤再生修复的方法以及GDNF、ChABC在修复过程中的相互作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂 、仪器
健康成年雌性SD大鼠60只，体重200～250 g，由泸州医学院实验动物中心提供。经ATRA（1.0 μmol/L）干预培养的鼠胚NSCs由本课题组前期实验完成并冻存备用[13-14]。于移植前1 d采用BrdU标记NSCs，移植前30 min采用0.25%胰蛋白酶消化10 min，以离心半径6 cm、1 000 r/min离心5 min，用培养基调节浓度为2×105个/μL的细胞悬液备用。
GDNF、ChABC（PeproTech公司，美国）；将GDNF冻干粉（10 μg/支）及ChABC（5 U/支）分别采用无菌PBS液溶解，调整浓度为10 μg/mL及5 U/ mL，无菌EP管分装，-20℃保存备用。
DAPI（Sigma公司，美国）； B27辅助生长因子、DMEM/F12（1∶1）、FBS（GIBCO公司，美国）；小鼠抗微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）IgG、FITC标记山羊抗小鼠IgG（武汉博士德生物科技有限公司）；鼠抗神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）IgG、罗丹明标记山羊抗兔IgG、兔抗BrdU多克隆IgG（北京博奥森生物技术有限公司）。 BX60荧光显微镜（Olympus公司，日本）；Image Pro-Plus图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
将60只SD大鼠随机分为5组（n=12），分别为假手术组（A组）、损伤对照组（B组）、NSCs+GDNF移植组（C组）、NSCs+ChABC移植组（D组）、NSCs+GDNF+ChABC移植组（E组）。各组大鼠采用2%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，以T9～11棘突为中心作背部正中切口，剥离双侧椎旁肌肉，A组仅行椎板切除术、蛛网膜下腔放置PE-10号导管；其余各组咬除椎板，暴露T9～11节段脊髓，尖刀片横断脊髓，解剖显微镜下将PE-10号导管穿皮下经蛛网膜下腔置入脊髓横断处，固定导管。检查无活动性出血，解剖显微镜下缝合硬脊膜，常规逐层缝合切口。体外导管热压封闭，以备后期细胞移植。术后每日协助排尿2次，直至恢复排尿反射；腹腔注射青霉素12万U/d，连续1周。
术后第8天，C、D、E组采用微量注射器经留置导管注入BrdU标记NSCs 10 μL，A、B组注入等量生理盐水。第8～14天每天C组经留置导管注入GDNF、生理盐水各10 μL，D组注射ChABC、生理盐水各10 μL，E组注射GDNF、ChABC各10 μL，A、B组注射生理盐水20 μL。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察并记录造模术后及细胞移植后各组大鼠切口感染情况和死亡情况。
1.3.2 后肢运动功能评定
术前1 d、术后7 d及移植后1、2、5、8周采用BBB评分 [15]评价各组大鼠后肢运动功能。
1.3.3 神经电生理检查
术前1 d、术后7 d及移植后1、2、5、8周对各组大鼠进行SEP检测。大鼠同上法麻醉后固定、颅顶备皮。刺激电极置于踝关节上方胫后神经处，参考电极置于远侧1 cm处，记录电极置于冠状缝和矢状缝相交处头皮下后肢皮质感觉区，给予直流单方波电脉冲刺激，刺激强度7.5 V，波宽0.2 ms，频率3 Hz，观察记录SEP潜伏期的变化。
1.3.4 组织学及免疫荧光染色观察
移植后8周神经电生理检查后，各组大鼠给予生理盐水和4%中性多聚甲醛PBS缓冲液心脏灌注固定。原入路暴露脊髓，以横断面为中心切取长约4 cm脊髓组织，石蜡包埋、连续5 μm厚切片。每组标本随机取8张切片行HE染色，光镜下观察损伤区域改变情况。取8张采用一抗兔抗BrdU多克隆IgG标记神经元、二抗罗丹明标记山羊抗兔IgG显色，DAPI复染，荧光显微镜下BrdU阳性细胞胞体呈橘红色荧光。取8张加入一抗兔抗BrdU（1∶50）和鼠抗GFAP（1∶100) 混合物，二抗罗丹明标记山羊抗兔IgG（1∶50）和FITC标记羊抗小鼠IgG（1∶50）混合物显色，荧光显微镜下GFAP阳性细胞呈草绿色荧光。取8 张加入一抗兔抗BrdU（1∶50）和小鼠抗MAP-2（1∶100），其余步骤同BrdU/GFAP免疫荧光双标染色，荧光显微镜下MAP-2阳性细胞轴突呈草绿色荧光。每张切片取10个视野，荧光显微镜高倍镜下观察，采用Image Pro-Plus图像分析软件计数各免疫荧光染色阳性细胞。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
