引用本文： 段鑫, 李伟, 项舟. 组织工程骨血管生成的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(2): 239-244. doi: 10.7507/1002-1892.20150050 复制
大段骨缺损修复是临床难题，自体骨移植是骨缺损修复的金标准，但来源有限，且增加患者痛苦，尤其大段骨缺损修复中自体骨来源明显受限[1]。近年来，随着细胞基因技术和组织工程技术的发展，组织工程骨修复大段骨缺损研究也不断深入。组织工程骨在体内存活的关键在于实现血管化、保证充足血供[2]，因此研发有效的血管化组织工程骨是目前亟待解决的问题。
在骨折修复过程中新生血管的形成早于成骨修复作用，目前普遍认为毛细血管在新骨形成中起重要作用，如在软骨和骨痂形成新的微循环，同时带入成骨细胞，形成新骨[3-4]。传统的组织工程骨复合物由于缺乏血供，常发生骨中心坏死和移植失败。还有研究发现，移植入体内的种子细胞只能靠周围血管弥散获取营养，死亡率极高，且体外培养的细胞-载体复合物很难培养出较厚的骨组织[5-6]。近年来，血管生成种子细胞与成骨种子细胞共培养体系在血管生成和骨再生中的作用愈发得到重视，而诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）和基因修饰技术的融入更是为组织工程骨血管化研究提供了新方向[7]。本文广泛查阅近年关于种子细胞在组织工程骨血管化中的研究进展，从种子细胞来源、生物学特性、转变机制、相关细胞因子及信号通路等方面对组织工程骨血管生成进行综述。
1 血管生成种子细胞
血管生成是一个多因素、多环节作用过程，涉及一系列细胞和细胞因子信号网络，主要包括两种方式：血管发生和血管新生。前者是指中胚层内由内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分化成血管内皮细胞（endothelial cells，ECs），形成原始血管网；后者是指以出芽方式从已存在的血管中长出新的毛细血管[8-9]。目前有较多研究针对组织工程骨血管生成，其经典模式是构建种子细胞-细胞因子-支架材料复合物植入体内，以达到促进成骨和血管生成的目的。
1.1 ECs
ECs在骨形成和修复过程中起着重要作用，ECs本身及产生的细胞因子等物质直接或间接参与了这一过程。ECs直接参与血管生成，且和成骨细胞关系密切，因此它在骨血管化过程中起着举足轻重的作用。ECs和成骨细胞共培养体系是常见的血管化组织工程骨构建基础，ECs可同时促进成骨细胞和破骨细胞及它们的前体细胞活化、分化及成熟，即其在加强成骨作用同时亦可能促进骨吸收，目前大多数研究认为其主要起着积极的促成骨作用[10-11]。ECs主要分为大血管来源和微血管来源，前者包括人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）、隐静脉、主动脉等，后者则从肺微血管、脂肪、真皮获得。有研究将MSCs体外扩增并接种于微载体上，与ECs和/或成骨细胞共培养，发现ECs与成骨细胞1∶1混合后再与MSCs共培养能检测到更多血管形成、骨形成标志物[12]。Ren等[13]将MSCs与HUVECs共植入一种仿生诱导膜，发现其在动物体内具有血管新生快、吻合好、成骨潜能佳的优点。研究显示复合了ECs的组织工程骨修复骨缺损效果优于单纯组织工程骨。Kaigler等[14]发现，单独移植MSCs的骨形成量显著少于ECs和MSCs共移植，认为ECs能直接作用于MSCs诱导成骨。ECs在VEGF诱导下可高表达BMP-2及BMP-4，而BMP-2对MSCs分化成骨具有促进作用[15-16]。Wenger等[17]将HUVECs种植于三维胶原支架材料上生长形成类球体，然后将人的成骨细胞直接接种于类球体的内皮细胞团上，结果观察到两种细胞在类球体内部形成了特殊的空间结构，且在VEGF及bFGF联合作用下ECs可形成明显的毛细血管结构；同时研究还发现，与成骨细胞共培养似乎抑制了ECs形成血管的能力，具体原因及机制仍需进一步研究。
