引用本文： 王茜, 张辉, 耿丽鑫, 李琪佳, 甘洪全, 王辉, 毕成, 王志强. MG63细胞与国产多孔钽材料共培养后成骨相关因子的表达研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(11): 1422-1427. doi: 10.7507/1002-1892.20140306 复制
近年来，越来越多骨移植替代材料进入医疗领域，金属材料因具有高强度、高硬度、韧性好及抗疲劳性高等优势得到广泛应用[1]。其中多孔钽材料化学稳定性好，为三维立体结构，力学性能与正常骨组织相近，具备良好的生物相容性[2-5]，有利于成骨细胞黏附生长，促进骨长入[6-7]，是目前最佳的金属假体材料。目前应用较多的是美国Zimmer公司生产的多孔钽金属材料，价格较昂贵，国内难以广泛应用。为此，重庆润泽医疗器械有限公司联合国内多家科研机构，采用粉末浇注高温煅烧工艺技术成功制备了多孔钽材料。
Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx-2）、骨钙素（osteocalcin，OC）是成骨相关的重要因子，纤维连接蛋白（fibronectin，FN）与细胞黏附关系密切[8-11]。本实验将国产多孔钽材料与人成骨样细胞MG63细胞共培养，观察细胞在该材料上增殖、黏附情况，以及成骨因子Runx-2、OC、FN在多孔钽浸提液和多孔钽支架不同培养环境下表达的变化情况，探讨国产多孔钽材料作为骨组织工程支架的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验材料及主要试剂、仪器
MG63细胞（中国医学科学院基础医学研究所北京协和细胞资源中心）。多孔钽材料（重庆润泽医疗器械有限公司），外观呈深灰色，表面光滑，表面及横断面可见均匀分布的蜂窝状、针尖大小孔隙（图 1 a）；扫描电镜观察示材料表面及断面可见直径为20～50 μm的微粒，微粒间均匀分布直径400～600 μm的微孔结构，孔隙率65%～80%，孔隙间呈相互连通的网状结构（图 1 b、c）。将其制备成直径15 mm、厚3 mm的圆柱形薄片，高压灭菌备用。
图1
多孔钽材料形貌观察 ⓐ大体观察ⓑ扫描电镜观察微孔结构（×200）ⓒ扫描电镜观察微粒大小及孔隙（×1 000） 图 2 MG63细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100）ⓐ原代培养3 d ⓑ第3代细胞培养3 d 图 3 MG63细胞ALP染色鉴定（×200） 图 4 培养各时间点A组细胞-材料复合物扫描电镜观察（×500）ⓐ 3 d ⓑ 5 d ⓒ7 d
Figure1.
Appearance of porous tantalum ⓐGeneral observation ⓑ SEM observation of the microporous structure (×200) ⓒ SEM observation of the microscope particle and pore size (×1 000) Fig. 2 MG63 cells morphological observation (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ Primary cells at 3 days after culture ⓑ The 3rd generation cells at 3 days after culture Fig. 3 Alkaline phosphatase staining of MG63 cells (×200) Fig. 4 SEM observation of cells-scaffolds in group A at different time (×500) ⓐ At 3 days ⓑ At 5 days ⓒ At 7 days
MEM培养液、胰蛋白酶、EDTA、FBS（GIBCO公司，美国）；兔抗人Runx-2多克隆抗体、超敏ECL化学发光试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；兔抗人OC多克隆抗体、兔抗人FN单克隆抗体（Abgent公司，美国）；PV两步法免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；预染蛋白Marker（天津灏洋生物制品科技有限公司）；ALP检测试剂盒（南京建成生物制品有限公司）。倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；Leica1600硬组织切片机（Leica公司，德国）；JSM-6030LV扫描电镜（电子株式会社，日本）；激光扫描共聚焦显微镜（Olympus公司，日本）；Bio-Rad 680酶标仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 MG63细胞培养及鉴定
取MG63细胞复苏后加入含10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的MEM培养基培养，37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱内静置培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。2～3 d换液1次，待细胞生长融合至80%时进行传代。取生长状态良好的第3代细胞，接种于预置无菌盖玻片的12孔板内，7 d后行ALP染色鉴定。
