引用本文： 张涛, 李文杰, 王峰, 张宇, 徐艾强, 沈忆新. 小鼠室管膜下区神经干细胞增殖及分化研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(6): 766-771. doi: 10.7507/1002-1892.20150164 复制
神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是一类起源于神经外胚层，能不断自我更新，并在一定条件下分化为神经元和胶质细胞的多潜能干细胞。NSCs主要存在于哺乳动物脑部两个区域：侧脑室的室管膜下区（subventricular zone，SVZ）和海马的齿状回颗粒下层（subgranular zone，SGZ）。目前体外NSCs分离培养的研究主要集中于来源SGZ的NSCs，对来源SVZ的NSCs研究相对较少。研究发现，来源于SVZ的NSCs不但具有自我更新和多向分化潜能，还可以沿嘴侧迁移流通路长距离迁移至嗅球，并且在嗅球可以分化为多巴胺能神经元[1-5]。以往对来源SGZ的NSCs研究，主要选取鼠海马组织或整个脑组织进行体外培养，因此含有大量杂细胞[6-10]；并选择血清来诱导NSCs分化，而血清成分比较复杂，可能干扰后期的实验结果。为研究来源SVZ的NSCs增殖、分化机制及为治疗神经系统疾病寻找合适的种子细胞，本次研究特异性选择小鼠SVZ组织作为体外培养NSCs来源，以减少杂细胞干扰；同时采用无生长因子的培养基诱导NSCs分化，排除生长因子对后期研究结果的影响。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF级新生（24 h内）ICR小鼠6只，雌雄不限，体质量2.1～2.5 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司；实验中对动物处置符合动物伦理学要求。
DMEM/F12、Neurobasal、N2、B27、Alexa Fluor 488标记驴抗大鼠IgG、Alexa Fluor 647标记驴抗小鼠IgG（Invitrogen公司，美国）；bFGF、EGF（PeproTech公司，美国）；BrdU、MTT、小鼠抗神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、小鼠抗BrdU（Sigma公司，美国）；大鼠抗巢蛋白（Nestin）（Millipore公司，美国）；山羊抗SOX-2（Santa Cruz公司，美国）；兔抗β-微管蛋白Ⅲ（Tuj-1；Abcam公司，英国）； Cy3偶联的驴抗兔IgG及驴抗山羊IgG（Jackson Immuno Research公司，美国）。
倒置荧光显微镜、激光共聚焦显微镜（Zeiss公司，德国）；体式显微镜（Olympus公司，日本）；酶联免疫检测仪（Tecan公司，奥地利）；TDL-4低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。
1.2 NSCs培养
取新生ICR小鼠，冰上放置至昏迷，剪刀断头。无菌镊打开颅腔取出大脑，D-Hank液浸洗，剥离脑膜和血管。体式显微镜下分离SVZ处组织（图 1），置于4℃预冷的L15基础培养基中，眼科剪剪碎。将混有组织碎片的基础培养基移至15 mL离心管中，加入等体积0.01%胰酶和0.01%EDTA，37℃水浴消化10 min。反复机械吹打，静置后吸除上清并加入双倍体积的10%FBS基础培养基终止消化，吹打制成单细胞悬液。经200目滤网过滤，收集滤液，以离心8 cm，1 000 r/min 离心5 min。弃上清，加入37℃复温的完全培养基[即DMEM/F12和Neurobasal（1∶1），含1%N2、1%B27、20 ng/mL bFGF和20 ng/ mL EGF]，吹打成单细胞悬液并经活细胞计数后，以1×105个 / mL接种于培养皿内；于37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔2 d半量更换培养基。培养7 d待原代克隆形成后，收集细胞液于15 mL离心管中，同上法离心5 min，吸除上清后向离心管中加入2 mL完全培养基，并用移液器轻轻吹打细胞液（注意避免产生气泡）。吹打重悬后接种于完全培养基（细胞密度为1×105 个 / mL），并在37℃、5%CO2培养箱中培养。每隔2 d半量更换培养基，每7天传代1次。培养期间倒置显微镜下观察细胞形态变化。
图1
新生小鼠SVZ示意图 LV：侧脑室
Figure1.