1.2 EPCs
由于ECs体外培养要求高，在缺乏细胞因子和细胞外基质的条件下极易老化和死亡，大规模扩增难度大。能够定向分化为ECs的EPCs，因其强大的增殖和全能分化潜能，有望替代ECs成为首选的血管化种子细胞[18-19]。
EPCs是ECs的前体细胞，主要存在于成体骨髓中，在某些特定情况下可被动员至外周血，富集在血管新生部位，增殖分化为ECs，参与血管再生[20]。除骨髓外，EPCs也可来源于脐带血、脂肪组织和外周血等，脐带血分离EPCs过程中因易受污染、分离存活率低、伦理道德尚存争议，故应用受限；骨髓和脂肪来源EPCs数量有限且取材困难，应用均有一定困难；故目前多取材于外周血。Li等[21]发现，与 MSCs共培养的EPCs较单独培养EPCs的ALP活性和磷酸钙结节生成量均显著增多，且骨生成和血管新生的标志物表达更多。Keramaris等[22]通过荟萃分析表明，在适当条件下EPCs和MSCs共培养有助于骨形成和血管形成。Seebach等[23]分别采用VEGF和MSCs、EPCs和MSCs混合进行体外实验，EPCs和MSCs混合组显示出强劲的血管新生能力。研究显示在使用含有EPCs/MSCs的磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）和仅含有EPCs的TCP修复大块骨缺损时，术后4周两组均有骨生成，8周EPCs/MSCs组骨桥接形成显著多于EPCs组，提示EPCs和MSCs在骨血管化早期发挥协同作用[24]。
1.3 胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）及iPS
ESCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，研究发现ESCs能够定向分化为ECs参与血管生成，但其基因组不稳定、极易导致染色体畸变及肿瘤发生，故应用受限[25-26]。iPS是采用基因转染技术将多能相关性基因导入宿主细胞（如成纤维细胞），诱导其“初始化”，成为与ESCs类似的细胞，再生医学致力于采用自体成体细胞构建iPS，再定向诱导分化为ECs参与组织工程骨的血管生成。NF-κB信号通路在维持ESCs和iPS的未分化状态中起重要作用。Takase等[27]发现NF-κB基因敲除的iPS无法诱导其发生初始化，成为类ESCs细胞。Ho等[28]在小鼠体内发现iPS重新编程的逐级过程受Wnt和Tcfs信号通路调控。Gong等[29]发现核小体组装蛋白Nap1/1在iPS自我更新和定向分化中起着重要作用，这与Notch信号通路的传导活动密不可分。此外，iPS和ESCs分化为ECs以及后续成血管过程还涉及MAPK、Hedgehog和VEGF等多条信号传导通路[30-31]。iPS具有增殖能力强、分化潜能大、无免疫排斥反应和伦理道德争议等优点，但其安全性和有效性仍待进一步研究[32]。
2 促血管化细胞因子及相关信号通路
2.1 VEGF
