引用本文： 张承昊, 李棋, 唐新, 李箭. 促进腱-骨愈合方法的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(7): 912-916. doi: 10.7507/1002-1892.20150195 复制
腱-骨愈合是决定韧带重建成功与否的重要因素，无论是膝关节交叉韧带、侧副韧带、后外侧复合体重建、肩关节肩袖修复或踝关节韧带重建等，腱-骨愈合程度均直接影响术后康复进程及手术效果。研究表明，除手术失误外，未能达到牢固的腱-骨愈合是韧带重建手术失败的主要原因[1-2]。近年，有关提高腱-骨愈合的研究主要关注于促进肌腱位点的韧带-骨整合方面，包括采用骨膜、生物凝胶、支架、生长因子、干细胞，或其他可促进骨生长或韧带附着点[3]的重建材料。现回顾分析腱-骨愈合过程及促进腱-骨愈合方法的相关研究进展并进行综述。
1 腱-骨愈合过程
正常腱-骨连接位点分为非直接止点及直接止点两类。非直接止点指由较厚的纤维组织直接将肌腱或韧带连接固定至骨膜上，如内侧副韧带胫骨止点。直接止点指通过典型纤维软骨组织将软组织“锚定”于骨深层，其直接嵌入点为一个4层组织的转化区域，包括骨、钙化软骨、非钙化软骨、韧带组织，如前交叉韧带和肩袖[4]。
目前，肌腱或韧带重建手术技术及固定方式等的相关研究旨在达到重建术中肌腱与骨获得最大接触面积，保证接触面间稳定、紧密，使外力影响最小化。当肌腱与骨接触后通过直接或间接腱-骨愈合，形成正常腱-骨界面，建立稳固连接，使重建韧带发挥作用。直接腱-骨愈合是指具有4层结构特点的腱-骨连接，这种结构存在于愈合后肌腱与隧道口间。间接腱-骨愈合是指肌腱和骨之间通过Sharpey样纤维连接，该类愈合时间长，愈合后腱-骨之间抗拉力能力较直接愈合低[5]。
动物实验表明[6]，肌腱植入骨隧道后需经历坏死期、增殖期和韧带化期，才能达到真正愈合。坏死期也称为愈合早期，一般指移植物植入后前4周，该过程中移植物出现坏死，其力学强度显著低于植入时；增殖期指术后第4～12周，移植物出现重塑、再血管化，细胞活性强；韧带化期是指增殖期后至移植物重塑结束，可长达半年至数年。Tabuchi等[7]对植入兔骨隧道的肌腱进行了26周观察，结果显示从术后12周开始含有Ⅲ型胶原纤维的Sharpey样纤维逐渐被Ⅰ型胶原替代，直至第26周时移植物内的纤维与Sharpey样纤维形成连接。在另一个犬实验研究中，重建的前交叉韧带在重建后6个月时腱-骨之间形成的连接比3个月时更规律，并可见“潮线”； 12个月时可见分界清楚的4层结构[8]。
2 促进腱-骨愈合方法
2.1 骨膜
目前，促进腱-骨愈合方法中已用于临床并取得较好效果的是骨膜移植[9-11]。骨膜分为生发层和纤维层，其活性主要来自生发层。生发层内含有丰富的细胞和血管，其中包含多向分化的MSCs。MSCs可向软骨细胞、骨细胞分化，促进骨整合过程。而丰富的血管组织可在移植后促进新血管生长，从而促进腱-骨之间纤维软骨形成。纤维层较厚、细胞含量较少，在促进腱-骨愈合过程中作用较弱，主要参与骨膜的支撑和连接作用[12-13]。
由于骨膜具有很强的成骨能力，因此学者们应用骨膜来促进重建肌腱的腱-骨愈合[14]。相关动物实验结果显示[15-17]，采用骨膜包裹肌腱的方法可促进腱-骨愈合；将该方法临床应用于前交叉韧带重建中，也取得了满意疗效。此外，骨膜具有很强的骨整合能力，主要因为骨膜含有较多的祖细胞且细胞活性高，因此骨膜包裹可加强腱-骨之间连接，促进骨内细胞长入肌腱内，这是腱-骨愈合的重要过程。同时骨膜还起到细胞支架作用，并通过分泌生长因子，如骨膜蛋白[18]，加强肌腱和骨之间黏附过程。骨膜还可合成生长因子，如BMP-2、TGF-β1、IGF-1 等[19-20]，诱导软骨生成，促进血管生长和骨再吸收。
