引用本文： 杨大威, 林和敏, 刘广鹏. 成骨分化的人脐带血间充质干细胞免疫原性研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(6): 752-757. doi: 10.7507/1002-1892.20140167 复制
作为再生医学研究领域的重要内容之一，组织工程骨构建、移植与治疗技术已日益成熟并进入临床前期应用阶段，有望成为骨缺损修复的新手段。脐带血来源于中胚层，除含有造血干细胞外，也含有较为丰富的MSCs[1-2]。脐带血具有来源丰富、采集简便、易于冻存、不易传播病毒性疾病等优点，因此脐带血间充质干细胞（umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）有望成为理想的组织工程骨种子细胞来源[3-4]。我们前期研究表明，人UCB-MSCs在长期培养过程中细胞表面标志、体外增殖与成骨分化潜能等干细胞特性均保持稳定[5]。以成骨诱导分化的UCB-MSCs复合脱矿骨基质构建的组织工程骨能够修复裸大鼠颅骨标准缺损，为研究其作为组织工程骨种子细胞的可行性奠定了实验基础[6]。
但要真正广泛应用UCB-MSCs修复骨缺损，满足急性骨损伤临床治疗需要，面临的另一重要课题就是异基因的UCB-MSCs能否成为组织工程骨的种子细胞来源。已知人脐血淋巴细胞相对不成熟，脐带血造血干细胞可在人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型不符者之间输注[7-9]。而UCB-MSCs免疫原性也较弱，UCB-MSCs在体外可抑制T淋巴细胞增殖，高表达HLA-Ⅰ类分子（即HLA-A、B、C），不表达HLA-Ⅱ类分子（即HLA-DR、DP、DQ），也不表达CD40、CD40L、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）等B、T淋巴细胞活化所需的共刺激分子[10-13]。但作为骨组织工程种子细胞，体内回植前的体外扩增和成骨诱导分化非常关键。UCB-MSCs在成骨诱导分化过程中将分泌合成较多细胞外基质，在基因水平、蛋白表达与细胞功能方面产生多种改变，其免疫原性是否也会因此发生变化，目前罕见相关研究报道。本研究通过系统观察成骨诱导分化UCB-MSCs表面免疫分子的表达及其在体外抑制混合淋巴细胞增殖反应的能力，阐明成骨分化的UCB-MSCs免疫原性变化规律，为探讨同种异体UCB-MSCs能否用于构建组织工程骨及骨缺损修复提供免疫学证据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
Ficoll淋巴细胞分离液、地塞米松、β-磷酸甘油酸钠、磷酸抗坏血酸、茜素红染色试剂盒、IFN-γ、IL-2、植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）、丝裂霉素C（Sigma公司，美国）；L-DMEM培养液、RPMI1640培养液（GIBCO公司，美国）；FBS（HyClone公司，美国）；胰蛋白酶、EDTA（上海思吉生物制品有限公司）；PE标记的鼠抗人HLA-Ⅰ抗体、FITC标记的鼠抗人HLA-Ⅱ抗体（Santa Cruz公司，美国）；氚标记胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine，3H-TdR；中国科学院上海核技术开发公司）。
恒温CO2培养箱（Forma公司，美国）；低温高速离心机、β液闪计数仪（Beckman Coulter公司，德国）；流式细胞仪（FACScan公司，美国）；倒置相差显微镜、显微照相系统（Olympus公司，日本）；细胞培养皿、6孔板、96孔板、离心管（1.5、15、50 mL）、Transwell通透性隔离腔（Falcon公司，美国）。
1.2 UCB-MSCs分离培养
5份脐静脉血标本（50 mL/例）均来源于同济大学附属上海市第十人民医院产科行剖腹产的健康产妇，经医院伦理委员会批准且产妇及家属知情同意。脐静脉血标本加入PBS液混匀，缓慢滴入至等量1.077 g/mL Ficoll淋巴细胞分离液面上，以600 × g离心20 min。抽取白膜层细胞，以等量PBS液洗涤离心（300 × g离心5 min），基础培养液（含20%FBS、100 U/ mL青链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺的L-DMEM）重悬，接种至100 mm培养皿，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养。第5天首次全量换液，之后每3天换液1次，2～3周后细胞达60%～80%融合时，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，按1∶3比例传代。倒置相差显微镜下观察各代细胞形态变化。取第3代细胞进行以下实验。