VEGF是血管形成的关键因子，主要作用于血管化早期，以ECs为靶细胞，促进原始血管网形成[33]。Jabbarzadeh等[34]采用转染了腺病毒编码的VEGF脂肪源性MSCs联合ECs与三维聚乳酸乙醇酸支架材料复合诱导移植物的血管化，结果显示生物材料内部有新生血管形成。VEGF/VEGF受体（VEGF receptor，VEGFR）信号通路在血管生成中起着重要作用，VEGF与VEGFR结合后形成二聚体并迅速刺激络氨酸磷酸化，激活ERK和PI3K等细胞酶联反应，诱导血管内皮金属蛋白酶、凝血酶及整合素表达，并参与ECs抗凋亡机制调节，促进新的血管生成并维持其完整性[35-37]。Koç等[38]将人成骨细胞接种于采用腺病毒载体编码VEGF结合的多孔壳聚糖/羟基磷灰石支架，发现其具有较好的组织相容性，并且能够使ECs富集于骨损伤部位，成骨和成血管效果均显著加强。Ferretti等[39]通过体外实验发现，采用VEGF刺激骨膜衍生祖细胞（periosteum-derived progenitor cells，PDPCs）结合ECs在成血管方面能够取得更好的效果，认为这可能与多变的MAPK和PI3K/Akt信号通路有关。同时，Zhang等[40]将BMSCs与ECs共培养时，BMSCs可能通过PI3K/Akt调控VEGF因子参与活化的VEGFR1/2，进而影响ECs生物学活性，在成骨和成血管中起着重要作用。
2.2 血管生成素（angiopoietins，Ang）
Ang 表达于内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等多种细胞，主要作用于血管改建、塑形，促进血管网成熟。研究发现当VEGF成血管通路被阻断后，Ang-1和Ang-2的表达水平将会大量增加，成为血管生成的后备通路[41]。Ang-1与受体Tie-2结合后可促使络氨酸磷酸化，通过信号级联反应增强内皮细胞抗凋亡能力，维持新生血管稳定。此外，还有实验检测到Ang-1/Tie-2信号轴的增强能够上调ECs的VEGF表达水平，其与Notch信号通路密切相关[42-43]。Hou等[44]通过腺病毒基因修饰上调人BMSCs的VEGF和Ang-1表达水平，发现其成骨和成血管作用显著增强。
2.3 FGF
FGF以ECs在内的多种细胞为靶细胞，既能促进ECs分裂，又能趋化ECs，具有强烈的促进血管生成作用[45]。Wenger等[17]通过构建成骨细胞-H UV ECs胶原支架三维模型发现，VEGF和bFGF可以增强ECs血管生成效率。FGF主要与VEGF形成共同信号通路，发挥促血管生成作用，其表达还受Notch信号通路调节，研究发现伴随着Notch信号通路活性水平的上调，VEGF水平和毛细血管形成水平显著上升[46-47]。Gothard等[48]提出目前组织工程骨构建的重点是获取高效安全的体内材料，而联合活性因子 FGF、PDGF、BMP-2、BMP-7/成骨蛋白1、 VEGF的生物材料是今后研究热点。
2.4 BMP
BMP属于TGF-β家族成员，可通过诱导VEGF等细胞因子的生成，间接促进血管化。它还能通过iPS分化为成软骨细胞和成骨细胞，促进骨生成，同时还可上调VEGF表达，促进血管生成[49-50]。荟萃分析表明，MSCs、ECs联合BMP构建的组织工程骨具有较高的成血管作用[48]。骨折局部的ECs在机械作用、VEGF、缺氧环境等情况下可高表达BMP-2及BMP-4，从而刺激成骨细胞分化参与骨折修复，ECs可以促进MSCs向成骨源性细胞分化，其主要机制可能是ECs分泌的BMP-2对MSCs起调控分化作用[14-15]。有研究者将BMP-2转染MSCs复合可降解生物支架材料用于骨缺损的血管化研究，结果表明结合BMP-2基因转染能够上调VEGF的表达，间接诱导移植物血管化，增加种子细胞活力，从而加速新骨形成[51]。
3 种子细胞-细胞因子-支架材料体系促进血管化