Schematic diagram of SVZ of neonatal mice LV: Lateral ventricle
1.3 NSCs鉴定
取第3代细胞，调整细胞密度，以10倍镜下每视野5～10个神经球接种于含有包被多聚赖氨酸（0.1 g/L）无菌玻片的4孔板中，继续采用完全培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养7 d，期间每隔2 d半量更换培养基。7 d后行免疫荧光细胞化学染色，用4℃预冷的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min。4℃预冷的PHT室温孵育30 min，分别加入大鼠抗Nestin、山羊抗SOX-2（1∶200，所有抗体均用PHT稀释），4℃冰箱内孵育过夜。PBS洗3 次，每次5 min，避光分别加入Alexa Fluor 488 标记的驴抗大鼠IgG、Cy3偶联的驴抗山羊IgG（1∶1 000）。避光室温孵育1 h，DAPI复染细胞核，PBS避光洗涤3次，每次5 min。以PBS代替一抗作为阴性对照。避光下用抗淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察培养的SVZ处细胞是否表达干细胞标志物（Nestin、SOX-2），其中绿色荧光代表Nestin表达阳性，红色荧光表示SOX-2表达阳性，蓝色荧光代表DAPI表达阳性。
1.4 体外培养不同时间NSCs增殖能力检测
1.4.1 BrdU标记法
参照文献[9]方法进行操作。取第3代NSCs制成单细胞悬液（密度1×105 个 / mL），采用完全培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。分别于培养2、6 d取部分细胞接种至含包被多聚赖氨酸无菌玻片的4孔板中，继续培养1 d（即分别培养3、7 d）。然后加入BrdU（终浓度10 µmol/L）共培养4 h后，以4℃预冷的多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次；37℃水浴以2 mol/L HCl 孵育10 min，PBS洗涤3次，每次5 min。4℃预冷的PHT室温孵育30 min，加入小鼠抗BrdU抗体（1∶200），4℃冰箱内孵育过夜。取出4孔板，PBS洗涤3次，每次5 min，避光加入Cy3（1∶1 000），其余步骤同NSCs鉴定。于20倍镜下随机选取15个视野拍照，计数15个视野中BrdU阳性细胞数，比较培养3、7 d BrdU阳性细胞数差异。实验重复3次。
1.4.2 MTT法
参照文献[10]方法进行操作。取第3代NSCs制成单细胞悬液（密度1×105个/mL），接种至96孔板，每孔加入100 µL，采用完全培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。分别于培养3、7 d对NSCs行MTT检测。具体步骤：吸弃上清，加入90 µL新鲜培养基，避光加入10 µL MTT溶液，继续培养4 h后吸弃上清，每孔加入100 µL DMSO，置摇床上低速摇晃15 min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔吸光度（A）值。比较培养3、7 d细胞A值，实验重复3次。
1.5 体外培养不同时间NSCs分化能力检测
取第3代NSCs，以每孔5～10个神经球接种于含有包被多聚赖氨酸无菌玻片的24孔板中，以分化培养基[即DMEM/F12和Neurobasal（1∶1），含1%N2、1%B27]诱导NSCs向神经元、星形胶质细胞分化。于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，每隔2 d更换分化培养基，分别于3、7 d后行细胞免疫荧光染色。一抗分别用大鼠抗Nestin（1∶200）、兔抗Tuj-1（1∶500）、小鼠抗GFAP（1∶500）标记NSCs、神经元和星形胶质细胞，二抗分别用Cy3偶联的驴抗兔IgG、Alexa Fluor 488 标记的驴抗大鼠IgG和Alexa Fluor 647 标记的驴抗小鼠IgG（1∶1 000），并用DAPI复染。其余步骤同NSCs鉴定。
激光共聚焦显微镜下观察NSCs分化情况，其中绿色荧光代表Nestin表达阳性，红色荧光代表Tuj-1（即神经元）表达阳性，蓝色荧光代表GFAP（即星形胶质细胞）表达阳性。于20倍镜下随机选取15个视野，计数Tuj-1、GFAP阳性细胞，并计算阳性细胞百分比，公式：Tuj-1或GFAP阳性细胞数/总细胞数 ×100%。以Tuj-1阳性细胞百分比评价NSCs向神经元分化的能力，GFAP阳性细胞百分比评价NSCs向星形胶质细胞分化的能力。