1.3 检测指标
1.3.1 UCB-MSCs的成骨诱导分化与检测
取UCB-MSCs以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，按1 ×105个/孔密度接种至6孔板。接种次日起改用成骨条件培养液（含1 × 10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/ L β-磷酸甘油酸钠、50 µg/L磷酸抗坏血酸的基础培养液）行成骨诱导培养[5-6]。诱导2周后参照文献[14]方法行茜素红染色，观察细胞外基质钙化和钙结节形成情况，并采用吸光度（A）值半定量检测细胞外基质Ca2+含量[14]。以未诱导细胞作为对照。
1.3.2 成骨分化UCB-MSCs免疫相关膜蛋白分子的表达
分别取成骨诱导2周和未诱导的UCB-MSCs，加入IFN-γ（20 ng/mL），作用48 h后，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，调整细胞浓度为2 ×106 个 / mL，加入流式细胞缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白的PBS）重悬。每个1.5 mL离心管内加入100 μL细胞悬液，分别加入PE标记的鼠抗人HLA-Ⅰ抗体、FITC标记的鼠抗人HLA-Ⅱ抗体和IgG同型对照2 μL，混匀，冰上避光孵育30 min。PBS洗涤2次，每管加入1 mL 4%中性甲醛溶液固定，40 μm滤网过滤至流式检测管内形成单细胞悬液，用流式细胞仪检测IFN-γ刺激前后未诱导的UCB-MSCs HLA-Ⅰ类分子、HLA-Ⅱ类分子和CD40、CD80细胞表面抗原表达情况，比较成骨诱导2 周和未诱导的UCB-MSCs HLA-Ⅰ类分子、HLA-Ⅱ类分子的表达情况。
1.3.3 3H-TdR
掺入法检测成骨分化UCB-MSCs对体外T淋巴细胞增殖的刺激反应经同济大学附属上海市第十人民医院伦理委员会批准并获得志愿者知情同意，获取5份健康成年人外周血（10 mL/例），经密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，加入含10%FBS的RPMI1640细胞培养液，调整细胞浓度为1 ×108 个 / mL。将细胞悬液加入尼龙棉柱内，37℃孵育1 h。用预温至37℃的RPMI1640细胞培养液冲出非黏附细胞，即为T淋巴细胞。细胞计数后以1 ×105 个/孔接种于96孔板备用。
实验分为5组：未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞组（A组）、成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞组（B组）、经IFN-γ刺激的未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞组（C组）、经IFN-γ刺激的成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞组（D组）、单纯T淋巴细胞对照组（E组）。取经成骨诱导2周和未诱导的UCB-MSCs，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化细胞计数，分别以1 ×102、1 ×103、1 ×104、1 ×105个/孔（UCB-MSCs∶淋巴细胞分别为1∶1、1∶10、1∶100和1∶1 000）密度加入96孔板，待其贴壁后，以丝裂霉素C（5 μg/ 孔）预处理。其中C、D组在建立T淋巴细胞共培养反应体系前2 d，于UCB-MSCs培养液中加入IFN-γ（20 ng/ mL），刺激HLA-Ⅱ类分子表达。各组每孔加入1 ×105个T淋巴细胞共培养6 d。然后每孔加入3H-TdR，18 h后收集样品，β液闪计数仪检测T淋巴细胞增殖情况。A～D组均设立上述4个细胞数量级，各取3个复孔，检测每分钟计数（count per minute，CPM）值。
1.3.4 成骨分化UCB-MSCs对PHA刺激T淋巴细胞增殖反应的影响