血管形成是一个复杂过程，供血系统在骨修复、再生过程中具有重要意义，骨生成和血管化相辅相成，血管系统为成骨提供必需的营养物质并参与代谢物质转运，其中有多种细胞因子的参与，因此大量研究将细胞因子、种子细胞联合接种于支架材料上，以期优化血管形成的效率。最常见的共培养组合包括：ECs和成骨细胞、ECs和MSCs、EPCs和MSCs、EPCs和成骨细胞。近年来，大量研究对共培养体系的细胞浓度、接种顺序、培养基成分、培养条件等进行探索，取得了可喜成果。Guerrero等[52]将MSCs和EPCs共培养体系接种于添加VEGF等细胞因子的普鲁兰多糖-葡聚糖支架，发现体外模型能够上调成骨标志物（ALP、Runx2、骨钙素、BMP-2）、成血管标志物（CD31、VEGF-R2）和缝隙连接蛋白Connexin-43的表达水平；且体内实验也表明细胞共培养支架复合物植入动物后，实验组较对照组有更多类骨质形成。近年来，纳米技术的不断进展使其在组织工程中的应用也日益广泛。Liu等[53]和Kim等[54]分别在纳米纤维支架上接种MSCs-ECs-VEGF-TGF-β和MSCs-UVECs-VEGF细胞共培养体系，均获良好成血管效果。利用纳米技术、显微制造技术和计算机辅助设计、制造技术在体外合成血管化组织工程骨，或可成为组织工程骨血管化发展的一个新方向[55-56]。随着基因工程技术的发展，骨组织工程血管化研究中引用基因转染技术，将具有显著成骨及促血管分化作用的细胞因子外源基因通过病毒或非病毒载体导入种子细胞，使其在细胞的增殖分化过程中稳定表达并发挥促成骨和促血管生成作用。目前，VEGF和Ang-1双基因转染成为国内外研究热点，Klopper等[57]将同时编码VEGF和Ang-1的腺病毒载体转染MSCs，结果显示其可加速EPCs增殖，接种于人工骨支架材料后对兔跟腱缺损修复疗效也较好。
4 显微外科技术增效
将显微外科和组织工程骨构建相结合，可通过局部转移和显微外科血管吻合的方法，在建立新生骨组织的同时提供充足血供，主要包括血管术植入、血管蒂筋膜包裹术和带肌肉骨瓣等手段[58]。研究发现，采用鼠隐血管术植入能够显著促进局部血管生成和骨生成[59]。Viateau等[60]将中空的复合MSCs的珊瑚陶瓷植入大鼠大腿肌袋中，分离股动静脉将其植入支架材料的管道内，发现血管束植入明显促进了细胞-材料复合物的血管化及成骨能力。Ren等[59]采用干细胞、支架材料、生长因子以及动静脉环构建大块血管化组织工程骨皮瓣，用显微外科技术植入骨缺损部位，修复效果良好，进一步证实了该项技术应用于大块骨缺损修复的可行性。
5 展望
血管化是目前骨组织工程面临的最大难题，现有方法均存在一定不足。以显微外科技术为基础的方法最为接近临床应用，但无论是血管术植入，还是血管蒂筋膜包裹都可能增加手术次数和感染风险，且血管来源有限，不适于临床推广应用。由于ECs体外培养要求高，在缺乏细胞因子和细胞外基质的条件下极易老化和死亡，故现有研究多采用EPCs定向分化为ECs实现血管生成，但离临床应用仍有距离。细胞因子若直接应用极易降解，效果不佳；若采用基因转染则可实现细胞因子的持续高表达，但又涉及一系列信号网络；虽有研究采用支架材料来控制细胞因子释放速率，但对于最佳剂量和释放时间均有待进一步研究。
iPS具有多向分化能力，在不同诱导条件下能分化为骨细胞、软骨细胞，在VEGF诱导下还可向ECs分化，可以考虑将其作为骨生成和血管生成共同的种子细胞，探索出合理的诱导条件，使其定向分化为内皮细胞和骨细胞，以达到成骨、成血管目的。此外，VEGF和Ang-1双转染自体EPCs与MSCs共培养，可促进MSCs向ECs分化，MSCs分泌的细胞因子再反过来促进EPCs增殖以及血管形成，也将有可能成为实现组织工程骨血管化的方法之一。