1.3 多孔钽浸提液制备
取高压灭菌后的多孔钽材料，根据GB/TISO10993-5：2009医疗器械生物学评价[12]方法制备多孔钽浸提液，置于37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱内72 h后备用。
1.4 实验分组及方法
取生长状态良好的第3代MG63细胞，生长至80%融合后，加0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min，以离心半径8 cm、800 r/min离心10 min，弃上清并计数。将实验分为3组，A组为多孔钽材料组，B组为多孔钽浸提液组，C组为对照组。A组取高压灭菌的多孔钽材料，用MEM培养液浸润24 h后置于24孔板内；取25μL细胞悬液以浓度为1 ×106 个/mL滴加至多孔钽材料表面，于37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱内静置2 h后，将材料翻转，向另一面滴加相同浓度细胞悬液25 μL，相同条件静置2 h后，将负载细胞的材料转入一新孔中，加入1 mL MEM培养液继续培养。于原孔中加0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min后收集细胞，计数，计算出附着于材料上的细胞数为2×104个。B组于每孔中直接接种2 ×104个MG63细胞，加多孔钽浸提液1 mL；C组于每孔中直接接种2×104个MG63细胞，加MEM培养液1 mL。3组培养板均置于37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱内培养，隔天换液1次，连续培养7 d。
1.5 观测指标
1.5.1 扫描电镜观察
培养3、5、7 d取出A组细胞-材料复合物，PBS冲洗，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥、喷金，扫描电镜观察细胞在多孔钽材料上的生长情况。
1.5.2 免疫组织化学染色观察
培养5 d取3组细胞，常规消化传代，取第4代细胞计数，以1×106个/mL密度接种于预置无菌盖玻片的6孔板内；常规培养细胞至70%融合后，按照PV两步法免疫组织化学试剂盒操作说明测定Runx-2、OC和FN的表达量。具体步骤：取出细胞爬片，PBS洗3次，每次3 min；4%多聚甲醛固定30 min；0.5%Triton X-100滴加至盖玻片上，室温作用20 min；3%H2O2阻断20 min，PBS洗3次；细胞爬片分别加入兔抗人Runx-2多克隆抗体（1:100）、兔抗人OC多克隆抗体（1:100）、兔抗人FN单克隆抗体（1:200），4℃过夜；PBS洗涤，滴加二抗，室温孵育40 min；PBS洗涤，DAB显色，脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察。各组每个放大倍数随机选13张图片，采用Image Pro-Plus图像分析软件测定吸光度（A）值，取均值。
1.5.3 Western blot检测
培养5 d收集3组细胞，加入细胞裂解液裂解，提取蛋白定量后，加入4 ×样本缓冲液，95℃变性5 min。取20μg样品在SDS-PAGE上电泳，电转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入兔抗人Runx-2多克隆抗体（1:100）、兔抗人OC多克隆抗体（1:100）、兔抗人FN单克隆抗体（1:200），4℃过夜，PBS洗涤3次，每次10 min；加辣根过氧化物酶标记的二抗（1:2 000），室温孵育2 h；PBS洗涤3次，加入ECL化学发光试剂后放入暗盒中压片并依次显影、固定，并用其配套软件分析实验结果。以Runx-2、OC、FN与β-actin比值表示相应蛋白表达量。
1.6 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MG63细胞形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜下观察原代细胞接种后为透亮球形，贴壁生长并呈梭形及多角形，细胞质向外伸展形成突起；3 d后细胞快速生长体积增大，相互连结（图 2 a）；5 d后细胞生长融合至80%～90%，细胞成片生长，细胞形态不易区分。第3代细胞形态趋于单一化，呈长梭形或多角形（图 2 b）；ALP染色呈阳性（图 3）。
2.2 细胞-材料复合物扫描电镜观察
扫描电镜观察示，培养3 d细胞在材料表面及孔隙内黏附生长，细胞排列较稀疏，突起少；5 d，相邻细胞互相连接成片状，覆盖材料表面及孔隙内壁；7 d，细胞分泌大量细胞外基质，覆盖大部分材料表面。见图 4。
2.3 免疫组织化学染色观察
各组细胞均有不同程度Runx-2、OC和FN表达，细胞质中均可见棕黄色颗粒，其中A组细胞质深染，表达较其余2组明显。见图 5。定量分析显示，A组Runx-2、OC表达量显著高于B、C组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组间差异无统计学意义（P > 0.05）。A组FN表达量高于B、C组，B组高于C组，但3组间比较差异无统计学意义（F=1.943，P=0.158）。见表 1。
图5
培养5 d各组免疫组织化学染色观察（×200）ⓐ A组Runx-2 ⓑ B组Runx-2 ⓒ C组Runx-2 ⓓ A组OC ⓔ B组OC ⓕ C组OC ⓖ A组FN ⓗ B组FN ⓘ C组FN
Figure5.