实验分为6组：未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞+ PHA组（A组）、未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞+ PHA + IL-2组（B组）、成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞+ PHA组（C组）、成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞+ PHA + IL-2组（D组）、T淋巴细胞+ PHA组（E组）、T淋巴细胞 + PHA + IL-2组（F组）。A～D组对应取未诱导和经成骨诱导2周的UCB-MSCs，分别以1 ×102、1 ×103、1 ×104、1 ×105个/孔密度接种至96孔板，待细胞贴壁后，以丝裂霉素C（5 μg/孔）预处理；B、D组在接种UCB-MSCs时，加入IL-2（50 ng/mL）。A～F组每孔加入1 ×105个T淋巴细胞及PHA（2 μg/ mL），非特异性刺激T淋巴细胞增殖；共培养6 d后，加入3H-TdR，18 h后收集样品，β液闪计数仪检测CPM值。
1.3.5 Transwell通透性隔离腔培养体系对T淋巴细胞增殖反应的作用
取T淋巴细胞、未诱导和经成骨诱导2周的UCB-MSCs，分别建立非接触共培养体系；其中UCB-MSCs分别以1 ×102、1 ×103、1 ×104和1 ×105 个/孔密度接种入Transwell小室，T淋巴细胞以1 ×105个/孔密度接种于培养体系下层。置入6孔板内共培养6 d后，取出Transwell通透性隔离腔；实验分为5组：直接接触培养的未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞组（A组）、直接接触培养的经成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞组（B组）、非接触共培养的未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞组（C组）、非接触共培养的经成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞组（D组）、直接接触培养的T淋巴细胞组（E组）。各组加入3H-TdR，18 h后收集样品，β液闪计数仪检测CPM值。
1.4 统计学方法
采用SAS6.12统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t检验或方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 UCB-MSCs形态学观察及成骨分化能力检测
原代UCB-MSCs呈克隆样集落生长，细胞呈椭圆形或短梭形；传代后细胞分布均匀，多数为成纤维样细胞形态，呈漩涡状生长。见图 1。
图1
UCB-MSCs形态学观察（倒置相差显微镜 × 40） ⓐ 原代细胞 ⓑ 第3代细胞 第3代细胞成骨诱导2周后茜素红染色为阳性，形成大小不等的红色钙盐沉积区域，对照组无钙盐沉积现象，见图 2。对照组Ca2+含量为0.767 ± 0.081，显著低于成骨诱导组的9.783 ± 0.784，差异有统计学意义（t=4.362，P=0.002）。
2.2 成骨分化UCB-MSCs免疫相关膜蛋白分子的表达
流式细胞仪检测示，IFN-γ刺激前，未诱导的第3 代UCB-MSCs高表达HLA-Ⅰ类分子，不表达HLA-Ⅱ类分子和CD40、CD80细胞表面抗原；经IFN-γ刺激后，仍高表达HLA-Ⅰ类分子，HLA-Ⅱ类分子也呈阳性表达，但CD40、CD80表达仍为阴性。见图 3。
成骨诱导组和未诱导组细胞HLA-Ⅰ类分子均呈阳性表达；而HLA-Ⅱ类分子在未诱导组呈阴性（1.2% ± 0.4%），成骨诱导组阳性表达率有所增高（6.8% ± 3.4%），差异有统计学意义（t=5.491，P=0.001），见图 4。
2.3 成骨分化UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖的刺激反应
A、B、C、D组各浓度UCB-MSCs刺激T淋巴细胞增殖效果均显著低于E组（P＜ 0.05）。A、C组各浓度UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖均有明显抑制效果，且抑制效果呈细胞数量依赖性，密度为1 ×104 个/孔及1 ×105 个/孔时，抑制增殖效果显著高于1 ×102 个 / 孔及1 ×103 个/孔时，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。而经成骨诱导分化的B、D组UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖的抑制作用较A、C组明显减弱（P＜ 0.05），不仅不随细胞数量变化而改变，并且D组在IFN-γ作用后较B组反而有刺激T淋巴细胞增殖的效果（P＜ 0.05）。见图 5。
