引用本文： 聂涛, 戴闽, 江川, 刘翔. 氯化镧对氧化铝陶瓷颗粒诱导RAW264.7细胞炎性因子表达的影响. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(8): 951-954. doi: 10.7507/1002-1892.20140209 复制
镧元素是稀土元素中最为活跃的一种，具有独特的分子结构和理化性质，在医药及临床研究方面得到广泛应用[1]。其抗炎性及作用于NF-κB信号通路的特点在人工关节无菌性松动领域具有探索价值，目前尚罕见报道。本研究拟通过对氯化镧、氧化铝陶瓷颗粒和小鼠巨噬细胞共培养，采用分子生物学方法观察炎性因子IL-1β、TNF-α释放情况以及氯化镧对其影响，为人工关节无菌性松动的防治提供新思路及实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂及仪器
小鼠RAW264.7细胞购自中国科学院上海生命科学院细胞库。氯化镧（LaCl3·7H2O，纯度99.9%；Sigma-Aldrich公司，美国），溶于无菌注射用水配制成溶液。氧化铝陶瓷颗粒（纯度＞ 99%；大连海蓝光电材料有限公司）。随机取少量氧化铝陶瓷颗粒扫描电镜观察示，平均粒径0.18 µm。将氧化铝陶瓷颗粒分成2份，第1 份用于配置实验溶液，将样本以75%乙醇浸泡过夜，250℃、3 h干烤，在无血清H-DMEM培养液内配成氧化铝陶瓷颗粒悬液；第2份用于细菌培养和内毒素检测。细菌培养检测结果示无菌生长；鲎试剂盒（厦门市鲎试剂实验厂）检测内毒素含量低于0.02 EU/mL，可排除陶瓷颗粒中残余内毒素对实验的影响。
去热原培养瓶（Corning公司，美国）；ELISA试剂盒（R&D公司，美国）；总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒（Promega公司，美国）；兔抗鼠NF-κB多克隆抗体（Abcam公司，美国）；二抗山羊抗兔IgG（ZSGB-BIO 公司，美国）；细胞核蛋白提取试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。酶标仪（Thermo公司，美国）；PCR仪（ABI公司，美国）；垂直电泳系统、超高灵敏度化学发光成像系统（Bio-Rad公司，美国）；全自动凝胶分析系统（珠海黑马医学仪器有限公司）。
1.2 实验分组
将RAW264.7细胞以1 ×106个/mL密度接种于去热原培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱，用含10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的H-DMEM培养基培养，隔天换液1次，当培养瓶贴壁细胞达90%融合时，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并传代。取生长状态良好的第3代RAW264.7细胞，根据培养液不同分成4组：A组，细胞培养液；B组，加入1 mg/mL氧化铝陶瓷颗粒悬液；C组，加入1 mg/mL氧化铝陶瓷颗粒悬液和10 μmol/L氯化镧溶液；D组，加入10 μmol/L氯化镧溶液。分组干预时换用无血清DMEM培养基培养。
1.3 检测指标
1.3.1 MTT法检测细胞活性
将第3代细胞以6 ×103个/孔密度接种于96孔板，贴壁后按分组干预，调整每组最终液体量为200 μL。放入37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，随后每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h；终止培养，吸弃上清；每孔加入DMSO 150 μL，置摇床12 min，使结晶完全溶解于DMSO。酶标仪上于490 nm波长处测量吸光度（A）值。
1.3.2 RT-PCR检测
将第3代细胞以1.5 ×106个 / 孔密度接种于6孔板，贴壁后按分组干预48 h并弃培养基。参照总RNA提取试剂盒步骤提取总RNA，经逆转录合成cDNA。PCR引物由Invitrogen公司合成，各基因引物序列及产物大小见表 1。PCR反应条件：95℃预变性4 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，32个循环；72℃延伸10 min。各取产物5 μL，于2%琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶分析系统灰度扫描分析。以目的基因与β-actin基因扩增片段灰度值之比表示目的基因相对表达量。
表1
各目的基因引物序列及产物大小
Table1.