除A组外，其余各组大鼠造模、麻醉清醒后双侧后肢均表现为完全瘫痪，提示造模成功。造模术后1 只大鼠死于切口感染，4只死于肠梗阻，均给予补充。
2.2 后肢运动功能评定
细胞移植后各组大鼠双侧后肢运动功能均有所恢复，C、D、E组较B组恢复明显，以E组恢复最佳。
各组大鼠术前BBB评分均为21分。术后7 d，除A组外，其余各组均为0分。移植后各时间点B～E组BBB评分均显著低于A组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；移植后1周，B～E组组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；移植后2、5、8周，C～E组BBB评分逐步上升且均高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；5、8周时，E组BBB评分高于C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）。其余时间点各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠各时间点后肢运动功能BBB评分比较（n=12，2.3 神经电生理检查
术前各组大鼠SEP潜伏期比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。术后7 d，B～E组潜伏期较A组明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05），B～E组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。移植后1、2、5、8周B～E组潜伏期亦显著长于A组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；2、5、8周，C、D、E组潜伏期逐渐缩短，与B组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；5、8周，E组与C、D组比较潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余时间点各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠各时间点SEP潜伏期比较(n=12，ms，2.4 组织学观察
A组大鼠灰、白质分界清楚（图 1 a），神经纤维束排列规则，细胞轮廓清楚、结构完整（图 1 b）。B组大鼠脊髓破坏严重，损伤区域灰白质结构紊乱、无明显界限，神经元坏死减少，有较大囊腔形成（图 1 c）。C～E组大鼠脊髓损伤区域细胞增生明显，星形胶质细胞增生并聚集于胶质瘢痕周围，坏死囊腔较B组小，C、D、E组间未见明显差异（图 1 d～f）。
图1
移植后8周各组HE染色观察 ⓐ A组（×100） ⓑ A组（×200） ⓒ B组（×200） ⓓ C组（×200） ⓔ D组（×200） ⓕ E组（×200）
Figure1.
HE staining observation at 8 weeks after transplantation ⓐ Group A (×100) ⓑ Group A (×200) ⓒ Group B (×200) ⓓ Group C (×200) ⓔ Group D (×200) ⓕ Group E (×200)
2.5 免疫荧光染色观察
荧光显微镜观察示，A、B组内未见BrdU阳性细胞；C～E组可见胞体呈橘红色的阳性细胞，主要分布于灰、白质。高倍镜下NSCs呈圆形或椭圆形分布于纤维束和空洞周围（图 2）。C、D、E组BrdU阳性细胞计数分别为（95.2±10.2）、（92.7±8.9）、（109.0±10.8）个/视野，E组显著多于C、D组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
图2
移植后8周各组BrdU免疫荧光染色观察（×200） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 ⓔ E组 各组均可见GFAP染色阳性细胞分布于断端灰、白质空洞部位，神经元胞体向四周伸出放射状突起，部分相互交织成网（图 3）。A～E组阳性细胞计数分别为（16.9±2.2）、（19.8±3.0）、（13.5±2.5）（12.8±2.4）、（10.3±1.9）个/视野。C～E组GFAP阳性细胞少于A、B组，E组少于C、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
