引用本文： 徐良, 刘璠, 朱建炜, 朱立帆, 蒋富贵. 胞浆泛素蛋白连接酶2在大鼠脊髓损伤后星形胶质细胞中的表达及意义. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(8): 978-985. doi: 10.7507/1002-1892.20150211 复制
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的治疗一直是医学界难题。SCI包括原发性和继发性两种损伤机制[1]，后者可导致损伤部位胶质细胞反应性增生形成胶质瘢痕，局部微环境破坏，从而不利于轴突再生，损伤髓鞘无法修复，最终导致伤后功能恢复困难[2-3]。如何调控星形胶质细胞的激活增殖成为研究热点[4-5]。有研究表明，SCI的病理生理过程离不开细胞周期机制的调控[6]。在细胞周期调节过程中，细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin depedent kinase，CDK）和CDK抑制剂（CDK inhibitor，CDKI）通过相互作用来调控细胞周期进展。作为CDKI家族的主要成员之一，最令人注目的是p27kip1分子，它参与调节了神经发生的多个方面[7-8]。p27kip1表达量对机体功能维持发挥着至关重要的作用，其表达量的调节主要依赖于一些相关蛋白介导的泛素化降解机制。胞浆泛素蛋白连接酶2 （Kip1 ubiquitylation-promoting complex 2，KPC2）是UBL-UBA蛋白家族成员之一，能够与另一催化亚基KPC1共同形成p27kip1的泛素蛋白连接酶复合体，NH2端的UBA结构域可结合多聚范素化蛋白，从而介导p27kip1在细胞G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影响p27kip1蛋白量的表达水平[9-11]。有研究表明，p27kip1和KPC1参与SCI修复过程的调节[12]。那么在SCI后KPC2的表达情况如何，KPC2是否参与SCI后胶质细胞活化增殖的调控，目前尚缺乏相关研究。本研究通过建立SD大鼠脊髓撞击损伤和体外培养星形胶质细胞增殖模型，观察KPC2在星形胶质细胞中的分布和表 达变 化，为探讨SCI的修复机制提供新的分子基 础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年SD大鼠56只，雌雄不限，体重200～230 g；新生24 h内SD大鼠14只，体重5～6 g；均购于南通医学院实验动物中心。
抗p27kip1、抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、抗GAPDH抗体（Santa Cruz公司，美国）；抗KPC1、KPC2抗体（Abcam公司，美国）；抗生物素蛋白-生物素-过氧化酶复合物液（上海源叶生物科技有限公司）；抗神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）单克隆抗体（Cell-Signalling公司，美国）；抗神经元特异性核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）单克隆抗体（Chemicon公司，美国）。低温冷冻离心机（Beckman公司，美国）；电泳仪（上海西巴斯生物技术开发有限公司）；紫外分光光度仪（Eppendorf公司，德国）；荧光显微镜（Leica公司，德国）；图像分析系统（Syngene公司，英国）。
1.2 大鼠SCI模型制备及实验方法
1.2.1 实验分组及大鼠SCI模型制备
将成年SD大鼠随机分为2组，对照组7只，实验组49只。大鼠以水合氯醛（200 mg/kg）腹腔注射麻醉后，取俯卧位，以T9为中心常规背部皮肤脱毛、消毒，对照组仅行单纯T9椎板全切除术，保证硬脊膜完整；实验组将显露的T9脊髓用打击器撞击（10 g×10 cm），鼠尾痉挛性摆动、双下肢回缩扑动后肢瘫痪提示造模成功。再次消毒后逐层缝合皮肤。伤后每天定时给予3次人工膀胱排尿，必要时人工排便。实验组于伤后6、12 h及1、3、5、7、14 d分别取7只大鼠进行以下检测。
1.2.2 Western