总之，要实现更为复杂、真正的血管化组织工程骨还任重道远，基于种子细胞在组织工程骨血管化中的研究可为实现这一目标奠定坚实基础。
大段骨缺损修复是临床难题，自体骨移植是骨缺损修复的金标准，但来源有限，且增加患者痛苦，尤其大段骨缺损修复中自体骨来源明显受限[1]。近年来，随着细胞基因技术和组织工程技术的发展，组织工程骨修复大段骨缺损研究也不断深入。组织工程骨在体内存活的关键在于实现血管化、保证充足血供[2]，因此研发有效的血管化组织工程骨是目前亟待解决的问题。
在骨折修复过程中新生血管的形成早于成骨修复作用，目前普遍认为毛细血管在新骨形成中起重要作用，如在软骨和骨痂形成新的微循环，同时带入成骨细胞，形成新骨[3-4]。传统的组织工程骨复合物由于缺乏血供，常发生骨中心坏死和移植失败。还有研究发现，移植入体内的种子细胞只能靠周围血管弥散获取营养，死亡率极高，且体外培养的细胞-载体复合物很难培养出较厚的骨组织[5-6]。近年来，血管生成种子细胞与成骨种子细胞共培养体系在血管生成和骨再生中的作用愈发得到重视，而诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）和基因修饰技术的融入更是为组织工程骨血管化研究提供了新方向[7]。本文广泛查阅近年关于种子细胞在组织工程骨血管化中的研究进展，从种子细胞来源、生物学特性、转变机制、相关细胞因子及信号通路等方面对组织工程骨血管生成进行综述。
1 血管生成种子细胞
血管生成是一个多因素、多环节作用过程，涉及一系列细胞和细胞因子信号网络，主要包括两种方式：血管发生和血管新生。前者是指中胚层内由内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分化成血管内皮细胞（endothelial cells，ECs），形成原始血管网；后者是指以出芽方式从已存在的血管中长出新的毛细血管[8-9]。目前有较多研究针对组织工程骨血管生成，其经典模式是构建种子细胞-细胞因子-支架材料复合物植入体内，以达到促进成骨和血管生成的目的。
1.1 ECs
ECs在骨形成和修复过程中起着重要作用，ECs本身及产生的细胞因子等物质直接或间接参与了这一过程。ECs直接参与血管生成，且和成骨细胞关系密切，因此它在骨血管化过程中起着举足轻重的作用。ECs和成骨细胞共培养体系是常见的血管化组织工程骨构建基础，ECs可同时促进成骨细胞和破骨细胞及它们的前体细胞活化、分化及成熟，即其在加强成骨作用同时亦可能促进骨吸收，目前大多数研究认为其主要起着积极的促成骨作用[10-11]。ECs主要分为大血管来源和微血管来源，前者包括人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）、隐静脉、主动脉等，后者则从肺微血管、脂肪、真皮获得。有研究将MSCs体外扩增并接种于微载体上，与ECs和/或成骨细胞共培养，发现ECs与成骨细胞1∶1混合后再与MSCs共培养能检测到更多血管形成、骨形成标志物[12]。Ren等[13]将MSCs与HUVECs共植入一种仿生诱导膜，发现其在动物体内具有血管新生快、吻合好、成骨潜能佳的优点。研究显示复合了ECs的组织工程骨修复骨缺损效果优于单纯组织工程骨。Kaigler等[14]发现，单独移植MSCs的骨形成量显著少于ECs和MSCs共移植，认为ECs能直接作用于MSCs诱导成骨。ECs在VEGF诱导下可高表达BMP-2及BMP-4，而BMP-2对MSCs分化成骨具有促进作用[15-16]。Wenger等[17]将HUVECs种植于三维胶原支架材料上生长形成类球体，然后将人的成骨细胞直接接种于类球体的内皮细胞团上，结果观察到两种细胞在类球体内部形成了特殊的空间结构，且在VEGF及bFGF联合作用下ECs可形成明显的毛细血管结构；同时研究还发现，与成骨细胞共培养似乎抑制了ECs形成血管的能力，具体原因及机制仍需进一步研究。