各组均可见MAP-2标记阳性细胞，主要分布于脊髓灰质神经元的胞体和突起（图 4）。A～E组MAP-2阳性细胞计数分别为（8.4±1.7）、（8.3±1.8）、（11.7±2.2）、（10.6±2.4）、（14.2±2.3）个/视野，C～E组阳性细胞多于A、B组，E组多于C、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
3 讨论
脊髓损伤时可出现脊髓结构破坏、脊髓中神经细胞凋亡和坏死，从而遗留永久性神经功能障碍。临床常采用手术减压、药物营养神经、康复理疗、生物治疗等方式治疗脊髓损伤，但疗效欠佳，很难达到满意治疗效果。因此，如何治疗中枢神经系统损伤仍是研究热点。NSCs是一类具有分化为各种细胞潜能的成体干细胞。移植NSCs于损伤脊髓处，诱导其定向分化为神经元、修复并补充脊髓中受损的神经元，对于脊髓损伤的治疗具有重要意义，这种治疗方式也是目前临床和基础学科研究治疗脊髓损伤的热点方式。Salewski等[2] 及Yao等[3]通过移植鼠胚NSCs于大鼠损伤脊髓节段的相关研究，证实NSCs移植可促进损伤脊髓的修复和功能障碍的恢复。然而NSCs定向分化为神经元及脊髓功能障碍改善仍然有限[4]。本课题组既往通过使用不同浓度的ATRA对鼠胚NSCs进行培养，发现经1.0 μmol/ L ATRA诱导培养的鼠胚NSCs向神经元分化的比例高达70%[13, 16]。因此，本实验选取经1.0 μmol/L ATRA诱导的NSCs进行移植，以增加移植NSCs向神经元分化的比例。
动物实验发现[17]，移植的NSCs在损伤脊髓局部微环境中细胞因子的作用下，大量向星形胶质细胞分化，从而促进胶质瘢痕形成，并且移植的NSCs在损伤脊髓处存活数量和时间均有限。随着移植时间延长，移植的NSCs逐渐出现选择性消融，从而导致已恢复的运动功能再次恶化[18]。导致上述改变的原因可能与损伤脊髓局部微循环中的细胞因子改变密切相关。脊髓损伤局部存在各种神经营养因子和神经修复、再生抑制因子，这些因子对促进脊髓损伤的修复意义重大。GDNF是由神经胶质细胞分泌的一种神经营养因子，它广泛分布于脊髓中，具有促进触突再生、脊髓损伤后神经功能恢复等作用[19]。相关研究证实，GDNF可通过激活细胞内的胞浆蛋白酪氨酸激酶Fyn和FAK等信号途径，从而促进轴突再生和髓鞘化[8-9]。在中枢神经损伤部位还存在一些抑制因子，这些抑制因子具有抑制轴突再生、延长等作用[20-22]。CSPGs是目前认为具有抑制轴突再生的重要因子之一，是由胶质瘢痕中的星形胶质细胞分泌的多糖蛋白，对于NSCs增殖和轴突生长均具有明显抑制作用[23]。ChABC是由普通变形杆菌产生的一种酶类，它具有催化分解黏多糖类的功能[24]。研究发现[25]，ChABC不仅可通过降低损伤脊髓局部的CAPGs，从而促进损伤轴突修复和再生，还能够促进脊髓损伤后功能障碍的恢复。
本实验通过对比研究经ATRA干预培养的NSCs联合GNDF、ChABC共同移植与其分别联合GDNF、ChABC移植治疗大鼠损伤脊髓，观察各组大鼠脊髓功能恢复情况和NSCs再生情况。研究结果发现，从移植后2周开始，C～E组大鼠神经功能障碍恢复程度均优于B组大鼠，尤其在移植后5、8周E组大鼠神经功能恢复更明显，大鼠BBB评分、SEP潜伏期和NSCs存活数量均显著优于C、D组，且差异有统计学意义。GFAP荧光染色观察示，E组星形胶质细胞少于C、D组，差异有统计学意义。提示NSCs联合GDNF、ChABC共同移植，对于降低脊髓损伤局部星形胶质细胞的形成较NSCs分别联合GDNF、ChABC具有更好效果，对减少局部瘢痕形成、促进神经功能障碍恢复有重要作用。通过本实验研究，我们初步认为经ATRA干预培养的NSCs联合GNDF、ChABC移植对促进大鼠损伤脊髓神经功能恢复较单独联合移植治疗效果更佳，且细胞因子GDNF、ChABC在治疗脊髓损伤过程中具有协同作用关系。