blot检测 分别取对照组和各时间点实验组大鼠（n=4），以SCI处为中心切取长约1 cm脊髓，按1 mL/100 mg加入蛋白裂解液，4℃以离心半径6 cm、10 000 r/min离心30 min，取上清用紫外分光光度仪测定蛋白含量，按蛋白量∶2×SDS上样缓冲液∶二硫苏糖醇为4∶1∶5比例处理蛋白，沸水煮5 min后行PAGE凝胶电泳；电泳结束后行湿式电转移，转移后的聚偏氟乙烯膜用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭2 h，然后用抗p27kip1、KPC2、PCNA和细胞周期蛋白A（CyclinA）抗体室温封闭1 h后，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次5 min，辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育2 h，TBST漂洗，最后暗房胶片显影。以目的条带与内参GAPDH（1∶2 000）的平均吸光度（A）值比值表示相对表达量进行半定量分析。实验组取KPC2表达最高的时间点取材进行免疫组织化学和免疫荧光双标记染色检测。
1.2.3 免疫组织化学染色观察
取对照组和实验组KPC2表达最高时间点大鼠（n=3），同上法麻醉后仰卧位固定，打开胸廓，自左心室插管，切开右心房，生理盐水200 mL、4%多聚甲醛约500 mL灌注固定30 min，冰盒上打开椎管，暴露脊髓，以损伤处为中心切取两侧各约5 mm脊髓组织，常规脱水后，OCT包埋剂包埋，行冠状面连续冰冻切片，厚10 μm。两组选取3张切片，加10%驴血清封闭液室温封闭2 h；去封闭液，加兔抗KPC2一抗（1∶100）4℃孵育过夜，0.01 mol/L PBS洗涤3次后加生物素偶联试剂偶联的驴抗兔二抗，37℃孵育2 h；PBS洗涤，滴加抗生物素蛋白-生物素-过氧化酶复合物液37℃孵育40 min，PBS洗涤3次后DAB显色，常规梯度脱水、透明，封片吹干后荧光显微镜观察。镜下于10 mm×10 mm视野下计数KPC2阳性细胞数。采用0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照。
1.2.4 免疫荧光双标记染色观察
两组各取上述切片3张，10%驴血清封闭液室温2 h封闭非特异性位点。去封闭液，加一抗[KPC2（1∶100），NeuN（1∶600），PCNA（1∶500），GFAP（1∶500）]，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次后，暗室加CY2和CY3标记的荧光二抗，避光室温孵育2 h，PBS洗涤后碳酸盐缓冲甘油封片，暗室内荧光显微镜观察，于10 mm×10 mm视野内计数阳性细胞数。采用同浓度PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 体外星形胶质细胞增殖模型制备及实验方法
1.3.1 新生大鼠脊髓星形胶质细胞分离、培养及传代
取新生24 h内SD大鼠，参照McCarthy等[13]方法并进行改进分离培养星形胶质细胞。将大鼠于75%乙醇中浸泡1 min后，无菌条件下取其脊髓，置冰浴D-Hank液中，分离、剪碎脊髓组织；置离心管中，加10倍0.125%胰蛋白酶37℃下消化15 min；用DMEM基础培养基终止消化，过200目筛网，1 200 r/min离心5 min；弃上清，加入含10%FBS的DMEM/F12培养基轻柔吹打制成细胞悬液，调节细胞密度为5×105个/cm2，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。每3天半量换液1次，9～10 d后细胞已基本融合。将培养瓶置于37℃恒温旋转摇床，200 r/min、20 h；更换新的含10%FBS的DMEM/F12培养基，以除去生长在星形胶质细胞上层的小胶质细胞和少突细胞。D-Hank液清洗3次，进行传代培养即得到纯化的星形胶质细胞。使用血清饥饿48 h疗法使细胞同步在G0/G1期，随后加入新生小牛血清刺激细胞增殖，模拟体内星形胶质细胞受损伤后增殖条件；以未加入血清为对照组。收获对照组及实验组刺激各时间点（1、3、6、12、24、48 h）培养细胞，加入适量细胞裂解缓冲液，提取细胞蛋白进行以下分析。
1.3.2 星形胶质细胞纯度检测
未行血清饥饿疗法前，取体外培养纯化的星形胶质细胞，以5×104 个 / mL密度接种于10 mm×10 mm小圆盖玻片上，3 d后PBS洗涤细胞玻片，4%多聚甲醛固定1 h后，以正常兔血清室温封闭1 h，加入抗GFAP（1∶800）单克隆抗体，等量抗体稀释液作对照，4℃孵育过夜，FITC标记的荧光二抗孵育 1 h，Hoechst染核30 min，暗室内荧光显微镜下观察。镜下于10 mm×10 mm视野下计数GFAP阳性细胞数。
1.3.3 Western
blot检测及免疫共沉淀分析 取各组各时间点细胞，按1.2.2蛋白处理方法裂解细胞，取部分细胞裂解后上清液行Western blot检测。剩余细胞裂解液中加入1～2 μg KPC2、KPC1、p27kip1抗体，4℃摇床孵育过夜，加入经预处理的10 μL Protein A琼脂糖珠，4℃摇床2～4 h，使抗体与Protein A琼脂糖珠耦联；免疫沉淀反应后，4℃以离心半径6 cm、1 200 r/min离心3 min，将Protein A琼脂糖珠离心至管底；去上清液，Protein A琼脂糖珠用裂解缓冲液洗3次，最后加入15 μL 2×SDS上样缓冲液，沸水煮5 min，离心取上清，SDS-PAGE凝胶电泳行免疫共沉淀。