Immunohistochemical staining observation of 3 groups at 5 days after culture (×200) ⓐ Runx-2 in group A ⓑ Runx-2 in group B ⓒ Runx-2 in group C ⓓ OC in group A ⓔOC in group B ⓕ OC in group C ⓖ FN in group A ⓗ FN in group B ⓘ FN in group C
表1
免疫组织化学染色检测培养5 d各组Runx-2、OC及FN表达量（n=13，2.4 Western blot检测
A组Runx-2、OC蛋白表达量明显高于B、C组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组间差异无统计学意义（P > 0.05）。3组FN蛋白表达量比较差异均无统计学意义（F=0.173，P=0.842）。见图 6、表 2。
图6
Western blot检测培养5 d各组Runx-2、OC和FN蛋白表达 1：C组2：B组3：A组
Figure6.
Western blot detection for protein expressions of Runx-2, OC, and FN at 5 days after culture 1: Group C 2: Group B 3: Group A
表2
Western blot检测培养5 d各组Runx-2、OC及FN蛋白表达量（n=11，3 讨论
有文献报道，金属材料的三维结构有利于成骨细胞黏附、生长，可增强植入材料与骨间连接，促进骨长入；同时有利于营养物质在植入材料的运输，促进骨再生；而且成骨细胞可沿三维多孔结构的孔隙生长，使植入物与骨间更加稳固[13-14]。本研究采用的多孔钽材料是经粉末浇注高温煅烧技术制备，呈三维立体结构，大体观察多孔钽深灰色表面上可见针尖大小蜂窝状孔隙，孔隙率达65%～80%。扫描电镜观察可见多孔钽材料表面及断面有直径20～50 μm的微粒，微粒间有直径400～600μm的微孔结构，且微粒间孔隙呈相互连通的网状结构。多孔钽的纳米微孔结构可对成骨细胞增殖起重要影响，其粗糙的表面能吸附大分子，影响细胞增殖、黏附和成骨能力。有报道钽还可促进成骨细胞Ⅰ型胶原等的表达[15]。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，可经历细胞增殖、细胞外基质成熟和矿化等阶段，最终调控骨形成。细胞与支架复合培养是检测支架材料生物相容性的最敏感方法[16]，MG63细胞是一种广泛应用于组织工程研究的种子细胞。细胞与多孔支架复合培养后，支架的三维结构可加快营养物质交换，促进骨长入[17]。本研究中，扫描电镜发现MG63细胞与国产多孔钽材料共培养后，细胞随时间延长逐步长入材料孔隙中，并分泌大量基质，细胞伸出伪足，相互连结并最终覆盖材料表面，提示国产多孔钽的三维立体材料有利于细胞的黏附、增殖，促进骨长入。
多孔钽材料在骨诱导和促进骨再生方面表现优异[6, 18]，但具体机制尚不明确。Runx-2是BMP蛋白家族下游的一个重要调节因子，属于Runx家族，是成骨细胞的特异转录因子，在骨再生过程中发挥重要作用，可参与多种成骨分化因子的调控[19]。Runx-2能上调成骨细胞中的相关基因使其定向分化，有研究提示Runx-2基因敲除小鼠在膜内无法成骨，表明Runx-2可影响成骨[8]。OC是成骨细胞分化和成熟的标志，能直接反映骨形成速度，在细胞外基质矿化过程中发挥重要调节作用，可通过测定OC的表达来评价成骨情况[9]。OC还可与羟基磷灰石中的Ca2+结合，吸引与骨矿化有关的相关蛋白，在骨形成和矿化中发挥重要作用[20]。FN是一种具备多种生物学性能的高分子糖蛋白，是重要的细胞黏附因子，参与成骨细胞的增殖、成骨过程，主要功能是介导细胞黏着，在细胞粘连、形态维持方面起重要作用，可诱导Ⅰ型胶原表达，并促进细胞贴壁时间和融合时间[8, 21]。