神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是存在于哺乳动物脊髓、海马和室管膜下层，具有分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞潜力的神经前体细胞[1]。研究发现，将NSCs移植至小鼠脊髓损伤部位后，小鼠运动功能显著恢复，免疫组织学观察发现移植的NSCs在损伤脊髓部位存活并向损伤区域迁移[2-3]。然而，相关动物实验研究发现，NSCs移植至损伤脊髓后分化为神经元数量有限，这可能与移植局部NGF缺乏、神经抑制因子增加相关[4-5]。胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）是轴突再生的一种重要神经营养因子，对于促进脊髓损伤后神经修复具有重要作用[6-7]。研究发现，GDNF可通过激活细胞内的胞浆蛋白酪氨酸激酶Fyn和FAK等信号途径促进轴突延长[8-9]。星形胶质细胞可在硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulphate proteoglycans，CSPGs）的刺激下形成胶质瘢痕，从而阻碍神经轴突延长和神经功能恢复[10-11]。而硫酸软骨素酶ABC （chondroitinase ABC，ChABC）是催化分解CSPGs的一种酶类，Starkey等[12]研究认为，ChABC可通过降低损伤脊髓局部CSPGs含量等相关途径，促进脊髓功能恢复。脊髓损伤后神经功能修复是由多种细胞因子和信号途径相互作用形成复杂网络调控，GDNF、ChABC通过不同信号途径促进轴突再生和神经功能恢复，二者在神经修复过程中是否具有相互作用，目前仍不清楚。本研究将全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）干预培养的鼠胚NSCs联合GDNF和ChABC移植至大鼠脊髓损伤部位，采用BBB评分、体感诱发电位（somatosensory evoked potentials，SEP）检测和免疫组织荧光染色观察评估大鼠脊髓功能恢复情况，探索促进脊髓损伤再生修复的方法以及GDNF、ChABC在修复过程中的相互作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂 、仪器
健康成年雌性SD大鼠60只，体重200～250 g，由泸州医学院实验动物中心提供。经ATRA（1.0 μmol/L）干预培养的鼠胚NSCs由本课题组前期实验完成并冻存备用[13-14]。于移植前1 d采用BrdU标记NSCs，移植前30 min采用0.25%胰蛋白酶消化10 min，以离心半径6 cm、1 000 r/min离心5 min，用培养基调节浓度为2×105个/μL的细胞悬液备用。
GDNF、ChABC（PeproTech公司，美国）；将GDNF冻干粉（10 μg/支）及ChABC（5 U/支）分别采用无菌PBS液溶解，调整浓度为10 μg/mL及5 U/ mL，无菌EP管分装，-20℃保存备用。
DAPI（Sigma公司，美国）； B27辅助生长因子、DMEM/F12（1∶1）、FBS（GIBCO公司，美国）；小鼠抗微管相关蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）IgG、FITC标记山羊抗小鼠IgG（武汉博士德生物科技有限公司）；鼠抗神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）IgG、罗丹明标记山羊抗兔IgG、兔抗BrdU多克隆IgG（北京博奥森生物技术有限公司）。 BX60荧光显微镜（Olympus公司，日本）；Image Pro-Plus图像分析软件（Media Cybernetics公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
将60只SD大鼠随机分为5组（n=12），分别为假手术组（A组）、损伤对照组（B组）、NSCs+GDNF移植组（C组）、NSCs+ChABC移植组（D组）、NSCs+GDNF+ChABC移植组（E组）。各组大鼠采用2%戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，以T9～11棘突为中心作背部正中切口，剥离双侧椎旁肌肉，A组仅行椎板切除术、蛛网膜下腔放置PE-10号导管；其余各组咬除椎板，暴露T9～11节段脊髓，尖刀片横断脊髓，解剖显微镜下将PE-10号导管穿皮下经蛛网膜下腔置入脊髓横断处，固定导管。检查无活动性出血，解剖显微镜下缝合硬脊膜，常规逐层缝合切口。体外导管热压封闭，以备后期细胞移植。术后每日协助排尿2次，直至恢复排尿反射；腹腔注射青霉素12万U/d，连续1周。
术后第8天，C、D、E组采用微量注射器经留置导管注入BrdU标记NSCs 10 μL，A、B组注入等量生理盐水。第8～14天每天C组经留置导管注入GDNF、生理盐水各10 μL，D组注射ChABC、生理盐水各10 μL，E组注射GDNF、ChABC各10 μL，A、B组注射生理盐水20 μL。
1.3 观测指标
1.3.1 一般情况
观察并记录造模术后及细胞移植后各组大鼠切口感染情况和死亡情况。
1.3.2 后肢运动功能评定