1.4 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 KPC2在大鼠SCI过程中的表达
2.1.1 Western
blot检测 与对照组比较，实验组p27kip1表达量在损伤后即开始降低，3 d时降至最低，之后逐渐升高，14 d时恢复至对照组水平；实验组KPC2、CyclinA及PCNA表达量在损伤后即开始增加，3 d达峰值，之后缓慢下降，14 d时PCNA表达量仍维持较高水平。实验组损伤后3、5、7 d p27kip1、KPC2、CyclinA及PCNA表达量与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 1、表 1。
图1
Western blot检测两组各时间点各蛋白表达 1：对照组 2：实验组6 h 3：实验组12 h 4：实验组1 d 5：实验组3 d 6：实验组5 d 7：实验组7 d 8：实验组14 d 
表1
Western blot检测对照组、实验组SCI过程中各时间点各蛋白表达（n=4，2.1.2 免疫组织化学染色观察
低倍镜下发现两组KPC2阳性信号广泛分布，包括脊髓灰质和白质。高倍镜下观察到对照组KPC2阳性信号较弱；而实验组SCI后3 d KPC2阳性细胞数量及阳性信号强度均明显增加（图 2），阳性细胞数为（320.40±34.20）个 /视野，显著高于对照组的（145.67±24.55）个/视野，差异有统计学意义（t=10.982，P=0.000）。
2.1.3 免疫荧光双标记染色观察
在脊髓灰质，两组KPC2与NeuN标记的神经元均有共定位；对照组和实验组KPC2与NeuN双标记阳性细胞数分别为（0.43±0.53）、（0.57±0.53）个/视野，比较差异无统计学意义（t=0.548，P=0.604）。在脊髓白质，两组KPC2与GFAP标记的星形胶质细胞共定位明显，并且实验组较对照组细胞形态有所改变，且阳性信号细胞数量（3.86±0.90）个/视野较对照组（0.71±0.49） 个/视野明显增加，差异有统计学意义（t=7.778，P=0.000）。在脊髓白质，两组KPC2与PCNA标记的星形胶质细胞共定位明显，且实验组阳性细胞数（5.57±1.13）个/视野较对照组（0.57±0.53）个/视野明显增加，差异有统计学意义（t=8.101，P=0.000）。见图 3。
图3
两组免疫荧光双标记染色观察（荧光显微镜×400） ⓐ 实验组KPC2 ⓑ 实验组NeuN ⓒ 实验组KPC2/NeuN合图 ⓓ 对照组KPC2/NeuN合图 ⓔ 实验组KPC2 ⓕ 实验组GFAP ⓖ 实验组KPC2/GFAP合图 ⓗ 对照组KPC2/GFAP合图 ⓘ 实验组KPC2 ⓙ 实验组PCNA ⓚ 实验组KPC2/PCNA合图 ⓛ 对照组KPC2/PCNA合图 2.2 KPC2在体外培养星形胶质细胞中的表达
荧光细胞化学分析法检测示，分离纯化的星形胶质细胞纯度达98.5%（图 4）。提取细胞蛋白行Western blot检测示，PCNA和KPC2蛋白表达在血清刺激增殖后即开始增加，24 h达峰值，而p27kip1表达则逐渐减少（图 5）。免疫共沉淀分析示，KPC2可沉淀p27kip1、KPC1，p27kip1也可沉淀KPC2、KPC1，且在刺激后相互作用明显增加（图 6）。
图5
Western blot检测体外培养星形胶质细胞增殖模型中各蛋白表达 1：对照组 2：实验组1 h 3：实验组3 h 4：实验组6 h 5：实验组12 h 6：实验组24 h 7：实验组48 h 3 讨论
SCI是临床常见的高致残性损伤，可造成患者神经功能永久性障碍。通过对SCI的病理改变和继发损伤深入研究，目前认为影响脊髓有效修复的原因可归结于以下两个主要方面[14-16]：① 原发性损伤后造成大量神经元细胞凋亡，而神经元本身缺乏再生能力；② 继发性损伤引发的包括损伤区域炎性反应、神经营养因子缺乏、胶质细胞为主要成分的致密胶质瘢痕形成，以及抑制轴突生长乃至妨碍轴突正确寻靶的抑制性分子的存在等，造成抑制神经再生的微环境。近年来，改善SCI后的局部微环境，特别是减少局部胶质瘢痕形成，成为研究热点之一。
SCI后巨噬细胞聚集、激活并释放一些细胞因子，促使星形胶质细胞和小胶质细胞迁移，同时星形胶质细胞增殖、肥大，细胞较正常时出现更多的胶质丝和突起，随后包围受损和变性的神经元，最终导致胶质瘢痕形成[17]。虽然胶质瘢痕在隔离损伤组织中起到有益作用[18]，但同时也构成了神经元突起生长的屏障而阻碍轴突再生，干扰神经元功能恢复，既往研究已证实胶质瘢痕是影响轴突再生和中枢系统损伤后功能恢复的主要障碍[19-20]。星形胶质细胞是胶质瘢痕的主要形成细胞，因此研究SCI后反应性胶质增生、瘢痕形成的内在分子机制，进而探索出有效调节、平衡该过程的方法，也许可为我们治疗SCI提供新的思路。