1.2 EPCs
由于ECs体外培养要求高，在缺乏细胞因子和细胞外基质的条件下极易老化和死亡，大规模扩增难度大。能够定向分化为ECs的EPCs，因其强大的增殖和全能分化潜能，有望替代ECs成为首选的血管化种子细胞[18-19]。
EPCs是ECs的前体细胞，主要存在于成体骨髓中，在某些特定情况下可被动员至外周血，富集在血管新生部位，增殖分化为ECs，参与血管再生[20]。除骨髓外，EPCs也可来源于脐带血、脂肪组织和外周血等，脐带血分离EPCs过程中因易受污染、分离存活率低、伦理道德尚存争议，故应用受限；骨髓和脂肪来源EPCs数量有限且取材困难，应用均有一定困难；故目前多取材于外周血。Li等[21]发现，与 MSCs共培养的EPCs较单独培养EPCs的ALP活性和磷酸钙结节生成量均显著增多，且骨生成和血管新生的标志物表达更多。Keramaris等[22]通过荟萃分析表明，在适当条件下EPCs和MSCs共培养有助于骨形成和血管形成。Seebach等[23]分别采用VEGF和MSCs、EPCs和MSCs混合进行体外实验，EPCs和MSCs混合组显示出强劲的血管新生能力。研究显示在使用含有EPCs/MSCs的磷酸三钙（tricalcium phosphate，TCP）和仅含有EPCs的TCP修复大块骨缺损时，术后4周两组均有骨生成，8周EPCs/MSCs组骨桥接形成显著多于EPCs组，提示EPCs和MSCs在骨血管化早期发挥协同作用[24]。
1.3 胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）及iPS
ESCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，研究发现ESCs能够定向分化为ECs参与血管生成，但其基因组不稳定、极易导致染色体畸变及肿瘤发生，故应用受限[25-26]。iPS是采用基因转染技术将多能相关性基因导入宿主细胞（如成纤维细胞），诱导其“初始化”，成为与ESCs类似的细胞，再生医学致力于采用自体成体细胞构建iPS，再定向诱导分化为ECs参与组织工程骨的血管生成。NF-κB信号通路在维持ESCs和iPS的未分化状态中起重要作用。Takase等[27]发现NF-κB基因敲除的iPS无法诱导其发生初始化，成为类ESCs细胞。Ho等[28]在小鼠体内发现iPS重新编程的逐级过程受Wnt和Tcfs信号通路调控。Gong等[29]发现核小体组装蛋白Nap1/1在iPS自我更新和定向分化中起着重要作用，这与Notch信号通路的传导活动密不可分。此外，iPS和ESCs分化为ECs以及后续成血管过程还涉及MAPK、Hedgehog和VEGF等多条信号传导通路[30-31]。iPS具有增殖能力强、分化潜能大、无免疫排斥反应和伦理道德争议等优点，但其安全性和有效性仍待进一步研究[32]。
2 促血管化细胞因子及相关信号通路
2.1 VEGF