术前1 d、术后7 d及移植后1、2、5、8周采用BBB评分 [15]评价各组大鼠后肢运动功能。
1.3.3 神经电生理检查
术前1 d、术后7 d及移植后1、2、5、8周对各组大鼠进行SEP检测。大鼠同上法麻醉后固定、颅顶备皮。刺激电极置于踝关节上方胫后神经处，参考电极置于远侧1 cm处，记录电极置于冠状缝和矢状缝相交处头皮下后肢皮质感觉区，给予直流单方波电脉冲刺激，刺激强度7.5 V，波宽0.2 ms，频率3 Hz，观察记录SEP潜伏期的变化。
1.3.4 组织学及免疫荧光染色观察
移植后8周神经电生理检查后，各组大鼠给予生理盐水和4%中性多聚甲醛PBS缓冲液心脏灌注固定。原入路暴露脊髓，以横断面为中心切取长约4 cm脊髓组织，石蜡包埋、连续5 μm厚切片。每组标本随机取8张切片行HE染色，光镜下观察损伤区域改变情况。取8张采用一抗兔抗BrdU多克隆IgG标记神经元、二抗罗丹明标记山羊抗兔IgG显色，DAPI复染，荧光显微镜下BrdU阳性细胞胞体呈橘红色荧光。取8张加入一抗兔抗BrdU（1∶50）和鼠抗GFAP（1∶100) 混合物，二抗罗丹明标记山羊抗兔IgG（1∶50）和FITC标记羊抗小鼠IgG（1∶50）混合物显色，荧光显微镜下GFAP阳性细胞呈草绿色荧光。取8 张加入一抗兔抗BrdU（1∶50）和小鼠抗MAP-2（1∶100），其余步骤同BrdU/GFAP免疫荧光双标染色，荧光显微镜下MAP-2阳性细胞轴突呈草绿色荧光。每张切片取10个视野，荧光显微镜高倍镜下观察，采用Image Pro-Plus图像分析软件计数各免疫荧光染色阳性细胞。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 一般情况
除A组外，其余各组大鼠造模、麻醉清醒后双侧后肢均表现为完全瘫痪，提示造模成功。造模术后1 只大鼠死于切口感染，4只死于肠梗阻，均给予补充。
2.2 后肢运动功能评定
细胞移植后各组大鼠双侧后肢运动功能均有所恢复，C、D、E组较B组恢复明显，以E组恢复最佳。
各组大鼠术前BBB评分均为21分。术后7 d，除A组外，其余各组均为0分。移植后各时间点B～E组BBB评分均显著低于A组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；移植后1周，B～E组组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；移植后2、5、8周，C～E组BBB评分逐步上升且均高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；5、8周时，E组BBB评分高于C、D组，差异有统计学意义（P＜0.05）。其余时间点各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠各时间点后肢运动功能BBB评分比较（n=12，2.3 神经电生理检查
术前各组大鼠SEP潜伏期比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。术后7 d，B～E组潜伏期较A组明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05），B～E组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。移植后1、2、5、8周B～E组潜伏期亦显著长于A组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；2、5、8周，C、D、E组潜伏期逐渐缩短，与B组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；5、8周，E组与C、D组比较潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）；其余时间点各组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠各时间点SEP潜伏期比较(n=12，ms，2.4 组织学观察
A组大鼠灰、白质分界清楚（图 1 a），神经纤维束排列规则，细胞轮廓清楚、结构完整（图 1 b）。B组大鼠脊髓破坏严重，损伤区域灰白质结构紊乱、无明显界限，神经元坏死减少，有较大囊腔形成（图 1 c）。C～E组大鼠脊髓损伤区域细胞增生明显，星形胶质细胞增生并聚集于胶质瘢痕周围，坏死囊腔较B组小，C、D、E组间未见明显差异（图 1 d～f）。
图1
移植后8周各组HE染色观察 ⓐ A组（×100） ⓑ A组（×200） ⓒ B组（×200） ⓓ C组（×200） ⓔ D组（×200） ⓕ E组（×200）
Figure1.