2.4 成骨分化UCB-MSCs对PHA刺激T淋巴细胞增殖反应的影响
E组PHA显著刺激T淋巴细胞增殖，加入IL-2后淋巴细胞增殖反应进一步增强（F组），两组间各浓度级别比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05），且均显著高于A～D组各浓度级别UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖作用的刺激效果（P＜ 0.05）。A组密度为1 ×104 个 / 孔和1 ×105个/孔时未诱导的UCB-MSCs可抑制PHA刺激T淋巴细胞增殖，抑制效果呈细胞数量依赖性，与密度为1 ×102个/孔和1 ×103个/孔时比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）。但B组加入IL-2后，与A组相比抑制作用被逆转，各密度级别UCB-MSCs对PHA刺激的T淋巴细胞增殖的抑制效果均显著低于A组（P＜ 0.05）。除C组1 ×103个/孔密度外，C、D组各密度级别UCB-MSCs 对T 淋巴细胞增殖的抑制效果均显著低于A、B 组（P＜ 0.05），且C、D组间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05），表明经成骨诱导分化的UCB-MSCs不具有抑制PHA刺激T淋巴细胞增殖的作用，且与IL-2的作用无关。见图 6。
2.5 Transwell通透性隔离腔共培养体系对T淋巴细胞增殖反应的作用
与A组直接接触培养结果相似，C组各密度级别未诱导UCB-MSCs均可显著抑制T淋巴细胞增殖反应，且抑制效果呈细胞数量依赖性，1 ×104个/孔和1 ×105个/孔时抑制增殖效果显著高于密度为1 ×102个/孔和1 ×103个/孔时，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。在细胞密度≥1 ×103个/孔时，A、C组UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖的抑制效果均显著高于B、D组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。A～D组各密度级别UCB-MSCs刺激T淋巴细胞增殖的效果均显著低于E组（P＜ 0.05），而A、C组间和B、D组间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见图 7。
3 讨论
种子细胞是组织工程骨的重要研究内容之一，但种子细胞来源受限却影响了组织工程骨的实际应用。UCB-MSCs来源丰富，取材简便，具有作为组织工程种子细胞的潜在优势。我们前期研究结果表明人UCB-MSCs具有多向分化潜能，在长期体外培养过程中仍能保持成骨分化能力，并且应用成骨分化的UCB-MSCs作为种子细胞成功修复了裸大鼠颅骨标准缺损[5-6]。UCB-MSCs具有较低的免疫原性，本次实验重点针对成骨分化的UCB-MSCs免疫原性进行观察与检测。我们选择成骨诱导2周的UCB-MSCs细胞进行检测，因为此时细胞已分化为成骨细胞（茜素红染色为阳性），但细胞外基质的钙化程度对细胞消化、分离等实验操作无显著影响[15]。
流式细胞仪检测结果发现，正常状态下UCB-MSCs表达HLA-Ⅰ类分子，不表达HLA-Ⅱ类分子；在应用IFN-γ刺激后，HLA-Ⅱ类分子表达明显增高。表明UCB-MSCs具有弱免疫原性，与既往实验报道结果一致[10-13]。成骨诱导分化后的UCB-MSCs同样表达HLA-Ⅰ类分子，并且HLA-Ⅱ类分子的阳性表达率比未诱导细胞升高，提示其免疫原性较正常UCB-MSCs发生了改变，与IFN-γ的刺激效果相似。
我们以混合T淋巴细胞反应模拟体内免疫微环境条件，观察成骨诱导分化的UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖反应的免疫调节作用。T淋巴细胞增殖实验结果表明，正常状态下UCB-MSCs不能刺激异体T淋巴细胞增殖；在经IFN-γ刺激后，HLA-Ⅱ类分子表达增高，但仍未刺激T淋巴细胞增殖升高。上述结果与既往实验报道[10-13]一致，表明未经成骨诱导分化的UCB-MSCs具有抑制混合T淋巴细胞反应的免疫调节功能，且此种负向免疫调节功能呈细胞数量依赖性，而与HLA-Ⅱ类分子的表达无关。但是经成骨诱导分化后，抑制T淋巴细胞增殖的效果明显低于未分化细胞，且不存在细胞数量依赖性。应用IFN-γ刺激后，成骨分化UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖的抑制作用基本消失，表明其免疫原性的改变与HLA-Ⅱ类分子表达升高有关。