VEGF是血管形成的关键因子，主要作用于血管化早期，以ECs为靶细胞，促进原始血管网形成[33]。Jabbarzadeh等[34]采用转染了腺病毒编码的VEGF脂肪源性MSCs联合ECs与三维聚乳酸乙醇酸支架材料复合诱导移植物的血管化，结果显示生物材料内部有新生血管形成。VEGF/VEGF受体（VEGF receptor，VEGFR）信号通路在血管生成中起着重要作用，VEGF与VEGFR结合后形成二聚体并迅速刺激络氨酸磷酸化，激活ERK和PI3K等细胞酶联反应，诱导血管内皮金属蛋白酶、凝血酶及整合素表达，并参与ECs抗凋亡机制调节，促进新的血管生成并维持其完整性[35-37]。Koç等[38]将人成骨细胞接种于采用腺病毒载体编码VEGF结合的多孔壳聚糖/羟基磷灰石支架，发现其具有较好的组织相容性，并且能够使ECs富集于骨损伤部位，成骨和成血管效果均显著加强。Ferretti等[39]通过体外实验发现，采用VEGF刺激骨膜衍生祖细胞（periosteum-derived progenitor cells，PDPCs）结合ECs在成血管方面能够取得更好的效果，认为这可能与多变的MAPK和PI3K/Akt信号通路有关。同时，Zhang等[40]将BMSCs与ECs共培养时，BMSCs可能通过PI3K/Akt调控VEGF因子参与活化的VEGFR1/2，进而影响ECs生物学活性，在成骨和成血管中起着重要作用。
2.2 血管生成素（angiopoietins，Ang）
Ang 表达于内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等多种细胞，主要作用于血管改建、塑形，促进血管网成熟。研究发现当VEGF成血管通路被阻断后，Ang-1和Ang-2的表达水平将会大量增加，成为血管生成的后备通路[41]。Ang-1与受体Tie-2结合后可促使络氨酸磷酸化，通过信号级联反应增强内皮细胞抗凋亡能力，维持新生血管稳定。此外，还有实验检测到Ang-1/Tie-2信号轴的增强能够上调ECs的VEGF表达水平，其与Notch信号通路密切相关[42-43]。Hou等[44]通过腺病毒基因修饰上调人BMSCs的VEGF和Ang-1表达水平，发现其成骨和成血管作用显著增强。
2.3 FGF
FGF以ECs在内的多种细胞为靶细胞，既能促进ECs分裂，又能趋化ECs，具有强烈的促进血管生成作用[45]。Wenger等[17]通过构建成骨细胞-H UV ECs胶原支架三维模型发现，VEGF和bFGF可以增强ECs血管生成效率。FGF主要与VEGF形成共同信号通路，发挥促血管生成作用，其表达还受Notch信号通路调节，研究发现伴随着Notch信号通路活性水平的上调，VEGF水平和毛细血管形成水平显著上升[46-47]。Gothard等[48]提出目前组织工程骨构建的重点是获取高效安全的体内材料，而联合活性因子 FGF、PDGF、BMP-2、BMP-7/成骨蛋白1、 VEGF的生物材料是今后研究热点。
2.4 BMP
BMP属于TGF-β家族成员，可通过诱导VEGF等细胞因子的生成，间接促进血管化。它还能通过iPS分化为成软骨细胞和成骨细胞，促进骨生成，同时还可上调VEGF表达，促进血管生成[49-50]。荟萃分析表明，MSCs、ECs联合BMP构建的组织工程骨具有较高的成血管作用[48]。骨折局部的ECs在机械作用、VEGF、缺氧环境等情况下可高表达BMP-2及BMP-4，从而刺激成骨细胞分化参与骨折修复，ECs可以促进MSCs向成骨源性细胞分化，其主要机制可能是ECs分泌的BMP-2对MSCs起调控分化作用[14-15]。有研究者将BMP-2转染MSCs复合可降解生物支架材料用于骨缺损的血管化研究，结果表明结合BMP-2基因转染能够上调VEGF的表达，间接诱导移植物血管化，增加种子细胞活力，从而加速新骨形成[51]。
3 种子细胞-细胞因子-支架材料体系促进血管化