1.6 统计学方法
采用Graphpad Prism5软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞形态学观察及鉴定
倒置显微镜下观察示，原代培养3 d后可见大量透亮、悬浮生长单细胞，同时出现大量大小均一且呈悬浮生长的“神经球”（图 2 a）；7 d时见大量悬浮生长的“神经球”，且体积较前增大，部分神经球由于体积过大，中心细胞因营养不良呈黑色改变，部分神经球出现融合及贴壁分化现象（图 2 b～d）。体外传代培养后，第3代细胞培养7 d 时可见典型神经球形成，并出现神经球融合及贴壁分化现象（图 2 e、f）。
图2
倒置显微镜下观察体外培养NSCs形态（×100） ⓐ 原代培养3 d 黑色箭头示神经球 白色箭头示单个NSC ⓑ ～ⓓ 原代培养7 d 见悬浮生长神经球、神经球融合及贴壁分化 ⓔ 、 ⓕ 第3代细胞培养7 d 见悬浮生长神经球、神经球融合及贴壁分化 激光共聚焦显微镜下观察示，分离培养的SVZ处细胞Nestin、SOX-2均呈阳性表达，其中Nestin主要表达于细胞质，而SOX-2表达于细胞核。见图 3。
2.2 体外培养不同时间NSCs增殖能力检测
BrdU免疫荧光染色提示BrdU主要表达于处于增殖状态细胞的细胞核（图 4）。体外培养3 d的 NSCs中BrdU阳性细胞数为（75.817±2.961）个，显著高于培养7 d的（56.600±4.881）个，比较差异有统计学意义（t=3.366，P=0.028）。
MTT检测示，体外培养3 d的NSCs A值为0.478±0.025，亦显著高于培养7 d的0.366±0.032，比较差异有统计学意义（t=2.752，P=0.011）。
2.3 体外培养不同时间NSCs分化能力检测
经诱导培养后，NSCs能分化为神经元、星形胶质细胞（图 5）。诱导分化3 d时Tuj-1、GFAP阳性细胞百分比分别为23.1%±3.7%、23.7%±3.8%，显著低于诱导分化7 d的40.1%±3.6%、37.1%±4.5%，比较差异均有统计学意义（t=3.285，P=0.030；t=3.930，P=0.017）。
图5
培养不同时间免疫荧光染色观察NSCs向神经元、星形胶质细胞分化能力（激光共聚焦显微镜×200） 从左至右分别为Tuj-1、GFAP、Nestin、重叠 诱导培养3 d 诱导培养7 d
Figure5.
Comparison of differentiation ability of NSCs cultured in vitro for different cultivation time by anti-Tuj-1 and anti-GFAP immunofluorescence staining (Confocal laser scanning microscopy×200) From the left to the right for Tuj-1,GFAP,Nestin,and the overlay of the three markers respectively Induced differentiation of NSCs for 3 days Induced differentiation of NSCs for 7 days
3 讨论
动物实验表明，NSCs可用于治疗伴不可逆神经元缺失的疾病或由不可逆神经元缺失而引起的疾病，但将其用于临床前仍有许多问题需解决，例如如何有效分离和体外扩增NSCs [11]。目前，NSCs的研究主要集中于来源成年或胚胎时期的干细胞[12-13]，而对新生鼠NSCs，特别是新生小鼠SVZ的NSCs研究较少。因此，本研究选择新生小鼠SVZ作为体外培养NSCs的细胞来源。相对于采用胚胎鼠皮层组织、胚胎或新生小鼠整个脑组织进行体外培养 [14-16]，本研究标本具有定位准确、杂细胞少的优点。
目前主要通过神经球（悬浮培养）法和贴壁培养法体外培养NSCs，其中悬浮培养是NSCs保持其干性的重要条件，主要用于控制神经发生的分子和细胞机制方面研究[17]。因此，本研究在细胞培养、传代以及比较不同体外培养时间NSCs的增殖能力时，均尽量保持NSCs的悬浮生长；而在比较NSCs分化能力时则尽量促进NSCs的贴壁分化。为了提高实验的客观性，本研究选取了两个干细胞的特异性标志物：Nestin和SOX-2。Nestin作为NSCs的标志物，被定义为第6类中间丝蛋白[18]。Nestin在未分化的中枢神经系统、正常成年中枢系统以及中枢神经系统肿瘤细胞中都有表达，有研究提示其在增生的内皮祖细胞中也有表达[19]。SOX-2是一种高迁移率组DNA结合蛋白，在鼠发育各个阶段的多能NSCs，特别是在神经发生区如SVZ和SGZ处NSCs中都有表达[20-25]。我们发现，分离培养的SVZ处细胞表达神经干细胞的标志物Nestin、SOX-2，提示体外分离培养的细胞为NSCs。