研究证实，SCI的病理生理过程受细胞周期的调控。抑制细胞周期进程有助于减少胶质细胞的增生和瘢痕形成[21]；反之，促进细胞周期进程会引起细胞死亡和胶质细胞活化增生[22]。细胞周期内源性调控主要通过细胞周期蛋白、CDK和其抑制剂CDKI的参与。细胞周期的正性调节蛋白不仅可促进胶质细胞的激活，并且由于神经元属于终末分化细胞，当细胞周期调节蛋白高表达时，神经元常出现凋亡，而运用细胞周期抑制剂可抑制神经系统损伤后神经元的凋亡及胶质细胞激活，有效改善临床症状。p27kip1为细胞周期蛋白负性调控分子的典型代表，由于它对激酶的抑制作用，周期蛋白复合物不能有效地磷酸化Rb蛋白，E2F转录因子不能被释放，下游的基因不能被转录，从而阻断了细胞周期的进程。由此可见p27kip1表达量对机体维持正常功能发挥着至关重要的作用。由于 P27kip1的基因突变非常罕见，其mRNA在整个细胞周期的水平也基本恒定，其表达量的调节主要依赖于一些相关蛋白介导的泛素化降解机制。其降解形式主要是在核内S10、Thr187位磷酸化，然后出核转运至细胞质，通过26S蛋白酶体途径降解。细胞质E3复合体KPC是细胞 G1～S期p27kip1泛素化降解所需的一种胞浆泛素蛋白连接酶复合体。KPC包括KPC1和KPC2两个亚基。KPC2是UBL-UBA 蛋白家族成员之一，能够与另一催化亚基KPC1共同形成KPC。KPC2通过其COOH端的UBL结构域可促进p27kip1运输至26S 蛋白酶并对KPC1亚基起到稳定作用；NH2端的UBA结构域可结合多聚范素化蛋白，从而介导p27kip1在G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影响p27kip1蛋白量的表达水平。
研究发现，p27kip1作为一种细胞周期相关性抑制蛋白，在细胞中静息期表达较高，某些刺激因素导致细胞进入增殖期后，其表达就会有明显下降。对这一分子表达量的调节主要发生在转录后水平，KPC2对其有泛素化降解作用。本实验结果显示，SCI后p27kip1的表达先降低后恢复正常，相应时间点KPC2表达则明显增加，二者蛋白表达量存在负相关，说明撞击损伤初期既有熟知的细胞凋亡，还会有相关细胞的增殖修复，才会造成p27kip1蛋白表达下调；修复后期大部分细胞则重新进入G0期，p27kip1蛋白表达则又上升。免疫组织化学结果虽然验证了Western blot实验结果，但免疫组织化学结果只能显示KPC2广泛定位于脊髓灰质和白质中，为了确定KPC2在损伤脊髓后的高表达具体与哪种细胞类型相关，我们运用免疫荧光双标记观察KPC2的细胞定位情况。免疫荧光双标记结果显示在脊髓灰质前角和后角，KPC2与神经元在损伤前后均有共定位；在白质，KPC2与GFAP标记的星形胶质细胞有明显共定位，且在损伤后阳性信号增加，KPC2表达的这种差异主要在白质的胶质细胞中显现。在空间形态上，免疫荧光双标记结果显示损伤3 d左右较对照组星形胶质细胞数目增加、胞体肥大、分支增多交织成网状；GFAP和PCNA在此时有明显的共定位。因此，我们推测SCI激发了细胞周期的进程（G1～S期），造成了星形胶质细胞的活化与增殖。同时检测到增殖指标CyclinA和PCNA表达量在损伤后表达开始逐渐升高，伤后3 d表达量最高，一直维持较高水平至损伤后14 d左右，更验证了这一时期胶质细胞增殖。荧光结果显示KPC2与GFAP、PCNA有明显共定位，且损伤后共定位明显增加。以上结果更加明确了KPC2与SCI后星形胶质细胞的增殖相关。结合既往研究p27kip1和KPC1参与SCI过程的调节，且KPC2能够与催化亚基KPC1共同形成p27kip1的泛素蛋白连接酶复合体，从而介导p27kip1在G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影响p27kip1蛋白量的表达水平[12]。在本实验中发现p27kip1在SCI后的确存在着时空表达变化，为了研究KPC2、KPC1和p27kip1之间在损伤后脊髓中存在相互作用，我们运用了免疫共沉淀实验方法，结果表明三者间可互相作用，且在细胞增殖期作用明显增强。以上结果显示KPC2与SCI后星形胶质细胞的增殖相关。为了进一步阐述这一问题，本研究采用新生24 h内SD大鼠脊髓，体外培养原代星形胶质细胞，使用血清饥饿48 h疗法致使细胞同步在G0/G1期，随后加入血清刺激细胞增殖，模拟体内星形胶质细胞受损伤后增殖条件。荧光细胞化学分析法检测示，分离纯化的星形胶质细胞纯度达98.5%。提取细胞蛋白行Western blot检测示，PCNA和KPC2蛋白表达在血清刺激增殖后即开始增加，24 h达峰值，而p27kip1表达则逐渐减少。这一结果进一步验证了大体水平结论的正确性。