血管形成是一个复杂过程，供血系统在骨修复、再生过程中具有重要意义，骨生成和血管化相辅相成，血管系统为成骨提供必需的营养物质并参与代谢物质转运，其中有多种细胞因子的参与，因此大量研究将细胞因子、种子细胞联合接种于支架材料上，以期优化血管形成的效率。最常见的共培养组合包括：ECs和成骨细胞、ECs和MSCs、EPCs和MSCs、EPCs和成骨细胞。近年来，大量研究对共培养体系的细胞浓度、接种顺序、培养基成分、培养条件等进行探索，取得了可喜成果。Guerrero等[52]将MSCs和EPCs共培养体系接种于添加VEGF等细胞因子的普鲁兰多糖-葡聚糖支架，发现体外模型能够上调成骨标志物（ALP、Runx2、骨钙素、BMP-2）、成血管标志物（CD31、VEGF-R2）和缝隙连接蛋白Connexin-43的表达水平；且体内实验也表明细胞共培养支架复合物植入动物后，实验组较对照组有更多类骨质形成。近年来，纳米技术的不断进展使其在组织工程中的应用也日益广泛。Liu等[53]和Kim等[54]分别在纳米纤维支架上接种MSCs-ECs-VEGF-TGF-β和MSCs-UVECs-VEGF细胞共培养体系，均获良好成血管效果。利用纳米技术、显微制造技术和计算机辅助设计、制造技术在体外合成血管化组织工程骨，或可成为组织工程骨血管化发展的一个新方向[55-56]。随着基因工程技术的发展，骨组织工程血管化研究中引用基因转染技术，将具有显著成骨及促血管分化作用的细胞因子外源基因通过病毒或非病毒载体导入种子细胞，使其在细胞的增殖分化过程中稳定表达并发挥促成骨和促血管生成作用。目前，VEGF和Ang-1双基因转染成为国内外研究热点，Klopper等[57]将同时编码VEGF和Ang-1的腺病毒载体转染MSCs，结果显示其可加速EPCs增殖，接种于人工骨支架材料后对兔跟腱缺损修复疗效也较好。
4 显微外科技术增效
将显微外科和组织工程骨构建相结合，可通过局部转移和显微外科血管吻合的方法，在建立新生骨组织的同时提供充足血供，主要包括血管术植入、血管蒂筋膜包裹术和带肌肉骨瓣等手段[58]。研究发现，采用鼠隐血管术植入能够显著促进局部血管生成和骨生成[59]。Viateau等[60]将中空的复合MSCs的珊瑚陶瓷植入大鼠大腿肌袋中，分离股动静脉将其植入支架材料的管道内，发现血管束植入明显促进了细胞-材料复合物的血管化及成骨能力。Ren等[59]采用干细胞、支架材料、生长因子以及动静脉环构建大块血管化组织工程骨皮瓣，用显微外科技术植入骨缺损部位，修复效果良好，进一步证实了该项技术应用于大块骨缺损修复的可行性。
5 展望
血管化是目前骨组织工程面临的最大难题，现有方法均存在一定不足。以显微外科技术为基础的方法最为接近临床应用，但无论是血管术植入，还是血管蒂筋膜包裹都可能增加手术次数和感染风险，且血管来源有限，不适于临床推广应用。由于ECs体外培养要求高，在缺乏细胞因子和细胞外基质的条件下极易老化和死亡，故现有研究多采用EPCs定向分化为ECs实现血管生成，但离临床应用仍有距离。细胞因子若直接应用极易降解，效果不佳；若采用基因转染则可实现细胞因子的持续高表达，但又涉及一系列信号网络；虽有研究采用支架材料来控制细胞因子释放速率，但对于最佳剂量和释放时间均有待进一步研究。
iPS具有多向分化能力，在不同诱导条件下能分化为骨细胞、软骨细胞，在VEGF诱导下还可向ECs分化，可以考虑将其作为骨生成和血管生成共同的种子细胞，探索出合理的诱导条件，使其定向分化为内皮细胞和骨细胞，以达到成骨、成血管目的。此外，VEGF和Ang-1双转染自体EPCs与MSCs共培养，可促进MSCs向ECs分化，MSCs分泌的细胞因子再反过来促进EPCs增殖以及血管形成，也将有可能成为实现组织工程骨血管化的方法之一。
总之，要实现更为复杂、真正的血管化组织工程骨还任重道远，基于种子细胞在组织工程骨血管化中的研究可为实现这一目标奠定坚实基础。