以往对于新生大鼠NSCs的研究，多偏向于探讨如何促进NSCs向神经元分化，而对于NSCs增殖能力的研究较少[7-8]。本研究对体外培养不同时间NSCs 的分化及增殖能力均进行了观察。通过比较体外培养3、7 d时NSCs增殖及分化能力发现，与体外培养7 d相比，3 d时NSCs增殖能力较强，但向神经元和星形胶质细胞分化的能力较弱。我们分析原因可能是随着培养时间延长，由于NSCs可以自我增殖，细胞数量不断增多，而NSCs生长具有一定浓度依赖性，过高的细胞浓度可导致较大的神经球形成及神经球之间的融合，神经球中央细胞由于缺乏营养物质而呈黑色改变，甚至发生凋亡。此外NSCs数量增多也可增加细胞贴壁几率，从而使更多的NSCs及由NSCs形成的神经球发生贴壁分化。
脊髓损伤病程中胶质瘢痕的形成常常阻碍了损伤后神经轴突的再生，而星形胶质细胞在胶质瘢痕的形成中起着重要作用，因此在移植NSCs治疗脊髓损伤时的研究中，如何促进移植的NSCs向神经元分化，并抑制其向星形胶质细胞的分化，进而减少脊髓损伤后胶质瘢痕的形成，一直是研究热点。我们发现相对于体外培养3 d NSCs，7 d时NSCs向神经元及星形胶质细胞分化的能力较强，这一结果为以后探索NSCs向神经元分化的具体机制提供了线索，也为移植NSCs治疗小鼠脊髓损伤提供了重要参考。此外本研究主要比较了不同体外培养时间NSCs向神经元及星形胶质细胞分化能力的差别，而未研究NSCs具体向何种类型的神经元分化。因此NSCs向神经元分化的潜在调节机制，以及NSCs具体分化为何种类型的神经元将是下一步研究重点。
综上所述，本研究建立了稳定的新生小鼠SVZ的NSCs体外分离、培养和鉴定体系，初步证实了新生小鼠SVZ细胞在体外进行分离后可高效培养成NSCs，同时研究了不同体外培养时间SVZ 的NSCs增殖、分化能力，为进一步探索NSCs的增殖、分化机制，以及为以后应用NSCs治疗神经系统疾病提供了参考。
神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是一类起源于神经外胚层，能不断自我更新，并在一定条件下分化为神经元和胶质细胞的多潜能干细胞。NSCs主要存在于哺乳动物脑部两个区域：侧脑室的室管膜下区（subventricular zone，SVZ）和海马的齿状回颗粒下层（subgranular zone，SGZ）。目前体外NSCs分离培养的研究主要集中于来源SGZ的NSCs，对来源SVZ的NSCs研究相对较少。研究发现，来源于SVZ的NSCs不但具有自我更新和多向分化潜能，还可以沿嘴侧迁移流通路长距离迁移至嗅球，并且在嗅球可以分化为多巴胺能神经元[1-5]。以往对来源SGZ的NSCs研究，主要选取鼠海马组织或整个脑组织进行体外培养，因此含有大量杂细胞[6-10]；并选择血清来诱导NSCs分化，而血清成分比较复杂，可能干扰后期的实验结果。为研究来源SVZ的NSCs增殖、分化机制及为治疗神经系统疾病寻找合适的种子细胞，本次研究特异性选择小鼠SVZ组织作为体外培养NSCs来源，以减少杂细胞干扰；同时采用无生长因子的培养基诱导NSCs分化，排除生长因子对后期研究结果的影响。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
SPF级新生（24 h内）ICR小鼠6只，雌雄不限，体质量2.1～2.5 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司；实验中对动物处置符合动物伦理学要求。
DMEM/F12、Neurobasal、N2、B27、Alexa Fluor 488标记驴抗大鼠IgG、Alexa Fluor 647标记驴抗小鼠IgG（Invitrogen公司，美国）；bFGF、EGF（PeproTech公司，美国）；BrdU、MTT、小鼠抗神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、小鼠抗BrdU（Sigma公司，美国）；大鼠抗巢蛋白（Nestin）（Millipore公司，美国）；山羊抗SOX-2（Santa Cruz公司，美国）；兔抗β-微管蛋白Ⅲ（Tuj-1；Abcam公司，英国）； Cy3偶联的驴抗兔IgG及驴抗山羊IgG（Jackson Immuno Research公司，美国）。