Primer sequence and product size of genes
1.3.3 ELISA检测
将第3代细胞以1.2 ×106个/孔密度接种于12孔板，贴壁后按分组干预48 h，收集细胞上清，以离心半径8 cm、3 000 r/min离心20 min，取上清，按ELISA试剂盒说明书操作，于酶标仪450 nm波长处检测IL-1β及TNF-α含量。
1.3.4 Western blot检测
将第3代细胞以5 ×106 个 / 孔密度接种于6孔板，贴壁后按分组干预48 h，收集细胞。采用细胞核蛋白提取试剂盒进行裂解和提取，4℃以离心半径8 cm、12 000 r/min离心10 min，提取上清，根据BCA法测出的样本蛋白浓度计算上样蛋白需要量，SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗兔抗鼠NF-κB多克隆抗体（1∶1 000），4℃孵育过夜。TBST洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记二抗山羊抗兔IgG，4℃孵育4 h，洗膜后发光液染膜，放入超高灵敏度化学发光成像系统中曝光，并用其配套软件分析实验结果。以NF-κB与β-actin灰度值之比表示NF-κB蛋白表达量。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MTT法检测细胞活性
A、B、C、D组A值分别为1.056 ± 0.091、0.789 ± 0.107、0.990 ± 0.072、0.933 ± 0.046，组间比较差异无统计学意义（F=2.180，P=0.142）。
2.2 RT-PCR检测
RT-PCR检测示，各组均有IL-1β、TNF-α、NF-κB mRNA表达。B组IL-1β、TNF-α、NF-κB mRNA表达量显著高于其余3组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；D组各基因表达量低于A组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；见表 2。
表2
RT-PCR检测各组IL-1β、TNF-α及NF-κB mRNA相对表达量（n=6，2.3 ELISA检测
A、B、C、D组IL-1β含量分别为（34.51 ± 3.29）、（92.94 ± 7.79）、（50.46 ± 2.51）、（27.26 ± 2.69）ng/mL，TNF-α含量分别为（40.91 ± 2.64）、（110.56 ± 7.87）、（52.51 ± 3.74）、（25.32 ± 2.19）ng/mL。B组IL-1β和TNF-α含量均显著高于其余3组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；D组显著低于A组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。
2.4 Western blot检测
A、B、C、D组NF-κB蛋白表达量分别为0.565 ± 0.023、1.279 ± 0.077、0.602 ± 0.037、0.377 ± 0.030，B组显著高于其余3组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。
3 讨论
3.1 氯化镧与RAW264.7细胞的关系
大量研究表明[2]，磨损颗粒及其黏附的内毒素均可引起巨噬细胞活化，释放炎性因子，增强破骨细胞活性，导致骨吸收；此外，磨损颗粒使局部组织中的细胞浸润增强，浸润的单核细胞作为破骨细胞前体，进一步分化成破骨细胞。因此，募集破骨细胞的前体细胞，刺激破骨细胞形成并增加其活性是人工假体无菌性松动的关键环节。破骨细胞是磨损颗粒所致假体周围骨溶解的终末细胞，各种炎性因子大多通过影响破骨细胞分化和成熟，最终发挥其溶骨活性。
本研究选用的RAW264.7细胞是小鼠单核细胞/巨噬细胞系，被视为破骨细胞的前体细胞[3]，在DMEM培养液中生长良好，细胞贴壁生长，形态以类圆形和不规则多边形为主，一般含1～2个细胞核，胞体较小，有触足。我们前期研究也表明RAW264.7细胞增殖稳定，可无限传代，多次传代后细胞生物学特性稳定，生长较快[4]；并且能表达成熟破骨细胞特异性表型基因以及与骨吸收相关的功能基因，形成骨吸收陷窝，能近似反映破骨细胞生物学特性[5]。本研究主要通过观察氯化镧对氧化铝陶瓷颗粒诱导RAW264.7细胞产生炎性因子的影响，分析氯化镧对假体无菌性松动的影响。
3.2 氯化镧与磨损颗粒的关系