为了进一步观察UCB-MSCs对非特异性淋巴细胞增殖反应的作用，我们先以PHA刺激T淋巴细胞增殖。结果发现1 ×104个/孔及以上数量级的未分化UCB-MSCs可抑制PHA刺激的T淋巴细胞增殖，但这种抑制效果能够被IL-2所逆转。而不同数量级的成骨分化UCB-MSCs对PHA刺激的T淋巴细胞增殖反应无抑制效果，不论是否添加IL-2均无逆转。
Transwell通透性隔离腔膜片的孔径为0.3 µm，因此采用Transwell培养法既可有效隔离UCB-MSCs与T淋巴细胞的相互接触，又能够保证大分子物质在隔离腔内外自由弥散，以判断UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖反应的影响是否为细胞间的直接接触所致。研究发现，隔离腔培养与直接接触培养的实验结果一致，即成骨分化的UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖反应的抑制效果显著低于未分化的UCB-MSCs。表明UCB-MSCs对混合T淋巴细胞增殖反应的抑制作用不依赖于细胞间的直接接触，可能与UCB-MSCs分泌的免疫原性相关细胞因子有关[16-18]。
综上述，本实验结果显示，经成骨诱导分化的UCB-MSCs不再具有未分化状态细胞的低免疫原性和调节免疫反应的能力，不能抑制混合T淋巴细胞的体外增殖反应，也不适合作为异源性骨组织工程或细胞治疗的种子细胞来源。下一步我们将重点观察此种免疫调控机制改变与经体外成骨诱导分化后UCB-MSCs分泌的细胞因子和免疫原性膜蛋白的相关性。
作为再生医学研究领域的重要内容之一，组织工程骨构建、移植与治疗技术已日益成熟并进入临床前期应用阶段，有望成为骨缺损修复的新手段。脐带血来源于中胚层，除含有造血干细胞外，也含有较为丰富的MSCs[1-2]。脐带血具有来源丰富、采集简便、易于冻存、不易传播病毒性疾病等优点，因此脐带血间充质干细胞（umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）有望成为理想的组织工程骨种子细胞来源[3-4]。我们前期研究表明，人UCB-MSCs在长期培养过程中细胞表面标志、体外增殖与成骨分化潜能等干细胞特性均保持稳定[5]。以成骨诱导分化的UCB-MSCs复合脱矿骨基质构建的组织工程骨能够修复裸大鼠颅骨标准缺损，为研究其作为组织工程骨种子细胞的可行性奠定了实验基础[6]。
但要真正广泛应用UCB-MSCs修复骨缺损，满足急性骨损伤临床治疗需要，面临的另一重要课题就是异基因的UCB-MSCs能否成为组织工程骨的种子细胞来源。已知人脐血淋巴细胞相对不成熟，脐带血造血干细胞可在人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型不符者之间输注[7-9]。而UCB-MSCs免疫原性也较弱，UCB-MSCs在体外可抑制T淋巴细胞增殖，高表达HLA-Ⅰ类分子（即HLA-A、B、C），不表达HLA-Ⅱ类分子（即HLA-DR、DP、DQ），也不表达CD40、CD40L、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）等B、T淋巴细胞活化所需的共刺激分子[10-13]。但作为骨组织工程种子细胞，体内回植前的体外扩增和成骨诱导分化非常关键。UCB-MSCs在成骨诱导分化过程中将分泌合成较多细胞外基质，在基因水平、蛋白表达与细胞功能方面产生多种改变，其免疫原性是否也会因此发生变化，目前罕见相关研究报道。本研究通过系统观察成骨诱导分化UCB-MSCs表面免疫分子的表达及其在体外抑制混合淋巴细胞增殖反应的能力，阐明成骨分化的UCB-MSCs免疫原性变化规律，为探讨同种异体UCB-MSCs能否用于构建组织工程骨及骨缺损修复提供免疫学证据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
Ficoll淋巴细胞分离液、地塞米松、β-磷酸甘油酸钠、磷酸抗坏血酸、茜素红染色试剂盒、IFN-γ、IL-2、植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）、丝裂霉素C（Sigma公司，美国）；L-DMEM培养液、RPMI1640培养液（GIBCO公司，美国）；FBS（HyClone公司，美国）；胰蛋白酶、EDTA（上海思吉生物制品有限公司）；PE标记的鼠抗人HLA-Ⅰ抗体、FITC标记的鼠抗人HLA-Ⅱ抗体（Santa Cruz公司，美国）；氚标记胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine，3H-TdR；中国科学院上海核技术开发公司）。