倒置荧光显微镜、激光共聚焦显微镜（Zeiss公司，德国）；体式显微镜（Olympus公司，日本）；酶联免疫检测仪（Tecan公司，奥地利）；TDL-4低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。
1.2 NSCs培养
取新生ICR小鼠，冰上放置至昏迷，剪刀断头。无菌镊打开颅腔取出大脑，D-Hank液浸洗，剥离脑膜和血管。体式显微镜下分离SVZ处组织（图 1），置于4℃预冷的L15基础培养基中，眼科剪剪碎。将混有组织碎片的基础培养基移至15 mL离心管中，加入等体积0.01%胰酶和0.01%EDTA，37℃水浴消化10 min。反复机械吹打，静置后吸除上清并加入双倍体积的10%FBS基础培养基终止消化，吹打制成单细胞悬液。经200目滤网过滤，收集滤液，以离心8 cm，1 000 r/min 离心5 min。弃上清，加入37℃复温的完全培养基[即DMEM/F12和Neurobasal（1∶1），含1%N2、1%B27、20 ng/mL bFGF和20 ng/ mL EGF]，吹打成单细胞悬液并经活细胞计数后，以1×105个 / mL接种于培养皿内；于37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔2 d半量更换培养基。培养7 d待原代克隆形成后，收集细胞液于15 mL离心管中，同上法离心5 min，吸除上清后向离心管中加入2 mL完全培养基，并用移液器轻轻吹打细胞液（注意避免产生气泡）。吹打重悬后接种于完全培养基（细胞密度为1×105 个 / mL），并在37℃、5%CO2培养箱中培养。每隔2 d半量更换培养基，每7天传代1次。培养期间倒置显微镜下观察细胞形态变化。
图1
新生小鼠SVZ示意图 LV：侧脑室
Figure1.
Schematic diagram of SVZ of neonatal mice LV: Lateral ventricle
1.3 NSCs鉴定
取第3代细胞，调整细胞密度，以10倍镜下每视野5～10个神经球接种于含有包被多聚赖氨酸（0.1 g/L）无菌玻片的4孔板中，继续采用完全培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养7 d，期间每隔2 d半量更换培养基。7 d后行免疫荧光细胞化学染色，用4℃预冷的多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min。4℃预冷的PHT室温孵育30 min，分别加入大鼠抗Nestin、山羊抗SOX-2（1∶200，所有抗体均用PHT稀释），4℃冰箱内孵育过夜。PBS洗3 次，每次5 min，避光分别加入Alexa Fluor 488 标记的驴抗大鼠IgG、Cy3偶联的驴抗山羊IgG（1∶1 000）。避光室温孵育1 h，DAPI复染细胞核，PBS避光洗涤3次，每次5 min。以PBS代替一抗作为阴性对照。避光下用抗淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察培养的SVZ处细胞是否表达干细胞标志物（Nestin、SOX-2），其中绿色荧光代表Nestin表达阳性，红色荧光表示SOX-2表达阳性，蓝色荧光代表DAPI表达阳性。
1.4 体外培养不同时间NSCs增殖能力检测
1.4.1 BrdU标记法
参照文献[9]方法进行操作。取第3代NSCs制成单细胞悬液（密度1×105 个 / mL），采用完全培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。分别于培养2、6 d取部分细胞接种至含包被多聚赖氨酸无菌玻片的4孔板中，继续培养1 d（即分别培养3、7 d）。然后加入BrdU（终浓度10 µmol/L）共培养4 h后，以4℃预冷的多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次；37℃水浴以2 mol/L HCl 孵育10 min，PBS洗涤3次，每次5 min。4℃预冷的PHT室温孵育30 min，加入小鼠抗BrdU抗体（1∶200），4℃冰箱内孵育过夜。取出4孔板，PBS洗涤3次，每次5 min，避光加入Cy3（1∶1 000），其余步骤同NSCs鉴定。于20倍镜下随机选取15个视野拍照，计数15个视野中BrdU阳性细胞数，比较培养3、7 d BrdU阳性细胞数差异。实验重复3次。