本研究采用免疫组织化学染色和Western blot法检测各组Runx-2、OC和FN的表达情况，结果发现各组Runx-2、OC和FN均呈阳性表达。A组与B组比较，Runx-2、OC阳性细胞细胞质染色深，定量分析表达量差异有统计学意义；Western blot结果也提示A组Runx-2、OC蛋白高表达。而B组Runx-2、OC表达与C组比较差异无统计学意义，提示多孔钽的三维结构可能通过上调节成骨特异转录因子Runx-2，进而影响成骨，造成OC表达升高，与前期报道一致[5]。同时，通过对FN免疫组织化学染色和Western blot结果分析，发现3组蛋白表达量呈C、B、A组依次增高的趋势，但差异均无统计学意义。提示在本实验条件下，可能存在FN因子的激活，但表达影响并不明显，具体原因有待进一步研究分析。
综上述，国产多孔钽材料具备良好的三维立体结构，有利于成骨细胞黏附、增殖，并可影响成骨转录因子Runx-2、OC的表达，促进骨长入，可用作骨组织工程支架材料。但本研究缺少其他金属材料作为阳性对照，将在下一步研究中完善。
近年来，越来越多骨移植替代材料进入医疗领域，金属材料因具有高强度、高硬度、韧性好及抗疲劳性高等优势得到广泛应用[1]。其中多孔钽材料化学稳定性好，为三维立体结构，力学性能与正常骨组织相近，具备良好的生物相容性[2-5]，有利于成骨细胞黏附生长，促进骨长入[6-7]，是目前最佳的金属假体材料。目前应用较多的是美国Zimmer公司生产的多孔钽金属材料，价格较昂贵，国内难以广泛应用。为此，重庆润泽医疗器械有限公司联合国内多家科研机构，采用粉末浇注高温煅烧工艺技术成功制备了多孔钽材料。
Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx-2）、骨钙素（osteocalcin，OC）是成骨相关的重要因子，纤维连接蛋白（fibronectin，FN）与细胞黏附关系密切[8-11]。本实验将国产多孔钽材料与人成骨样细胞MG63细胞共培养，观察细胞在该材料上增殖、黏附情况，以及成骨因子Runx-2、OC、FN在多孔钽浸提液和多孔钽支架不同培养环境下表达的变化情况，探讨国产多孔钽材料作为骨组织工程支架的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验材料及主要试剂、仪器
MG63细胞（中国医学科学院基础医学研究所北京协和细胞资源中心）。多孔钽材料（重庆润泽医疗器械有限公司），外观呈深灰色，表面光滑，表面及横断面可见均匀分布的蜂窝状、针尖大小孔隙（图 1 a）；扫描电镜观察示材料表面及断面可见直径为20～50 μm的微粒，微粒间均匀分布直径400～600 μm的微孔结构，孔隙率65%～80%，孔隙间呈相互连通的网状结构（图 1 b、c）。将其制备成直径15 mm、厚3 mm的圆柱形薄片，高压灭菌备用。
图1
多孔钽材料形貌观察 ⓐ大体观察ⓑ扫描电镜观察微孔结构（×200）ⓒ扫描电镜观察微粒大小及孔隙（×1 000） 图 2 MG63细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100）ⓐ原代培养3 d ⓑ第3代细胞培养3 d 图 3 MG63细胞ALP染色鉴定（×200） 图 4 培养各时间点A组细胞-材料复合物扫描电镜观察（×500）ⓐ 3 d ⓑ 5 d ⓒ7 d
Figure1.