恒温CO2培养箱（Forma公司，美国）；低温高速离心机、β液闪计数仪（Beckman Coulter公司，德国）；流式细胞仪（FACScan公司，美国）；倒置相差显微镜、显微照相系统（Olympus公司，日本）；细胞培养皿、6孔板、96孔板、离心管（1.5、15、50 mL）、Transwell通透性隔离腔（Falcon公司，美国）。
1.2 UCB-MSCs分离培养
5份脐静脉血标本（50 mL/例）均来源于同济大学附属上海市第十人民医院产科行剖腹产的健康产妇，经医院伦理委员会批准且产妇及家属知情同意。脐静脉血标本加入PBS液混匀，缓慢滴入至等量1.077 g/mL Ficoll淋巴细胞分离液面上，以600 × g离心20 min。抽取白膜层细胞，以等量PBS液洗涤离心（300 × g离心5 min），基础培养液（含20%FBS、100 U/ mL青链霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺的L-DMEM）重悬，接种至100 mm培养皿，于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养。第5天首次全量换液，之后每3天换液1次，2～3周后细胞达60%～80%融合时，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，按1∶3比例传代。倒置相差显微镜下观察各代细胞形态变化。取第3代细胞进行以下实验。
1.3 检测指标
1.3.1 UCB-MSCs的成骨诱导分化与检测
取UCB-MSCs以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，按1 ×105个/孔密度接种至6孔板。接种次日起改用成骨条件培养液（含1 × 10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/ L β-磷酸甘油酸钠、50 µg/L磷酸抗坏血酸的基础培养液）行成骨诱导培养[5-6]。诱导2周后参照文献[14]方法行茜素红染色，观察细胞外基质钙化和钙结节形成情况，并采用吸光度（A）值半定量检测细胞外基质Ca2+含量[14]。以未诱导细胞作为对照。
1.3.2 成骨分化UCB-MSCs免疫相关膜蛋白分子的表达
分别取成骨诱导2周和未诱导的UCB-MSCs，加入IFN-γ（20 ng/mL），作用48 h后，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，调整细胞浓度为2 ×106 个 / mL，加入流式细胞缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白的PBS）重悬。每个1.5 mL离心管内加入100 μL细胞悬液，分别加入PE标记的鼠抗人HLA-Ⅰ抗体、FITC标记的鼠抗人HLA-Ⅱ抗体和IgG同型对照2 μL，混匀，冰上避光孵育30 min。PBS洗涤2次，每管加入1 mL 4%中性甲醛溶液固定，40 μm滤网过滤至流式检测管内形成单细胞悬液，用流式细胞仪检测IFN-γ刺激前后未诱导的UCB-MSCs HLA-Ⅰ类分子、HLA-Ⅱ类分子和CD40、CD80细胞表面抗原表达情况，比较成骨诱导2 周和未诱导的UCB-MSCs HLA-Ⅰ类分子、HLA-Ⅱ类分子的表达情况。
1.3.3 3H-TdR
掺入法检测成骨分化UCB-MSCs对体外T淋巴细胞增殖的刺激反应经同济大学附属上海市第十人民医院伦理委员会批准并获得志愿者知情同意，获取5份健康成年人外周血（10 mL/例），经密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，加入含10%FBS的RPMI1640细胞培养液，调整细胞浓度为1 ×108 个 / mL。将细胞悬液加入尼龙棉柱内，37℃孵育1 h。用预温至37℃的RPMI1640细胞培养液冲出非黏附细胞，即为T淋巴细胞。细胞计数后以1 ×105 个/孔接种于96孔板备用。