除以上特点外，骨膜还具有取材容易、不易出现炎性反应和排斥反应的优势，是目前用于临床促进腱-骨愈合的最佳方法之一。但是骨膜也存在取材量有限、损伤供区以及骨膜两面活性和结构存在较大差异等缺点，限制了其进一步临床应用。
2.2 材料
由于骨膜的局限性及组织工程和材料工程的发展，促进腱-骨愈合的材料也不断出现。目前材料可分为3类：骨引导材料、可降解支架及其他促进腱-骨愈合的材料。
2.2.1 骨引导材料
骨引导材料中以磷酸钙或磷酸镁类为主[21]。Zhao等[22]分别使用磷酸钙黏合材料及羟基磷灰石促进肩袖损伤愈合，比较发现两种材料均可促进细胞黏附、增殖以及新骨生成，但磷酸钙黏合材料作用更明显。磷酸钙除能直接促进腱-骨愈合，还可促进生长因子分泌，间接促进腱-骨愈合。Weimin等[23]使用复合BMP的注射型磷酸钙黏合材料促进兔重建前交叉韧带愈合，结果显示与未复合BMP的磷酸钙黏合材料相比，其具有更好的骨整合和重建韧带抗拉力效果。有研究报道，以镁为主要成分的骨黏合剂也具有良好的促进骨长入肌腱表面的作用[24]。以磷酸钙或磷酸镁类为主的促进腱-骨愈合材料具有易获得、价格便宜等特点，但还需进一步研究提高其生物适应性，并进行临床试验观察效果。
2.2.2 可降解支架
生物相容性支架或可降解多孔支架是通过在腱-骨之间建立一个适合细胞增殖和分化的环境来促进腱骨细胞附着和长入，如纤维蛋白胶、聚乙醇酸等材料。Wu等[25]研究表明，采用纤维蛋白胶三维培养可促进细胞增殖和分化。Yokoya等[26]研究发现在兔肩袖损伤模型中，使用聚乙醇酸薄片可使肌腱在类似纤维软骨层界面愈合。这类支架在重建的移植物和骨之间建立一个桥梁，促进细胞迁移和增殖，从而在腱-骨愈合处形成一高细胞活性区域，最终达到促进腱-骨愈合的目的。
2.2.3 其他可促进腱-骨愈合的材料
在腱-骨愈合过程中Sharpey纤维起到重要作用，有学者拟通过合成材料模拟该纤维的作用来促进腱-骨愈合。Lovric 等[27]将去矿物质骨基质（demineralized bone matrix，DBM）置于腱-骨界面，将其作为一潜在的释放诱导成骨蛋白的载体促进腱-骨愈合。Kadonishi等[28]将已用于治疗牙周缺损的釉基质衍生物（enamel matrix derivative，EMD）来促进重建的前交叉韧带腱-骨表面愈合，组织学观察发现术后8周时EMD组愈合优于空白组，但12周时两组之间无明显差异； EMD组在8周时最大负载力也明显高于空白组，但12周时该差异显著缩小。因此，此类合成材料能否有效促进腱-骨愈合以及相关远期效果，有待进一步研究明确。
2.3 生长因子及细胞基质
促进腱-骨愈合方法中研究最集中、最深入的是诱导成骨类生长因子，主要包括TGF、BMP、FGF、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、IGF。这些生长因子在促进腱-骨愈合及肌腱修复过程中起到积极作用，并能减少组织的无结构化[29-32]。