Appearance of porous tantalum ⓐGeneral observation ⓑ SEM observation of the microporous structure (×200) ⓒ SEM observation of the microscope particle and pore size (×1 000) Fig. 2 MG63 cells morphological observation (Inverted phase contrast microscope×100) ⓐ Primary cells at 3 days after culture ⓑ The 3rd generation cells at 3 days after culture Fig. 3 Alkaline phosphatase staining of MG63 cells (×200) Fig. 4 SEM observation of cells-scaffolds in group A at different time (×500) ⓐ At 3 days ⓑ At 5 days ⓒ At 7 days
MEM培养液、胰蛋白酶、EDTA、FBS（GIBCO公司，美国）；兔抗人Runx-2多克隆抗体、超敏ECL化学发光试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；兔抗人OC多克隆抗体、兔抗人FN单克隆抗体（Abgent公司，美国）；PV两步法免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；预染蛋白Marker（天津灏洋生物制品科技有限公司）；ALP检测试剂盒（南京建成生物制品有限公司）。倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；Leica1600硬组织切片机（Leica公司，德国）；JSM-6030LV扫描电镜（电子株式会社，日本）；激光扫描共聚焦显微镜（Olympus公司，日本）；Bio-Rad 680酶标仪（Bio-Rad公司，美国）。
1.2 MG63细胞培养及鉴定
取MG63细胞复苏后加入含10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的MEM培养基培养，37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱内静置培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。2～3 d换液1次，待细胞生长融合至80%时进行传代。取生长状态良好的第3代细胞，接种于预置无菌盖玻片的12孔板内，7 d后行ALP染色鉴定。
1.3 多孔钽浸提液制备
取高压灭菌后的多孔钽材料，根据GB/TISO10993-5：2009医疗器械生物学评价[12]方法制备多孔钽浸提液，置于37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱内72 h后备用。
1.4 实验分组及方法
取生长状态良好的第3代MG63细胞，生长至80%融合后，加0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min，以离心半径8 cm、800 r/min离心10 min，弃上清并计数。将实验分为3组，A组为多孔钽材料组，B组为多孔钽浸提液组，C组为对照组。A组取高压灭菌的多孔钽材料，用MEM培养液浸润24 h后置于24孔板内；取25μL细胞悬液以浓度为1 ×106 个/mL滴加至多孔钽材料表面，于37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱内静置2 h后，将材料翻转，向另一面滴加相同浓度细胞悬液25 μL，相同条件静置2 h后，将负载细胞的材料转入一新孔中，加入1 mL MEM培养液继续培养。于原孔中加0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min后收集细胞，计数，计算出附着于材料上的细胞数为2×104个。B组于每孔中直接接种2 ×104个MG63细胞，加多孔钽浸提液1 mL；C组于每孔中直接接种2×104个MG63细胞，加MEM培养液1 mL。3组培养板均置于37℃、5%CO2及饱和湿度孵箱内培养，隔天换液1次，连续培养7 d。
1.5 观测指标
1.5.1 扫描电镜观察
培养3、5、7 d取出A组细胞-材料复合物，PBS冲洗，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥、喷金，扫描电镜观察细胞在多孔钽材料上的生长情况。