1.4.2 MTT法
参照文献[10]方法进行操作。取第3代NSCs制成单细胞悬液（密度1×105个/mL），接种至96孔板，每孔加入100 µL，采用完全培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。分别于培养3、7 d对NSCs行MTT检测。具体步骤：吸弃上清，加入90 µL新鲜培养基，避光加入10 µL MTT溶液，继续培养4 h后吸弃上清，每孔加入100 µL DMSO，置摇床上低速摇晃15 min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔吸光度（A）值。比较培养3、7 d细胞A值，实验重复3次。
1.5 体外培养不同时间NSCs分化能力检测
取第3代NSCs，以每孔5～10个神经球接种于含有包被多聚赖氨酸无菌玻片的24孔板中，以分化培养基[即DMEM/F12和Neurobasal（1∶1），含1%N2、1%B27]诱导NSCs向神经元、星形胶质细胞分化。于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，每隔2 d更换分化培养基，分别于3、7 d后行细胞免疫荧光染色。一抗分别用大鼠抗Nestin（1∶200）、兔抗Tuj-1（1∶500）、小鼠抗GFAP（1∶500）标记NSCs、神经元和星形胶质细胞，二抗分别用Cy3偶联的驴抗兔IgG、Alexa Fluor 488 标记的驴抗大鼠IgG和Alexa Fluor 647 标记的驴抗小鼠IgG（1∶1 000），并用DAPI复染。其余步骤同NSCs鉴定。
激光共聚焦显微镜下观察NSCs分化情况，其中绿色荧光代表Nestin表达阳性，红色荧光代表Tuj-1（即神经元）表达阳性，蓝色荧光代表GFAP（即星形胶质细胞）表达阳性。于20倍镜下随机选取15个视野，计数Tuj-1、GFAP阳性细胞，并计算阳性细胞百分比，公式：Tuj-1或GFAP阳性细胞数/总细胞数 ×100%。以Tuj-1阳性细胞百分比评价NSCs向神经元分化的能力，GFAP阳性细胞百分比评价NSCs向星形胶质细胞分化的能力。
1.6 统计学方法
采用Graphpad Prism5软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞形态学观察及鉴定
倒置显微镜下观察示，原代培养3 d后可见大量透亮、悬浮生长单细胞，同时出现大量大小均一且呈悬浮生长的“神经球”（图 2 a）；7 d时见大量悬浮生长的“神经球”，且体积较前增大，部分神经球由于体积过大，中心细胞因营养不良呈黑色改变，部分神经球出现融合及贴壁分化现象（图 2 b～d）。体外传代培养后，第3代细胞培养7 d 时可见典型神经球形成，并出现神经球融合及贴壁分化现象（图 2 e、f）。
图2
倒置显微镜下观察体外培养NSCs形态（×100） ⓐ 原代培养3 d 黑色箭头示神经球 白色箭头示单个NSC ⓑ ～ⓓ 原代培养7 d 见悬浮生长神经球、神经球融合及贴壁分化 ⓔ 、 ⓕ 第3代细胞培养7 d 见悬浮生长神经球、神经球融合及贴壁分化 激光共聚焦显微镜下观察示，分离培养的SVZ处细胞Nestin、SOX-2均呈阳性表达，其中Nestin主要表达于细胞质，而SOX-2表达于细胞核。见图 3。
2.2 体外培养不同时间NSCs增殖能力检测
BrdU免疫荧光染色提示BrdU主要表达于处于增殖状态细胞的细胞核（图 4）。体外培养3 d的 NSCs中BrdU阳性细胞数为（75.817±2.961）个，显著高于培养7 d的（56.600±4.881）个，比较差异有统计学意义（t=3.366，P=0.028）。
MTT检测示，体外培养3 d的NSCs A值为0.478±0.025，亦显著高于培养7 d的0.366±0.032，比较差异有统计学意义（t=2.752，P=0.011）。
2.3 体外培养不同时间NSCs分化能力检测
经诱导培养后，NSCs能分化为神经元、星形胶质细胞（图 5）。诱导分化3 d时Tuj-1、GFAP阳性细胞百分比分别为23.1%±3.7%、23.7%±3.8%，显著低于诱导分化7 d的40.1%±3.6%、37.1%±4.5%，比较差异均有统计学意义（t=3.285，P=0.030；t=3.930，P=0.017）。
图5
培养不同时间免疫荧光染色观察NSCs向神经元、星形胶质细胞分化能力（激光共聚焦显微镜×200） 从左至右分别为Tuj-1、GFAP、Nestin、重叠 诱导培养3 d 诱导培养7 d
Figure5.