Buchmann等[31]在大鼠肩袖修补模型中单独及联合应用了G-CSF、bFGF两种生长因子，结果显示单独应用两种生长因子可促进腱-骨愈合进程，特别是移植物的再血管化；联合应用两种生长因子可同时促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成。Kim等[33]将BMP-2用于重建的兔肩袖腱-骨结合处，组织学观察显示，与未应用生长因子组比较，应用BMP-2后髌骨和髌腱锚钉缝合位点有更多新骨形成，在腱-骨愈合过程中骨纤维软骨组织整合程度也更明显，腱-骨之间断裂的最大负载力也显著提高。Kovacevic等[34]研究发现TGF-β3结合磷酸钙可促进大鼠腱-骨愈合，术后4周重建肩袖抗拉力与空白组或单独使用磷酸钙组比较明显提高，同时重建部位Ⅰ、Ⅲ型胶原比例更合适。但以上研究均为动物实验，目前尚缺少生长因子用于临床韧带与肌腱修复的研究报道。此外，生长因子的应用技术也有待研究明确，包括生长因子载体、释放速度以及应用环境。
因此，学者们选择含细胞基质的材料进行研究，希望通过细胞基质中的生长因子及细胞因子来促进腱-骨愈合进程，如DBM等。Hsu 等[35]将DBM用于兔重建前交叉韧带模型，术后X线片检查示DBM组胫骨隧道内肌腱与空白组相比更小，提示术后隧道扩大程度较轻，为腱-骨愈合提供了更紧密的接触；免疫组织化学染色观察示DBM组分泌更多的BMP-2和VEGF，促进重建前交叉韧带腱-骨愈合。
2.4 富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）
PRP是从自体全血中衍生出的超过生理剂量浓度的血小板，具有促进骨骼、肌腱等组织修复的潜力，它通过提供富含生长因子及其他细胞因子的局部环境来促进组织重建或再生。体外和动物研究发现，PRP可通过提供高浓度的生长因子及细胞因子促进多种细胞迁移和增殖[36-37]。目前，PRP已广泛用于临床各种组织的修复，如骨、软骨、肌腱、肌肉，特别是创伤后的局部环境中，如浅表创面，肌肉、肌腱损伤及骨软骨缺损等[38-40]。
虽然体外及动物研究已证实PRP可促进腱-骨愈合，如PRP可促进犬重建前交叉韧带移植物与骨之间的早期腱-骨愈合，加强连接强度并促进纤维交联成形，提高修复组织代谢活性[41]。但临床研究结果却不甚理想，Zhao等[42]对8篇肩袖修补手术使用PRP的临床随机对照试验文献进行了Meta分析，结果显示使用PRP对修复肩袖的再损伤率及疗效无明显影响。随后，Malavolta等[43]也进行了临床对照研究，比较PRP对肩袖修补手术疗效的影响，结果显示，除12个月时PRP组美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）评分略高于未使用PRP组外，两组其他临床结果，包括Constant评分、疼痛评分、术后MRI等检查及术后再损伤率比较，均无显著差异。
虽然上述文献显示目前临床应用PRP对腱-骨愈合及肌腱修复促进作用尚不理想，但有研究者提出这可能与PRP应用条件、手术方式及相关适应证的选择尚未达最佳有关。Seijas等[44]将PRP注射于重建的前交叉韧带隧道中，MRI检查显示其可加快髌腱移植物的重建。Rha等[45]比较了干针针灸或PRP局部注射治疗小于1 cm的肩袖损伤效果，经随访6周发现PRP组关节疼痛和功能受限程度显著低于干针针灸组。Dallaudière等[46]观察了408例在超声引导下接受PRP注射治疗的肌腱损伤或肌腱炎等肌腱病患者，结果发现所有患者疼痛均显著缓解，关节功能评分均提高。
3 小结及展望
目前，促进腱-骨愈合主要通过两种方式完成，其一为通过改变腱-骨之间局部环境，增加两者之间连接，促进骨中细胞向移植物迁移，为腱-骨愈合提供活性较高的微环境；其二为通过加入具有较高骨整合活性的组织，如骨膜等，来促进腱-骨愈合。目前除骨膜已应用于临床且疗效明确外，其余方法尚无明确结论，有待进一步深入研究。