实验分为5组：未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞组（A组）、成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞组（B组）、经IFN-γ刺激的未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞组（C组）、经IFN-γ刺激的成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞组（D组）、单纯T淋巴细胞对照组（E组）。取经成骨诱导2周和未诱导的UCB-MSCs，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化细胞计数，分别以1 ×102、1 ×103、1 ×104、1 ×105个/孔（UCB-MSCs∶淋巴细胞分别为1∶1、1∶10、1∶100和1∶1 000）密度加入96孔板，待其贴壁后，以丝裂霉素C（5 μg/ 孔）预处理。其中C、D组在建立T淋巴细胞共培养反应体系前2 d，于UCB-MSCs培养液中加入IFN-γ（20 ng/ mL），刺激HLA-Ⅱ类分子表达。各组每孔加入1 ×105个T淋巴细胞共培养6 d。然后每孔加入3H-TdR，18 h后收集样品，β液闪计数仪检测T淋巴细胞增殖情况。A～D组均设立上述4个细胞数量级，各取3个复孔，检测每分钟计数（count per minute，CPM）值。
1.3.4 成骨分化UCB-MSCs对PHA刺激T淋巴细胞增殖反应的影响
实验分为6组：未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞+ PHA组（A组）、未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞+ PHA + IL-2组（B组）、成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞+ PHA组（C组）、成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞+ PHA + IL-2组（D组）、T淋巴细胞+ PHA组（E组）、T淋巴细胞 + PHA + IL-2组（F组）。A～D组对应取未诱导和经成骨诱导2周的UCB-MSCs，分别以1 ×102、1 ×103、1 ×104、1 ×105个/孔密度接种至96孔板，待细胞贴壁后，以丝裂霉素C（5 μg/孔）预处理；B、D组在接种UCB-MSCs时，加入IL-2（50 ng/mL）。A～F组每孔加入1 ×105个T淋巴细胞及PHA（2 μg/ mL），非特异性刺激T淋巴细胞增殖；共培养6 d后，加入3H-TdR，18 h后收集样品，β液闪计数仪检测CPM值。
1.3.5 Transwell通透性隔离腔培养体系对T淋巴细胞增殖反应的作用
取T淋巴细胞、未诱导和经成骨诱导2周的UCB-MSCs，分别建立非接触共培养体系；其中UCB-MSCs分别以1 ×102、1 ×103、1 ×104和1 ×105 个/孔密度接种入Transwell小室，T淋巴细胞以1 ×105个/孔密度接种于培养体系下层。置入6孔板内共培养6 d后，取出Transwell通透性隔离腔；实验分为5组：直接接触培养的未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞组（A组）、直接接触培养的经成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞组（B组）、非接触共培养的未诱导UCB-MSCs + T淋巴细胞组（C组）、非接触共培养的经成骨诱导2周UCB-MSCs + T淋巴细胞组（D组）、直接接触培养的T淋巴细胞组（E组）。各组加入3H-TdR，18 h后收集样品，β液闪计数仪检测CPM值。
1.4 统计学方法
采用SAS6.12统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t检验或方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 UCB-MSCs形态学观察及成骨分化能力检测
原代UCB-MSCs呈克隆样集落生长，细胞呈椭圆形或短梭形；传代后细胞分布均匀，多数为成纤维样细胞形态，呈漩涡状生长。见图 1。
图1
UCB-MSCs形态学观察（倒置相差显微镜 × 40） ⓐ 原代细胞 ⓑ 第3代细胞 第3代细胞成骨诱导2周后茜素红染色为阳性，形成大小不等的红色钙盐沉积区域，对照组无钙盐沉积现象，见图 2。对照组Ca2+含量为0.767 ± 0.081，显著低于成骨诱导组的9.783 ± 0.784，差异有统计学意义（t=4.362，P=0.002）。
2.2 成骨分化UCB-MSCs免疫相关膜蛋白分子的表达