综上述，本研究首次报道了KPC2在SCI前后的空间表达变化，指出KPC2依赖的p27kip1泛素化降解过程，可能为SCI后抑制星形胶质细胞的过度活化增殖起到作用，为今后进一步研究p27kip1及其调控分子网络在SCI后胶质细胞增殖、瘢痕形成生理和病理过程中发挥的作用奠定了形态学基础。
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的治疗一直是医学界难题。SCI包括原发性和继发性两种损伤机制[1]，后者可导致损伤部位胶质细胞反应性增生形成胶质瘢痕，局部微环境破坏，从而不利于轴突再生，损伤髓鞘无法修复，最终导致伤后功能恢复困难[2-3]。如何调控星形胶质细胞的激活增殖成为研究热点[4-5]。有研究表明，SCI的病理生理过程离不开细胞周期机制的调控[6]。在细胞周期调节过程中，细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin depedent kinase，CDK）和CDK抑制剂（CDK inhibitor，CDKI）通过相互作用来调控细胞周期进展。作为CDKI家族的主要成员之一，最令人注目的是p27kip1分子，它参与调节了神经发生的多个方面[7-8]。p27kip1表达量对机体功能维持发挥着至关重要的作用，其表达量的调节主要依赖于一些相关蛋白介导的泛素化降解机制。胞浆泛素蛋白连接酶2 （Kip1 ubiquitylation-promoting complex 2，KPC2）是UBL-UBA蛋白家族成员之一，能够与另一催化亚基KPC1共同形成p27kip1的泛素蛋白连接酶复合体，NH2端的UBA结构域可结合多聚范素化蛋白，从而介导p27kip1在细胞G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影响p27kip1蛋白量的表达水平[9-11]。有研究表明，p27kip1和KPC1参与SCI修复过程的调节[12]。那么在SCI后KPC2的表达情况如何，KPC2是否参与SCI后胶质细胞活化增殖的调控，目前尚缺乏相关研究。本研究通过建立SD大鼠脊髓撞击损伤和体外培养星形胶质细胞增殖模型，观察KPC2在星形胶质细胞中的分布和表 达变 化，为探讨SCI的修复机制提供新的分子基 础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年SD大鼠56只，雌雄不限，体重200～230 g；新生24 h内SD大鼠14只，体重5～6 g；均购于南通医学院实验动物中心。
抗p27kip1、抗增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、抗GAPDH抗体（Santa Cruz公司，美国）；抗KPC1、KPC2抗体（Abcam公司，美国）；抗生物素蛋白-生物素-过氧化酶复合物液（上海源叶生物科技有限公司）；抗神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）单克隆抗体（Cell-Signalling公司，美国）；抗神经元特异性核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）单克隆抗体（Chemicon公司，美国）。低温冷冻离心机（Beckman公司，美国）；电泳仪（上海西巴斯生物技术开发有限公司）；紫外分光光度仪（Eppendorf公司，德国）；荧光显微镜（Leica公司，德国）；图像分析系统（Syngene公司，英国）。
1.2 大鼠SCI模型制备及实验方法
1.2.1 实验分组及大鼠SCI模型制备
将成年SD大鼠随机分为2组，对照组7只，实验组49只。大鼠以水合氯醛（200 mg/kg）腹腔注射麻醉后，取俯卧位，以T9为中心常规背部皮肤脱毛、消毒，对照组仅行单纯T9椎板全切除术，保证硬脊膜完整；实验组将显露的T9脊髓用打击器撞击（10 g×10 cm），鼠尾痉挛性摆动、双下肢回缩扑动后肢瘫痪提示造模成功。再次消毒后逐层缝合皮肤。伤后每天定时给予3次人工膀胱排尿，必要时人工排便。实验组于伤后6、12 h及1、3、5、7、14 d分别取7只大鼠进行以下检测。
1.2.2 Western
blot检测 分别取对照组和各时间点实验组大鼠（n=4），以SCI处为中心切取长约1 cm脊髓，按1 mL/100 mg加入蛋白裂解液，4℃以离心半径6 cm、10 000 r/min离心30 min，取上清用紫外分光光度仪测定蛋白含量，按蛋白量∶2×SDS上样缓冲液∶二硫苏糖醇为4∶1∶5比例处理蛋白，沸水煮5 min后行PAGE凝胶电泳；电泳结束后行湿式电转移，转移后的聚偏氟乙烯膜用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭2 h，然后用抗p27kip1、KPC2、PCNA和细胞周期蛋白A（CyclinA）抗体室温封闭1 h后，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次5 min，辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育2 h，TBST漂洗，最后暗房胶片显影。以目的条带与内参GAPDH（1∶2 000）的平均吸光度（A）值比值表示相对表达量进行半定量分析。实验组取KPC2表达最高的时间点取材进行免疫组织化学和免疫荧光双标记染色检测。