Comparison of differentiation ability of NSCs cultured in vitro for different cultivation time by anti-Tuj-1 and anti-GFAP immunofluorescence staining (Confocal laser scanning microscopy×200) From the left to the right for Tuj-1,GFAP,Nestin,and the overlay of the three markers respectively Induced differentiation of NSCs for 3 days Induced differentiation of NSCs for 7 days
3 讨论
动物实验表明，NSCs可用于治疗伴不可逆神经元缺失的疾病或由不可逆神经元缺失而引起的疾病，但将其用于临床前仍有许多问题需解决，例如如何有效分离和体外扩增NSCs [11]。目前，NSCs的研究主要集中于来源成年或胚胎时期的干细胞[12-13]，而对新生鼠NSCs，特别是新生小鼠SVZ的NSCs研究较少。因此，本研究选择新生小鼠SVZ作为体外培养NSCs的细胞来源。相对于采用胚胎鼠皮层组织、胚胎或新生小鼠整个脑组织进行体外培养 [14-16]，本研究标本具有定位准确、杂细胞少的优点。
目前主要通过神经球（悬浮培养）法和贴壁培养法体外培养NSCs，其中悬浮培养是NSCs保持其干性的重要条件，主要用于控制神经发生的分子和细胞机制方面研究[17]。因此，本研究在细胞培养、传代以及比较不同体外培养时间NSCs的增殖能力时，均尽量保持NSCs的悬浮生长；而在比较NSCs分化能力时则尽量促进NSCs的贴壁分化。为了提高实验的客观性，本研究选取了两个干细胞的特异性标志物：Nestin和SOX-2。Nestin作为NSCs的标志物，被定义为第6类中间丝蛋白[18]。Nestin在未分化的中枢神经系统、正常成年中枢系统以及中枢神经系统肿瘤细胞中都有表达，有研究提示其在增生的内皮祖细胞中也有表达[19]。SOX-2是一种高迁移率组DNA结合蛋白，在鼠发育各个阶段的多能NSCs，特别是在神经发生区如SVZ和SGZ处NSCs中都有表达[20-25]。我们发现，分离培养的SVZ处细胞表达神经干细胞的标志物Nestin、SOX-2，提示体外分离培养的细胞为NSCs。
以往对于新生大鼠NSCs的研究，多偏向于探讨如何促进NSCs向神经元分化，而对于NSCs增殖能力的研究较少[7-8]。本研究对体外培养不同时间NSCs 的分化及增殖能力均进行了观察。通过比较体外培养3、7 d时NSCs增殖及分化能力发现，与体外培养7 d相比，3 d时NSCs增殖能力较强，但向神经元和星形胶质细胞分化的能力较弱。我们分析原因可能是随着培养时间延长，由于NSCs可以自我增殖，细胞数量不断增多，而NSCs生长具有一定浓度依赖性，过高的细胞浓度可导致较大的神经球形成及神经球之间的融合，神经球中央细胞由于缺乏营养物质而呈黑色改变，甚至发生凋亡。此外NSCs数量增多也可增加细胞贴壁几率，从而使更多的NSCs及由NSCs形成的神经球发生贴壁分化。
脊髓损伤病程中胶质瘢痕的形成常常阻碍了损伤后神经轴突的再生，而星形胶质细胞在胶质瘢痕的形成中起着重要作用，因此在移植NSCs治疗脊髓损伤时的研究中，如何促进移植的NSCs向神经元分化，并抑制其向星形胶质细胞的分化，进而减少脊髓损伤后胶质瘢痕的形成，一直是研究热点。我们发现相对于体外培养3 d NSCs，7 d时NSCs向神经元及星形胶质细胞分化的能力较强，这一结果为以后探索NSCs向神经元分化的具体机制提供了线索，也为移植NSCs治疗小鼠脊髓损伤提供了重要参考。此外本研究主要比较了不同体外培养时间NSCs向神经元及星形胶质细胞分化能力的差别，而未研究NSCs具体向何种类型的神经元分化。因此NSCs向神经元分化的潜在调节机制，以及NSCs具体分化为何种类型的神经元将是下一步研究重点。
综上所述，本研究建立了稳定的新生小鼠SVZ的NSCs体外分离、培养和鉴定体系，初步证实了新生小鼠SVZ细胞在体外进行分离后可高效培养成NSCs，同时研究了不同体外培养时间SVZ 的NSCs增殖、分化能力，为进一步探索NSCs的增殖、分化机制，以及为以后应用NSCs治疗神经系统疾病提供了参考。