假体周围骨溶解导致的无菌性松动是人工关节置换术后最常见远期并发症[6]。大多数学者认为假体产生的磨损颗粒在无菌性松动中起重要作用，已被证实可诱导炎性反应，从而诱导骨溶解[7]。磨损颗粒被假体周围的单核巨噬细胞吞噬，释放炎性因子，主要包括IL-1β、TNF-α[8]。陶瓷假体主要成分为氧化铝[9-10]。镧元素作为稀土元素中的研究热点，在烧伤、肿瘤、肾脏等疾病领域有较深入研究，并已证实其具有抗炎、抗菌等生物学作用[11]，然而氯化镧在人工关节无菌性松动领域的研究尚罕见报道。
本研究发现，给予氯化镧和氧化铝陶瓷颗粒溶液干预后，MTT检测示A值未见明显改变，表明氧化铝陶瓷颗粒和氯化镧对巨噬细胞无明显细胞毒性。ELISA和RT-PCR检测结果示，加入氧化铝陶瓷颗粒后细胞的炎性因子IL-1β、TNF-α表达显著增高；继续加入氯化镧后，炎性因子释放明显减少，表明氯化镧可以抑制陶瓷颗粒对巨噬细胞的炎性刺激，预防骨溶解的发生。
3.3 氯化镧与NF-κB的关系
在磨损颗粒诱导骨溶解过程中，NF-κB信号转导通路对破骨细胞的发生、分化、成熟、死亡起着重要调节作用。颗粒本身就是一种细胞外信号，能够激活细胞内信号转导通路并引起生物学效应。目前磨损颗粒对NF-κB受体活化因子信号转导系统影响的研究，主要集中在NF-κB信号通路方面。磨损颗粒能够激活破骨细胞及其前体细胞内的转录因子NF-κB。
大量研究表明，通过阻断NF-κB信号转导通路，可以抑制破骨细胞分化、激活或诱导破骨细胞凋亡，在骨质疏松症、类风湿性关节炎的治疗中已获得初步效果[12]。Clohisy等[13]体外实验条件下用NF-κB抑制剂TPCK或CPI阻止I-κB的磷酸化，可以明显抑制骨水泥颗粒对NF-κB的活化作用。Ren等[14]研究表明红霉素能抑制聚甲基丙烯酸甲酯和超高分子聚乙烯混合颗粒对NF-κB的活化作用，减少前体细胞的炎性因子基因表达，减轻NF-κB受体活化因子配体对前体细胞的刺激，进而减少破骨细胞生成，同时还能抑制成熟破骨细胞的吸收活性。Goater等[15]将转染后稳定分泌骨保护素的成纤维样滑膜细胞植入小鼠颅骨，可有效抑制钛颗粒诱导的骨溶解。
本研究结果显示，给予氧化铝陶瓷颗粒刺激后NF-κB含量明显增高，说明氧化铝陶瓷颗粒会影响NF-κB信号转导通路；加入氯化镧后，NF-κB基因表达和蛋白含量明显降低，说明氯化镧可通过调控NF-κB信号通路明显抑制磨损颗粒诱导的炎性反应。因此我们将在此基础上进一步观察和研究氯化镧对无菌性松动的抑制效果和机制，为镧元素应用于人工关节无菌性松动防治提供实验依据。
镧元素是稀土元素中最为活跃的一种，具有独特的分子结构和理化性质，在医药及临床研究方面得到广泛应用[1]。其抗炎性及作用于NF-κB信号通路的特点在人工关节无菌性松动领域具有探索价值，目前尚罕见报道。本研究拟通过对氯化镧、氧化铝陶瓷颗粒和小鼠巨噬细胞共培养，采用分子生物学方法观察炎性因子IL-1β、TNF-α释放情况以及氯化镧对其影响，为人工关节无菌性松动的防治提供新思路及实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂及仪器
小鼠RAW264.7细胞购自中国科学院上海生命科学院细胞库。氯化镧（LaCl3·7H2O，纯度99.9%；Sigma-Aldrich公司，美国），溶于无菌注射用水配制成溶液。氧化铝陶瓷颗粒（纯度＞ 99%；大连海蓝光电材料有限公司）。随机取少量氧化铝陶瓷颗粒扫描电镜观察示，平均粒径0.18 µm。将氧化铝陶瓷颗粒分成2份，第1 份用于配置实验溶液，将样本以75%乙醇浸泡过夜，250℃、3 h干烤，在无血清H-DMEM培养液内配成氧化铝陶瓷颗粒悬液；第2份用于细菌培养和内毒素检测。细菌培养检测结果示无菌生长；鲎试剂盒（厦门市鲎试剂实验厂）检测内毒素含量低于0.02 EU/mL，可排除陶瓷颗粒中残余内毒素对实验的影响。
去热原培养瓶（Corning公司，美国）；ELISA试剂盒（R&D公司，美国）；总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒（Promega公司，美国）；兔抗鼠NF-κB多克隆抗体（Abcam公司，美国）；二抗山羊抗兔IgG（ZSGB-BIO 公司，美国）；细胞核蛋白提取试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。酶标仪（Thermo公司，美国）；PCR仪（ABI公司，美国）；垂直电泳系统、超高灵敏度化学发光成像系统（Bio-Rad公司，美国）；全自动凝胶分析系统（珠海黑马医学仪器有限公司）。
1.2 实验分组