腱-骨愈合是决定韧带重建成功与否的重要因素，无论是膝关节交叉韧带、侧副韧带、后外侧复合体重建、肩关节肩袖修复或踝关节韧带重建等，腱-骨愈合程度均直接影响术后康复进程及手术效果。研究表明，除手术失误外，未能达到牢固的腱-骨愈合是韧带重建手术失败的主要原因[1-2]。近年，有关提高腱-骨愈合的研究主要关注于促进肌腱位点的韧带-骨整合方面，包括采用骨膜、生物凝胶、支架、生长因子、干细胞，或其他可促进骨生长或韧带附着点[3]的重建材料。现回顾分析腱-骨愈合过程及促进腱-骨愈合方法的相关研究进展并进行综述。
1 腱-骨愈合过程
正常腱-骨连接位点分为非直接止点及直接止点两类。非直接止点指由较厚的纤维组织直接将肌腱或韧带连接固定至骨膜上，如内侧副韧带胫骨止点。直接止点指通过典型纤维软骨组织将软组织“锚定”于骨深层，其直接嵌入点为一个4层组织的转化区域，包括骨、钙化软骨、非钙化软骨、韧带组织，如前交叉韧带和肩袖[4]。
目前，肌腱或韧带重建手术技术及固定方式等的相关研究旨在达到重建术中肌腱与骨获得最大接触面积，保证接触面间稳定、紧密，使外力影响最小化。当肌腱与骨接触后通过直接或间接腱-骨愈合，形成正常腱-骨界面，建立稳固连接，使重建韧带发挥作用。直接腱-骨愈合是指具有4层结构特点的腱-骨连接，这种结构存在于愈合后肌腱与隧道口间。间接腱-骨愈合是指肌腱和骨之间通过Sharpey样纤维连接，该类愈合时间长，愈合后腱-骨之间抗拉力能力较直接愈合低[5]。
动物实验表明[6]，肌腱植入骨隧道后需经历坏死期、增殖期和韧带化期，才能达到真正愈合。坏死期也称为愈合早期，一般指移植物植入后前4周，该过程中移植物出现坏死，其力学强度显著低于植入时；增殖期指术后第4～12周，移植物出现重塑、再血管化，细胞活性强；韧带化期是指增殖期后至移植物重塑结束，可长达半年至数年。Tabuchi等[7]对植入兔骨隧道的肌腱进行了26周观察，结果显示从术后12周开始含有Ⅲ型胶原纤维的Sharpey样纤维逐渐被Ⅰ型胶原替代，直至第26周时移植物内的纤维与Sharpey样纤维形成连接。在另一个犬实验研究中，重建的前交叉韧带在重建后6个月时腱-骨之间形成的连接比3个月时更规律，并可见“潮线”； 12个月时可见分界清楚的4层结构[8]。
2 促进腱-骨愈合方法
2.1 骨膜
目前，促进腱-骨愈合方法中已用于临床并取得较好效果的是骨膜移植[9-11]。骨膜分为生发层和纤维层，其活性主要来自生发层。生发层内含有丰富的细胞和血管，其中包含多向分化的MSCs。MSCs可向软骨细胞、骨细胞分化，促进骨整合过程。而丰富的血管组织可在移植后促进新血管生长，从而促进腱-骨之间纤维软骨形成。纤维层较厚、细胞含量较少，在促进腱-骨愈合过程中作用较弱，主要参与骨膜的支撑和连接作用[12-13]。
由于骨膜具有很强的成骨能力，因此学者们应用骨膜来促进重建肌腱的腱-骨愈合[14]。相关动物实验结果显示[15-17]，采用骨膜包裹肌腱的方法可促进腱-骨愈合；将该方法临床应用于前交叉韧带重建中，也取得了满意疗效。此外，骨膜具有很强的骨整合能力，主要因为骨膜含有较多的祖细胞且细胞活性高，因此骨膜包裹可加强腱-骨之间连接，促进骨内细胞长入肌腱内，这是腱-骨愈合的重要过程。同时骨膜还起到细胞支架作用，并通过分泌生长因子，如骨膜蛋白[18]，加强肌腱和骨之间黏附过程。骨膜还可合成生长因子，如BMP-2、TGF-β1、IGF-1 等[19-20]，诱导软骨生成，促进血管生长和骨再吸收。