1.5.2 免疫组织化学染色观察
培养5 d取3组细胞，常规消化传代，取第4代细胞计数，以1×106个/mL密度接种于预置无菌盖玻片的6孔板内；常规培养细胞至70%融合后，按照PV两步法免疫组织化学试剂盒操作说明测定Runx-2、OC和FN的表达量。具体步骤：取出细胞爬片，PBS洗3次，每次3 min；4%多聚甲醛固定30 min；0.5%Triton X-100滴加至盖玻片上，室温作用20 min；3%H2O2阻断20 min，PBS洗3次；细胞爬片分别加入兔抗人Runx-2多克隆抗体（1:100）、兔抗人OC多克隆抗体（1:100）、兔抗人FN单克隆抗体（1:200），4℃过夜；PBS洗涤，滴加二抗，室温孵育40 min；PBS洗涤，DAB显色，脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察。各组每个放大倍数随机选13张图片，采用Image Pro-Plus图像分析软件测定吸光度（A）值，取均值。
1.5.3 Western blot检测
培养5 d收集3组细胞，加入细胞裂解液裂解，提取蛋白定量后，加入4 ×样本缓冲液，95℃变性5 min。取20μg样品在SDS-PAGE上电泳，电转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入兔抗人Runx-2多克隆抗体（1:100）、兔抗人OC多克隆抗体（1:100）、兔抗人FN单克隆抗体（1:200），4℃过夜，PBS洗涤3次，每次10 min；加辣根过氧化物酶标记的二抗（1:2 000），室温孵育2 h；PBS洗涤3次，加入ECL化学发光试剂后放入暗盒中压片并依次显影、固定，并用其配套软件分析实验结果。以Runx-2、OC、FN与β-actin比值表示相应蛋白表达量。
1.6 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MG63细胞形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜下观察原代细胞接种后为透亮球形，贴壁生长并呈梭形及多角形，细胞质向外伸展形成突起；3 d后细胞快速生长体积增大，相互连结（图 2 a）；5 d后细胞生长融合至80%～90%，细胞成片生长，细胞形态不易区分。第3代细胞形态趋于单一化，呈长梭形或多角形（图 2 b）；ALP染色呈阳性（图 3）。
2.2 细胞-材料复合物扫描电镜观察
扫描电镜观察示，培养3 d细胞在材料表面及孔隙内黏附生长，细胞排列较稀疏，突起少；5 d，相邻细胞互相连接成片状，覆盖材料表面及孔隙内壁；7 d，细胞分泌大量细胞外基质，覆盖大部分材料表面。见图 4。
2.3 免疫组织化学染色观察
各组细胞均有不同程度Runx-2、OC和FN表达，细胞质中均可见棕黄色颗粒，其中A组细胞质深染，表达较其余2组明显。见图 5。定量分析显示，A组Runx-2、OC表达量显著高于B、C组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组间差异无统计学意义（P > 0.05）。A组FN表达量高于B、C组，B组高于C组，但3组间比较差异无统计学意义（F=1.943，P=0.158）。见表 1。
图5
培养5 d各组免疫组织化学染色观察（×200）ⓐ A组Runx-2 ⓑ B组Runx-2 ⓒ C组Runx-2 ⓓ A组OC ⓔ B组OC ⓕ C组OC ⓖ A组FN ⓗ B组FN ⓘ C组FN
Figure5.
Immunohistochemical staining observation of 3 groups at 5 days after culture (×200) ⓐ Runx-2 in group A ⓑ Runx-2 in group B ⓒ Runx-2 in group C ⓓ OC in group A ⓔOC in group B ⓕ OC in group C ⓖ FN in group A ⓗ FN in group B ⓘ FN in group C
表1
免疫组织化学染色检测培养5 d各组Runx-2、OC及FN表达量（n=13，2.4 Western blot检测
A组Runx-2、OC蛋白表达量明显高于B、C组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组间差异无统计学意义（P > 0.05）。3组FN蛋白表达量比较差异均无统计学意义（F=0.173，P=0.842）。见图 6、表 2。
图6
Western blot检测培养5 d各组Runx-2、OC和FN蛋白表达 1：C组2：B组3：A组
Figure6.