将RAW264.7细胞以1 ×106个/mL密度接种于去热原培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱，用含10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的H-DMEM培养基培养，隔天换液1次，当培养瓶贴壁细胞达90%融合时，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并传代。取生长状态良好的第3代RAW264.7细胞，根据培养液不同分成4组：A组，细胞培养液；B组，加入1 mg/mL氧化铝陶瓷颗粒悬液；C组，加入1 mg/mL氧化铝陶瓷颗粒悬液和10 μmol/L氯化镧溶液；D组，加入10 μmol/L氯化镧溶液。分组干预时换用无血清DMEM培养基培养。
1.3 检测指标
1.3.1 MTT法检测细胞活性
将第3代细胞以6 ×103个/孔密度接种于96孔板，贴壁后按分组干预，调整每组最终液体量为200 μL。放入37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，随后每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h；终止培养，吸弃上清；每孔加入DMSO 150 μL，置摇床12 min，使结晶完全溶解于DMSO。酶标仪上于490 nm波长处测量吸光度（A）值。
1.3.2 RT-PCR检测
将第3代细胞以1.5 ×106个 / 孔密度接种于6孔板，贴壁后按分组干预48 h并弃培养基。参照总RNA提取试剂盒步骤提取总RNA，经逆转录合成cDNA。PCR引物由Invitrogen公司合成，各基因引物序列及产物大小见表 1。PCR反应条件：95℃预变性4 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，32个循环；72℃延伸10 min。各取产物5 μL，于2%琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶分析系统灰度扫描分析。以目的基因与β-actin基因扩增片段灰度值之比表示目的基因相对表达量。
表1
各目的基因引物序列及产物大小
Table1.
Primer sequence and product size of genes
1.3.3 ELISA检测
将第3代细胞以1.2 ×106个/孔密度接种于12孔板，贴壁后按分组干预48 h，收集细胞上清，以离心半径8 cm、3 000 r/min离心20 min，取上清，按ELISA试剂盒说明书操作，于酶标仪450 nm波长处检测IL-1β及TNF-α含量。
1.3.4 Western blot检测
将第3代细胞以5 ×106 个 / 孔密度接种于6孔板，贴壁后按分组干预48 h，收集细胞。采用细胞核蛋白提取试剂盒进行裂解和提取，4℃以离心半径8 cm、12 000 r/min离心10 min，提取上清，根据BCA法测出的样本蛋白浓度计算上样蛋白需要量，SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗兔抗鼠NF-κB多克隆抗体（1∶1 000），4℃孵育过夜。TBST洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记二抗山羊抗兔IgG，4℃孵育4 h，洗膜后发光液染膜，放入超高灵敏度化学发光成像系统中曝光，并用其配套软件分析实验结果。以NF-κB与β-actin灰度值之比表示NF-κB蛋白表达量。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MTT法检测细胞活性
A、B、C、D组A值分别为1.056 ± 0.091、0.789 ± 0.107、0.990 ± 0.072、0.933 ± 0.046，组间比较差异无统计学意义（F=2.180，P=0.142）。
2.2 RT-PCR检测
RT-PCR检测示，各组均有IL-1β、TNF-α、NF-κB mRNA表达。B组IL-1β、TNF-α、NF-κB mRNA表达量显著高于其余3组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；D组各基因表达量低于A组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；见表 2。
表2
RT-PCR检测各组IL-1β、TNF-α及NF-κB mRNA相对表达量（n=6，2.3 ELISA检测