除以上特点外，骨膜还具有取材容易、不易出现炎性反应和排斥反应的优势，是目前用于临床促进腱-骨愈合的最佳方法之一。但是骨膜也存在取材量有限、损伤供区以及骨膜两面活性和结构存在较大差异等缺点，限制了其进一步临床应用。
2.2 材料
由于骨膜的局限性及组织工程和材料工程的发展，促进腱-骨愈合的材料也不断出现。目前材料可分为3类：骨引导材料、可降解支架及其他促进腱-骨愈合的材料。
2.2.1 骨引导材料
骨引导材料中以磷酸钙或磷酸镁类为主[21]。Zhao等[22]分别使用磷酸钙黏合材料及羟基磷灰石促进肩袖损伤愈合，比较发现两种材料均可促进细胞黏附、增殖以及新骨生成，但磷酸钙黏合材料作用更明显。磷酸钙除能直接促进腱-骨愈合，还可促进生长因子分泌，间接促进腱-骨愈合。Weimin等[23]使用复合BMP的注射型磷酸钙黏合材料促进兔重建前交叉韧带愈合，结果显示与未复合BMP的磷酸钙黏合材料相比，其具有更好的骨整合和重建韧带抗拉力效果。有研究报道，以镁为主要成分的骨黏合剂也具有良好的促进骨长入肌腱表面的作用[24]。以磷酸钙或磷酸镁类为主的促进腱-骨愈合材料具有易获得、价格便宜等特点，但还需进一步研究提高其生物适应性，并进行临床试验观察效果。
2.2.2 可降解支架
生物相容性支架或可降解多孔支架是通过在腱-骨之间建立一个适合细胞增殖和分化的环境来促进腱骨细胞附着和长入，如纤维蛋白胶、聚乙醇酸等材料。Wu等[25]研究表明，采用纤维蛋白胶三维培养可促进细胞增殖和分化。Yokoya等[26]研究发现在兔肩袖损伤模型中，使用聚乙醇酸薄片可使肌腱在类似纤维软骨层界面愈合。这类支架在重建的移植物和骨之间建立一个桥梁，促进细胞迁移和增殖，从而在腱-骨愈合处形成一高细胞活性区域，最终达到促进腱-骨愈合的目的。
2.2.3 其他可促进腱-骨愈合的材料
在腱-骨愈合过程中Sharpey纤维起到重要作用，有学者拟通过合成材料模拟该纤维的作用来促进腱-骨愈合。Lovric 等[27]将去矿物质骨基质（demineralized bone matrix，DBM）置于腱-骨界面，将其作为一潜在的释放诱导成骨蛋白的载体促进腱-骨愈合。Kadonishi等[28]将已用于治疗牙周缺损的釉基质衍生物（enamel matrix derivative，EMD）来促进重建的前交叉韧带腱-骨表面愈合，组织学观察发现术后8周时EMD组愈合优于空白组，但12周时两组之间无明显差异； EMD组在8周时最大负载力也明显高于空白组，但12周时该差异显著缩小。因此，此类合成材料能否有效促进腱-骨愈合以及相关远期效果，有待进一步研究明确。
2.3 生长因子及细胞基质
促进腱-骨愈合方法中研究最集中、最深入的是诱导成骨类生长因子，主要包括TGF、BMP、FGF、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、IGF。这些生长因子在促进腱-骨愈合及肌腱修复过程中起到积极作用，并能减少组织的无结构化[29-32]。