Western blot detection for protein expressions of Runx-2, OC, and FN at 5 days after culture 1: Group C 2: Group B 3: Group A
表2
Western blot检测培养5 d各组Runx-2、OC及FN蛋白表达量（n=11，3 讨论
有文献报道，金属材料的三维结构有利于成骨细胞黏附、生长，可增强植入材料与骨间连接，促进骨长入；同时有利于营养物质在植入材料的运输，促进骨再生；而且成骨细胞可沿三维多孔结构的孔隙生长，使植入物与骨间更加稳固[13-14]。本研究采用的多孔钽材料是经粉末浇注高温煅烧技术制备，呈三维立体结构，大体观察多孔钽深灰色表面上可见针尖大小蜂窝状孔隙，孔隙率达65%～80%。扫描电镜观察可见多孔钽材料表面及断面有直径20～50 μm的微粒，微粒间有直径400～600μm的微孔结构，且微粒间孔隙呈相互连通的网状结构。多孔钽的纳米微孔结构可对成骨细胞增殖起重要影响，其粗糙的表面能吸附大分子，影响细胞增殖、黏附和成骨能力。有报道钽还可促进成骨细胞Ⅰ型胶原等的表达[15]。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，可经历细胞增殖、细胞外基质成熟和矿化等阶段，最终调控骨形成。细胞与支架复合培养是检测支架材料生物相容性的最敏感方法[16]，MG63细胞是一种广泛应用于组织工程研究的种子细胞。细胞与多孔支架复合培养后，支架的三维结构可加快营养物质交换，促进骨长入[17]。本研究中，扫描电镜发现MG63细胞与国产多孔钽材料共培养后，细胞随时间延长逐步长入材料孔隙中，并分泌大量基质，细胞伸出伪足，相互连结并最终覆盖材料表面，提示国产多孔钽的三维立体材料有利于细胞的黏附、增殖，促进骨长入。
多孔钽材料在骨诱导和促进骨再生方面表现优异[6, 18]，但具体机制尚不明确。Runx-2是BMP蛋白家族下游的一个重要调节因子，属于Runx家族，是成骨细胞的特异转录因子，在骨再生过程中发挥重要作用，可参与多种成骨分化因子的调控[19]。Runx-2能上调成骨细胞中的相关基因使其定向分化，有研究提示Runx-2基因敲除小鼠在膜内无法成骨，表明Runx-2可影响成骨[8]。OC是成骨细胞分化和成熟的标志，能直接反映骨形成速度，在细胞外基质矿化过程中发挥重要调节作用，可通过测定OC的表达来评价成骨情况[9]。OC还可与羟基磷灰石中的Ca2+结合，吸引与骨矿化有关的相关蛋白，在骨形成和矿化中发挥重要作用[20]。FN是一种具备多种生物学性能的高分子糖蛋白，是重要的细胞黏附因子，参与成骨细胞的增殖、成骨过程，主要功能是介导细胞黏着，在细胞粘连、形态维持方面起重要作用，可诱导Ⅰ型胶原表达，并促进细胞贴壁时间和融合时间[8, 21]。
本研究采用免疫组织化学染色和Western blot法检测各组Runx-2、OC和FN的表达情况，结果发现各组Runx-2、OC和FN均呈阳性表达。A组与B组比较，Runx-2、OC阳性细胞细胞质染色深，定量分析表达量差异有统计学意义；Western blot结果也提示A组Runx-2、OC蛋白高表达。而B组Runx-2、OC表达与C组比较差异无统计学意义，提示多孔钽的三维结构可能通过上调节成骨特异转录因子Runx-2，进而影响成骨，造成OC表达升高，与前期报道一致[5]。同时，通过对FN免疫组织化学染色和Western blot结果分析，发现3组蛋白表达量呈C、B、A组依次增高的趋势，但差异均无统计学意义。提示在本实验条件下，可能存在FN因子的激活，但表达影响并不明显，具体原因有待进一步研究分析。
综上述，国产多孔钽材料具备良好的三维立体结构，有利于成骨细胞黏附、增殖，并可影响成骨转录因子Runx-2、OC的表达，促进骨长入，可用作骨组织工程支架材料。但本研究缺少其他金属材料作为阳性对照，将在下一步研究中完善。