1.2.3 免疫组织化学染色观察
取对照组和实验组KPC2表达最高时间点大鼠（n=3），同上法麻醉后仰卧位固定，打开胸廓，自左心室插管，切开右心房，生理盐水200 mL、4%多聚甲醛约500 mL灌注固定30 min，冰盒上打开椎管，暴露脊髓，以损伤处为中心切取两侧各约5 mm脊髓组织，常规脱水后，OCT包埋剂包埋，行冠状面连续冰冻切片，厚10 μm。两组选取3张切片，加10%驴血清封闭液室温封闭2 h；去封闭液，加兔抗KPC2一抗（1∶100）4℃孵育过夜，0.01 mol/L PBS洗涤3次后加生物素偶联试剂偶联的驴抗兔二抗，37℃孵育2 h；PBS洗涤，滴加抗生物素蛋白-生物素-过氧化酶复合物液37℃孵育40 min，PBS洗涤3次后DAB显色，常规梯度脱水、透明，封片吹干后荧光显微镜观察。镜下于10 mm×10 mm视野下计数KPC2阳性细胞数。采用0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照。
1.2.4 免疫荧光双标记染色观察
两组各取上述切片3张，10%驴血清封闭液室温2 h封闭非特异性位点。去封闭液，加一抗[KPC2（1∶100），NeuN（1∶600），PCNA（1∶500），GFAP（1∶500）]，4℃孵育过夜，PBS洗涤3次后，暗室加CY2和CY3标记的荧光二抗，避光室温孵育2 h，PBS洗涤后碳酸盐缓冲甘油封片，暗室内荧光显微镜观察，于10 mm×10 mm视野内计数阳性细胞数。采用同浓度PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 体外星形胶质细胞增殖模型制备及实验方法
1.3.1 新生大鼠脊髓星形胶质细胞分离、培养及传代
取新生24 h内SD大鼠，参照McCarthy等[13]方法并进行改进分离培养星形胶质细胞。将大鼠于75%乙醇中浸泡1 min后，无菌条件下取其脊髓，置冰浴D-Hank液中，分离、剪碎脊髓组织；置离心管中，加10倍0.125%胰蛋白酶37℃下消化15 min；用DMEM基础培养基终止消化，过200目筛网，1 200 r/min离心5 min；弃上清，加入含10%FBS的DMEM/F12培养基轻柔吹打制成细胞悬液，调节细胞密度为5×105个/cm2，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。每3天半量换液1次，9～10 d后细胞已基本融合。将培养瓶置于37℃恒温旋转摇床，200 r/min、20 h；更换新的含10%FBS的DMEM/F12培养基，以除去生长在星形胶质细胞上层的小胶质细胞和少突细胞。D-Hank液清洗3次，进行传代培养即得到纯化的星形胶质细胞。使用血清饥饿48 h疗法使细胞同步在G0/G1期，随后加入新生小牛血清刺激细胞增殖，模拟体内星形胶质细胞受损伤后增殖条件；以未加入血清为对照组。收获对照组及实验组刺激各时间点（1、3、6、12、24、48 h）培养细胞，加入适量细胞裂解缓冲液，提取细胞蛋白进行以下分析。
1.3.2 星形胶质细胞纯度检测
未行血清饥饿疗法前，取体外培养纯化的星形胶质细胞，以5×104 个 / mL密度接种于10 mm×10 mm小圆盖玻片上，3 d后PBS洗涤细胞玻片，4%多聚甲醛固定1 h后，以正常兔血清室温封闭1 h，加入抗GFAP（1∶800）单克隆抗体，等量抗体稀释液作对照，4℃孵育过夜，FITC标记的荧光二抗孵育 1 h，Hoechst染核30 min，暗室内荧光显微镜下观察。镜下于10 mm×10 mm视野下计数GFAP阳性细胞数。
1.3.3 Western
blot检测及免疫共沉淀分析 取各组各时间点细胞，按1.2.2蛋白处理方法裂解细胞，取部分细胞裂解后上清液行Western blot检测。剩余细胞裂解液中加入1～2 μg KPC2、KPC1、p27kip1抗体，4℃摇床孵育过夜，加入经预处理的10 μL Protein A琼脂糖珠，4℃摇床2～4 h，使抗体与Protein A琼脂糖珠耦联；免疫沉淀反应后，4℃以离心半径6 cm、1 200 r/min离心3 min，将Protein A琼脂糖珠离心至管底；去上清液，Protein A琼脂糖珠用裂解缓冲液洗3次，最后加入15 μL 2×SDS上样缓冲液，沸水煮5 min，离心取上清，SDS-PAGE凝胶电泳行免疫共沉淀。