HE staining observation at 8 weeks after transplantation ⓐ Group A (×100) ⓑ Group A (×200) ⓒ Group B (×200) ⓓ Group C (×200) ⓔ Group D (×200) ⓕ Group E (×200)
2.5 免疫荧光染色观察
荧光显微镜观察示，A、B组内未见BrdU阳性细胞；C～E组可见胞体呈橘红色的阳性细胞，主要分布于灰、白质。高倍镜下NSCs呈圆形或椭圆形分布于纤维束和空洞周围（图 2）。C、D、E组BrdU阳性细胞计数分别为（95.2±10.2）、（92.7±8.9）、（109.0±10.8）个/视野，E组显著多于C、D组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
图2
移植后8周各组BrdU免疫荧光染色观察（×200） ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 ⓔ E组 各组均可见GFAP染色阳性细胞分布于断端灰、白质空洞部位，神经元胞体向四周伸出放射状突起，部分相互交织成网（图 3）。A～E组阳性细胞计数分别为（16.9±2.2）、（19.8±3.0）、（13.5±2.5）（12.8±2.4）、（10.3±1.9）个/视野。C～E组GFAP阳性细胞少于A、B组，E组少于C、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
各组均可见MAP-2标记阳性细胞，主要分布于脊髓灰质神经元的胞体和突起（图 4）。A～E组MAP-2阳性细胞计数分别为（8.4±1.7）、（8.3±1.8）、（11.7±2.2）、（10.6±2.4）、（14.2±2.3）个/视野，C～E组阳性细胞多于A、B组，E组多于C、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；C、D组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。
3 讨论
脊髓损伤时可出现脊髓结构破坏、脊髓中神经细胞凋亡和坏死，从而遗留永久性神经功能障碍。临床常采用手术减压、药物营养神经、康复理疗、生物治疗等方式治疗脊髓损伤，但疗效欠佳，很难达到满意治疗效果。因此，如何治疗中枢神经系统损伤仍是研究热点。NSCs是一类具有分化为各种细胞潜能的成体干细胞。移植NSCs于损伤脊髓处，诱导其定向分化为神经元、修复并补充脊髓中受损的神经元，对于脊髓损伤的治疗具有重要意义，这种治疗方式也是目前临床和基础学科研究治疗脊髓损伤的热点方式。Salewski等[2] 及Yao等[3]通过移植鼠胚NSCs于大鼠损伤脊髓节段的相关研究，证实NSCs移植可促进损伤脊髓的修复和功能障碍的恢复。然而NSCs定向分化为神经元及脊髓功能障碍改善仍然有限[4]。本课题组既往通过使用不同浓度的ATRA对鼠胚NSCs进行培养，发现经1.0 μmol/ L ATRA诱导培养的鼠胚NSCs向神经元分化的比例高达70%[13, 16]。因此，本实验选取经1.0 μmol/L ATRA诱导的NSCs进行移植，以增加移植NSCs向神经元分化的比例。
动物实验发现[17]，移植的NSCs在损伤脊髓局部微环境中细胞因子的作用下，大量向星形胶质细胞分化，从而促进胶质瘢痕形成，并且移植的NSCs在损伤脊髓处存活数量和时间均有限。随着移植时间延长，移植的NSCs逐渐出现选择性消融，从而导致已恢复的运动功能再次恶化[18]。导致上述改变的原因可能与损伤脊髓局部微循环中的细胞因子改变密切相关。脊髓损伤局部存在各种神经营养因子和神经修复、再生抑制因子，这些因子对促进脊髓损伤的修复意义重大。GDNF是由神经胶质细胞分泌的一种神经营养因子，它广泛分布于脊髓中，具有促进触突再生、脊髓损伤后神经功能恢复等作用[19]。相关研究证实，GDNF可通过激活细胞内的胞浆蛋白酪氨酸激酶Fyn和FAK等信号途径，从而促进轴突再生和髓鞘化[8-9]。在中枢神经损伤部位还存在一些抑制因子，这些抑制因子具有抑制轴突再生、延长等作用[20-22]。CSPGs是目前认为具有抑制轴突再生的重要因子之一，是由胶质瘢痕中的星形胶质细胞分泌的多糖蛋白，对于NSCs增殖和轴突生长均具有明显抑制作用[23]。ChABC是由普通变形杆菌产生的一种酶类，它具有催化分解黏多糖类的功能[24]。研究发现[25]，ChABC不仅可通过降低损伤脊髓局部的CAPGs，从而促进损伤轴突修复和再生，还能够促进脊髓损伤后功能障碍的恢复。
本实验通过对比研究经ATRA干预培养的NSCs联合GNDF、ChABC共同移植与其分别联合GDNF、ChABC移植治疗大鼠损伤脊髓，观察各组大鼠脊髓功能恢复情况和NSCs再生情况。研究结果发现，从移植后2周开始，C～E组大鼠神经功能障碍恢复程度均优于B组大鼠，尤其在移植后5、8周E组大鼠神经功能恢复更明显，大鼠BBB评分、SEP潜伏期和NSCs存活数量均显著优于C、D组，且差异有统计学意义。GFAP荧光染色观察示，E组星形胶质细胞少于C、D组，差异有统计学意义。提示NSCs联合GDNF、ChABC共同移植，对于降低脊髓损伤局部星形胶质细胞的形成较NSCs分别联合GDNF、ChABC具有更好效果，对减少局部瘢痕形成、促进神经功能障碍恢复有重要作用。通过本实验研究，我们初步认为经ATRA干预培养的NSCs联合GNDF、ChABC移植对促进大鼠损伤脊髓神经功能恢复较单独联合移植治疗效果更佳，且细胞因子GDNF、ChABC在治疗脊髓损伤过程中具有协同作用关系。