A、B、C、D组IL-1β含量分别为（34.51 ± 3.29）、（92.94 ± 7.79）、（50.46 ± 2.51）、（27.26 ± 2.69）ng/mL，TNF-α含量分别为（40.91 ± 2.64）、（110.56 ± 7.87）、（52.51 ± 3.74）、（25.32 ± 2.19）ng/mL。B组IL-1β和TNF-α含量均显著高于其余3组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；D组显著低于A组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。
2.4 Western blot检测
A、B、C、D组NF-κB蛋白表达量分别为0.565 ± 0.023、1.279 ± 0.077、0.602 ± 0.037、0.377 ± 0.030，B组显著高于其余3组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。
3 讨论
3.1 氯化镧与RAW264.7细胞的关系
大量研究表明[2]，磨损颗粒及其黏附的内毒素均可引起巨噬细胞活化，释放炎性因子，增强破骨细胞活性，导致骨吸收；此外，磨损颗粒使局部组织中的细胞浸润增强，浸润的单核细胞作为破骨细胞前体，进一步分化成破骨细胞。因此，募集破骨细胞的前体细胞，刺激破骨细胞形成并增加其活性是人工假体无菌性松动的关键环节。破骨细胞是磨损颗粒所致假体周围骨溶解的终末细胞，各种炎性因子大多通过影响破骨细胞分化和成熟，最终发挥其溶骨活性。
本研究选用的RAW264.7细胞是小鼠单核细胞/巨噬细胞系，被视为破骨细胞的前体细胞[3]，在DMEM培养液中生长良好，细胞贴壁生长，形态以类圆形和不规则多边形为主，一般含1～2个细胞核，胞体较小，有触足。我们前期研究也表明RAW264.7细胞增殖稳定，可无限传代，多次传代后细胞生物学特性稳定，生长较快[4]；并且能表达成熟破骨细胞特异性表型基因以及与骨吸收相关的功能基因，形成骨吸收陷窝，能近似反映破骨细胞生物学特性[5]。本研究主要通过观察氯化镧对氧化铝陶瓷颗粒诱导RAW264.7细胞产生炎性因子的影响，分析氯化镧对假体无菌性松动的影响。
3.2 氯化镧与磨损颗粒的关系
假体周围骨溶解导致的无菌性松动是人工关节置换术后最常见远期并发症[6]。大多数学者认为假体产生的磨损颗粒在无菌性松动中起重要作用，已被证实可诱导炎性反应，从而诱导骨溶解[7]。磨损颗粒被假体周围的单核巨噬细胞吞噬，释放炎性因子，主要包括IL-1β、TNF-α[8]。陶瓷假体主要成分为氧化铝[9-10]。镧元素作为稀土元素中的研究热点，在烧伤、肿瘤、肾脏等疾病领域有较深入研究，并已证实其具有抗炎、抗菌等生物学作用[11]，然而氯化镧在人工关节无菌性松动领域的研究尚罕见报道。
本研究发现，给予氯化镧和氧化铝陶瓷颗粒溶液干预后，MTT检测示A值未见明显改变，表明氧化铝陶瓷颗粒和氯化镧对巨噬细胞无明显细胞毒性。ELISA和RT-PCR检测结果示，加入氧化铝陶瓷颗粒后细胞的炎性因子IL-1β、TNF-α表达显著增高；继续加入氯化镧后，炎性因子释放明显减少，表明氯化镧可以抑制陶瓷颗粒对巨噬细胞的炎性刺激，预防骨溶解的发生。
3.3 氯化镧与NF-κB的关系
在磨损颗粒诱导骨溶解过程中，NF-κB信号转导通路对破骨细胞的发生、分化、成熟、死亡起着重要调节作用。颗粒本身就是一种细胞外信号，能够激活细胞内信号转导通路并引起生物学效应。目前磨损颗粒对NF-κB受体活化因子信号转导系统影响的研究，主要集中在NF-κB信号通路方面。磨损颗粒能够激活破骨细胞及其前体细胞内的转录因子NF-κB。
大量研究表明，通过阻断NF-κB信号转导通路，可以抑制破骨细胞分化、激活或诱导破骨细胞凋亡，在骨质疏松症、类风湿性关节炎的治疗中已获得初步效果[12]。Clohisy等[13]体外实验条件下用NF-κB抑制剂TPCK或CPI阻止I-κB的磷酸化，可以明显抑制骨水泥颗粒对NF-κB的活化作用。Ren等[14]研究表明红霉素能抑制聚甲基丙烯酸甲酯和超高分子聚乙烯混合颗粒对NF-κB的活化作用，减少前体细胞的炎性因子基因表达，减轻NF-κB受体活化因子配体对前体细胞的刺激，进而减少破骨细胞生成，同时还能抑制成熟破骨细胞的吸收活性。Goater等[15]将转染后稳定分泌骨保护素的成纤维样滑膜细胞植入小鼠颅骨，可有效抑制钛颗粒诱导的骨溶解。
本研究结果显示，给予氧化铝陶瓷颗粒刺激后NF-κB含量明显增高，说明氧化铝陶瓷颗粒会影响NF-κB信号转导通路；加入氯化镧后，NF-κB基因表达和蛋白含量明显降低，说明氯化镧可通过调控NF-κB信号通路明显抑制磨损颗粒诱导的炎性反应。因此我们将在此基础上进一步观察和研究氯化镧对无菌性松动的抑制效果和机制，为镧元素应用于人工关节无菌性松动防治提供实验依据。