1.4 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 KPC2在大鼠SCI过程中的表达
2.1.1 Western
blot检测 与对照组比较，实验组p27kip1表达量在损伤后即开始降低，3 d时降至最低，之后逐渐升高，14 d时恢复至对照组水平；实验组KPC2、CyclinA及PCNA表达量在损伤后即开始增加，3 d达峰值，之后缓慢下降，14 d时PCNA表达量仍维持较高水平。实验组损伤后3、5、7 d p27kip1、KPC2、CyclinA及PCNA表达量与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 1、表 1。
图1
Western blot检测两组各时间点各蛋白表达 1：对照组 2：实验组6 h 3：实验组12 h 4：实验组1 d 5：实验组3 d 6：实验组5 d 7：实验组7 d 8：实验组14 d
表1
Western blot检测对照组、实验组SCI过程中各时间点各蛋白表达（n=4，2.1.2 免疫组织化学染色观察
低倍镜下发现两组KPC2阳性信号广泛分布，包括脊髓灰质和白质。高倍镜下观察到对照组KPC2阳性信号较弱；而实验组SCI后3 d KPC2阳性细胞数量及阳性信号强度均明显增加（图 2），阳性细胞数为（320.40±34.20）个 /视野，显著高于对照组的（145.67±24.55）个/视野，差异有统计学意义（t=10.982，P=0.000）。
2.1.3 免疫荧光双标记染色观察
在脊髓灰质，两组KPC2与NeuN标记的神经元均有共定位；对照组和实验组KPC2与NeuN双标记阳性细胞数分别为（0.43±0.53）、（0.57±0.53）个/视野，比较差异无统计学意义（t=0.548，P=0.604）。在脊髓白质，两组KPC2与GFAP标记的星形胶质细胞共定位明显，并且实验组较对照组细胞形态有所改变，且阳性信号细胞数量（3.86±0.90）个/视野较对照组（0.71±0.49） 个/视野明显增加，差异有统计学意义（t=7.778，P=0.000）。在脊髓白质，两组KPC2与PCNA标记的星形胶质细胞共定位明显，且实验组阳性细胞数（5.57±1.13）个/视野较对照组（0.57±0.53）个/视野明显增加，差异有统计学意义（t=8.101，P=0.000）。见图 3。
图3
两组免疫荧光双标记染色观察（荧光显微镜×400） ⓐ 实验组KPC2 ⓑ 实验组NeuN ⓒ 实验组KPC2/NeuN合图 ⓓ 对照组KPC2/NeuN合图 ⓔ 实验组KPC2 ⓕ 实验组GFAP ⓖ 实验组KPC2/GFAP合图 ⓗ 对照组KPC2/GFAP合图 ⓘ 实验组KPC2 ⓙ 实验组PCNA ⓚ 实验组KPC2/PCNA合图 ⓛ 对照组KPC2/PCNA合图 2.2 KPC2在体外培养星形胶质细胞中的表达
荧光细胞化学分析法检测示，分离纯化的星形胶质细胞纯度达98.5%（图 4）。提取细胞蛋白行Western blot检测示，PCNA和KPC2蛋白表达在血清刺激增殖后即开始增加，24 h达峰值，而p27kip1表达则逐渐减少（图 5）。免疫共沉淀分析示，KPC2可沉淀p27kip1、KPC1，p27kip1也可沉淀KPC2、KPC1，且在刺激后相互作用明显增加（图 6）。
图5
Western blot检测体外培养星形胶质细胞增殖模型中各蛋白表达 1：对照组 2：实验组1 h 3：实验组3 h 4：实验组6 h 5：实验组12 h 6：实验组24 h 7：实验组48 h 3 讨论
SCI是临床常见的高致残性损伤，可造成患者神经功能永久性障碍。通过对SCI的病理改变和继发损伤深入研究，目前认为影响脊髓有效修复的原因可归结于以下两个主要方面[14-16]：① 原发性损伤后造成大量神经元细胞凋亡，而神经元本身缺乏再生能力；② 继发性损伤引发的包括损伤区域炎性反应、神经营养因子缺乏、胶质细胞为主要成分的致密胶质瘢痕形成，以及抑制轴突生长乃至妨碍轴突正确寻靶的抑制性分子的存在等，造成抑制神经再生的微环境。近年来，改善SCI后的局部微环境，特别是减少局部胶质瘢痕形成，成为研究热点之一。
SCI后巨噬细胞聚集、激活并释放一些细胞因子，促使星形胶质细胞和小胶质细胞迁移，同时星形胶质细胞增殖、肥大，细胞较正常时出现更多的胶质丝和突起，随后包围受损和变性的神经元，最终导致胶质瘢痕形成[17]。虽然胶质瘢痕在隔离损伤组织中起到有益作用[18]，但同时也构成了神经元突起生长的屏障而阻碍轴突再生，干扰神经元功能恢复，既往研究已证实胶质瘢痕是影响轴突再生和中枢系统损伤后功能恢复的主要障碍[19-20]。星形胶质细胞是胶质瘢痕的主要形成细胞，因此研究SCI后反应性胶质增生、瘢痕形成的内在分子机制，进而探索出有效调节、平衡该过程的方法，也许可为我们治疗SCI提供新的思路。