Buchmann等[31]在大鼠肩袖修补模型中单独及联合应用了G-CSF、bFGF两种生长因子，结果显示单独应用两种生长因子可促进腱-骨愈合进程，特别是移植物的再血管化；联合应用两种生长因子可同时促进Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成。Kim等[33]将BMP-2用于重建的兔肩袖腱-骨结合处，组织学观察显示，与未应用生长因子组比较，应用BMP-2后髌骨和髌腱锚钉缝合位点有更多新骨形成，在腱-骨愈合过程中骨纤维软骨组织整合程度也更明显，腱-骨之间断裂的最大负载力也显著提高。Kovacevic等[34]研究发现TGF-β3结合磷酸钙可促进大鼠腱-骨愈合，术后4周重建肩袖抗拉力与空白组或单独使用磷酸钙组比较明显提高，同时重建部位Ⅰ、Ⅲ型胶原比例更合适。但以上研究均为动物实验，目前尚缺少生长因子用于临床韧带与肌腱修复的研究报道。此外，生长因子的应用技术也有待研究明确，包括生长因子载体、释放速度以及应用环境。
因此，学者们选择含细胞基质的材料进行研究，希望通过细胞基质中的生长因子及细胞因子来促进腱-骨愈合进程，如DBM等。Hsu 等[35]将DBM用于兔重建前交叉韧带模型，术后X线片检查示DBM组胫骨隧道内肌腱与空白组相比更小，提示术后隧道扩大程度较轻，为腱-骨愈合提供了更紧密的接触；免疫组织化学染色观察示DBM组分泌更多的BMP-2和VEGF，促进重建前交叉韧带腱-骨愈合。
2.4 富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）
PRP是从自体全血中衍生出的超过生理剂量浓度的血小板，具有促进骨骼、肌腱等组织修复的潜力，它通过提供富含生长因子及其他细胞因子的局部环境来促进组织重建或再生。体外和动物研究发现，PRP可通过提供高浓度的生长因子及细胞因子促进多种细胞迁移和增殖[36-37]。目前，PRP已广泛用于临床各种组织的修复，如骨、软骨、肌腱、肌肉，特别是创伤后的局部环境中，如浅表创面，肌肉、肌腱损伤及骨软骨缺损等[38-40]。
虽然体外及动物研究已证实PRP可促进腱-骨愈合，如PRP可促进犬重建前交叉韧带移植物与骨之间的早期腱-骨愈合，加强连接强度并促进纤维交联成形，提高修复组织代谢活性[41]。但临床研究结果却不甚理想，Zhao等[42]对8篇肩袖修补手术使用PRP的临床随机对照试验文献进行了Meta分析，结果显示使用PRP对修复肩袖的再损伤率及疗效无明显影响。随后，Malavolta等[43]也进行了临床对照研究，比较PRP对肩袖修补手术疗效的影响，结果显示，除12个月时PRP组美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）评分略高于未使用PRP组外，两组其他临床结果，包括Constant评分、疼痛评分、术后MRI等检查及术后再损伤率比较，均无显著差异。
虽然上述文献显示目前临床应用PRP对腱-骨愈合及肌腱修复促进作用尚不理想，但有研究者提出这可能与PRP应用条件、手术方式及相关适应证的选择尚未达最佳有关。Seijas等[44]将PRP注射于重建的前交叉韧带隧道中，MRI检查显示其可加快髌腱移植物的重建。Rha等[45]比较了干针针灸或PRP局部注射治疗小于1 cm的肩袖损伤效果，经随访6周发现PRP组关节疼痛和功能受限程度显著低于干针针灸组。Dallaudière等[46]观察了408例在超声引导下接受PRP注射治疗的肌腱损伤或肌腱炎等肌腱病患者，结果发现所有患者疼痛均显著缓解，关节功能评分均提高。
3 小结及展望
目前，促进腱-骨愈合主要通过两种方式完成，其一为通过改变腱-骨之间局部环境，增加两者之间连接，促进骨中细胞向移植物迁移，为腱-骨愈合提供活性较高的微环境；其二为通过加入具有较高骨整合活性的组织，如骨膜等，来促进腱-骨愈合。目前除骨膜已应用于临床且疗效明确外，其余方法尚无明确结论，有待进一步深入研究。