研究证实，SCI的病理生理过程受细胞周期的调控。抑制细胞周期进程有助于减少胶质细胞的增生和瘢痕形成[21]；反之，促进细胞周期进程会引起细胞死亡和胶质细胞活化增生[22]。细胞周期内源性调控主要通过细胞周期蛋白、CDK和其抑制剂CDKI的参与。细胞周期的正性调节蛋白不仅可促进胶质细胞的激活，并且由于神经元属于终末分化细胞，当细胞周期调节蛋白高表达时，神经元常出现凋亡，而运用细胞周期抑制剂可抑制神经系统损伤后神经元的凋亡及胶质细胞激活，有效改善临床症状。p27kip1为细胞周期蛋白负性调控分子的典型代表，由于它对激酶的抑制作用，周期蛋白复合物不能有效地磷酸化Rb蛋白，E2F转录因子不能被释放，下游的基因不能被转录，从而阻断了细胞周期的进程。由此可见p27kip1表达量对机体维持正常功能发挥着至关重要的作用。由于 P27kip1的基因突变非常罕见，其mRNA在整个细胞周期的水平也基本恒定，其表达量的调节主要依赖于一些相关蛋白介导的泛素化降解机制。其降解形式主要是在核内S10、Thr187位磷酸化，然后出核转运至细胞质，通过26S蛋白酶体途径降解。细胞质E3复合体KPC是细胞 G1～S期p27kip1泛素化降解所需的一种胞浆泛素蛋白连接酶复合体。KPC包括KPC1和KPC2两个亚基。KPC2是UBL-UBA 蛋白家族成员之一，能够与另一催化亚基KPC1共同形成KPC。KPC2通过其COOH端的UBL结构域可促进p27kip1运输至26S 蛋白酶并对KPC1亚基起到稳定作用；NH2端的UBA结构域可结合多聚范素化蛋白，从而介导p27kip1在G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影响p27kip1蛋白量的表达水平。
研究发现，p27kip1作为一种细胞周期相关性抑制蛋白，在细胞中静息期表达较高，某些刺激因素导致细胞进入增殖期后，其表达就会有明显下降。对这一分子表达量的调节主要发生在转录后水平，KPC2对其有泛素化降解作用。本实验结果显示，SCI后p27kip1的表达先降低后恢复正常，相应时间点KPC2表达则明显增加，二者蛋白表达量存在负相关，说明撞击损伤初期既有熟知的细胞凋亡，还会有相关细胞的增殖修复，才会造成p27kip1蛋白表达下调；修复后期大部分细胞则重新进入G0期，p27kip1蛋白表达则又上升。免疫组织化学结果虽然验证了Western blot实验结果，但免疫组织化学结果只能显示KPC2广泛定位于脊髓灰质和白质中，为了确定KPC2在损伤脊髓后的高表达具体与哪种细胞类型相关，我们运用免疫荧光双标记观察KPC2的细胞定位情况。免疫荧光双标记结果显示在脊髓灰质前角和后角，KPC2与神经元在损伤前后均有共定位；在白质，KPC2与GFAP标记的星形胶质细胞有明显共定位，且在损伤后阳性信号增加，KPC2表达的这种差异主要在白质的胶质细胞中显现。在空间形态上，免疫荧光双标记结果显示损伤3 d左右较对照组星形胶质细胞数目增加、胞体肥大、分支增多交织成网状；GFAP和PCNA在此时有明显的共定位。因此，我们推测SCI激发了细胞周期的进程（G1～S期），造成了星形胶质细胞的活化与增殖。同时检测到增殖指标CyclinA和PCNA表达量在损伤后表达开始逐渐升高，伤后3 d表达量最高，一直维持较高水平至损伤后14 d左右，更验证了这一时期胶质细胞增殖。荧光结果显示KPC2与GFAP、PCNA有明显共定位，且损伤后共定位明显增加。以上结果更加明确了KPC2与SCI后星形胶质细胞的增殖相关。结合既往研究p27kip1和KPC1参与SCI过程的调节，且KPC2能够与催化亚基KPC1共同形成p27kip1的泛素蛋白连接酶复合体，从而介导p27kip1在G0～G1期的多聚泛素化降解，直接影响p27kip1蛋白量的表达水平[12]。在本实验中发现p27kip1在SCI后的确存在着时空表达变化，为了研究KPC2、KPC1和p27kip1之间在损伤后脊髓中存在相互作用，我们运用了免疫共沉淀实验方法，结果表明三者间可互相作用，且在细胞增殖期作用明显增强。以上结果显示KPC2与SCI后星形胶质细胞的增殖相关。为了进一步阐述这一问题，本研究采用新生24 h内SD大鼠脊髓，体外培养原代星形胶质细胞，使用血清饥饿48 h疗法致使细胞同步在G0/G1期，随后加入血清刺激细胞增殖，模拟体内星形胶质细胞受损伤后增殖条件。荧光细胞化学分析法检测示，分离纯化的星形胶质细胞纯度达98.5%。提取细胞蛋白行Western blot检测示，PCNA和KPC2蛋白表达在血清刺激增殖后即开始增加，24 h达峰值，而p27kip1表达则逐渐减少。这一结果进一步验证了大体水平结论的正确性。
综上述，本研究首次报道了KPC2在SCI前后的空间表达变化，指出KPC2依赖的p27kip1泛素化降解过程，可能为SCI后抑制星形胶质细胞的过度活化增殖起到作用，为今后进一步研究p27kip1及其调控分子网络在SCI后胶质细胞增殖、瘢痕形成生理和病理过程中发挥的作用奠定了形态学基础。