流式细胞仪检测示，IFN-γ刺激前，未诱导的第3 代UCB-MSCs高表达HLA-Ⅰ类分子，不表达HLA-Ⅱ类分子和CD40、CD80细胞表面抗原；经IFN-γ刺激后，仍高表达HLA-Ⅰ类分子，HLA-Ⅱ类分子也呈阳性表达，但CD40、CD80表达仍为阴性。见图 3。
成骨诱导组和未诱导组细胞HLA-Ⅰ类分子均呈阳性表达；而HLA-Ⅱ类分子在未诱导组呈阴性（1.2% ± 0.4%），成骨诱导组阳性表达率有所增高（6.8% ± 3.4%），差异有统计学意义（t=5.491，P=0.001），见图 4。
2.3 成骨分化UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖的刺激反应
A、B、C、D组各浓度UCB-MSCs刺激T淋巴细胞增殖效果均显著低于E组（P＜ 0.05）。A、C组各浓度UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖均有明显抑制效果，且抑制效果呈细胞数量依赖性，密度为1 ×104 个/孔及1 ×105 个/孔时，抑制增殖效果显著高于1 ×102 个 / 孔及1 ×103 个/孔时，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。而经成骨诱导分化的B、D组UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖的抑制作用较A、C组明显减弱（P＜ 0.05），不仅不随细胞数量变化而改变，并且D组在IFN-γ作用后较B组反而有刺激T淋巴细胞增殖的效果（P＜ 0.05）。见图 5。
2.4 成骨分化UCB-MSCs对PHA刺激T淋巴细胞增殖反应的影响
E组PHA显著刺激T淋巴细胞增殖，加入IL-2后淋巴细胞增殖反应进一步增强（F组），两组间各浓度级别比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05），且均显著高于A～D组各浓度级别UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖作用的刺激效果（P＜ 0.05）。A组密度为1 ×104 个 / 孔和1 ×105个/孔时未诱导的UCB-MSCs可抑制PHA刺激T淋巴细胞增殖，抑制效果呈细胞数量依赖性，与密度为1 ×102个/孔和1 ×103个/孔时比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）。但B组加入IL-2后，与A组相比抑制作用被逆转，各密度级别UCB-MSCs对PHA刺激的T淋巴细胞增殖的抑制效果均显著低于A组（P＜ 0.05）。除C组1 ×103个/孔密度外，C、D组各密度级别UCB-MSCs 对T 淋巴细胞增殖的抑制效果均显著低于A、B 组（P＜ 0.05），且C、D组间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05），表明经成骨诱导分化的UCB-MSCs不具有抑制PHA刺激T淋巴细胞增殖的作用，且与IL-2的作用无关。见图 6。
2.5 Transwell通透性隔离腔共培养体系对T淋巴细胞增殖反应的作用
与A组直接接触培养结果相似，C组各密度级别未诱导UCB-MSCs均可显著抑制T淋巴细胞增殖反应，且抑制效果呈细胞数量依赖性，1 ×104个/孔和1 ×105个/孔时抑制增殖效果显著高于密度为1 ×102个/孔和1 ×103个/孔时，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。在细胞密度≥1 ×103个/孔时，A、C组UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖的抑制效果均显著高于B、D组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。A～D组各密度级别UCB-MSCs刺激T淋巴细胞增殖的效果均显著低于E组（P＜ 0.05），而A、C组间和B、D组间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见图 7。
3 讨论
种子细胞是组织工程骨的重要研究内容之一，但种子细胞来源受限却影响了组织工程骨的实际应用。UCB-MSCs来源丰富，取材简便，具有作为组织工程种子细胞的潜在优势。我们前期研究结果表明人UCB-MSCs具有多向分化潜能，在长期体外培养过程中仍能保持成骨分化能力，并且应用成骨分化的UCB-MSCs作为种子细胞成功修复了裸大鼠颅骨标准缺损[5-6]。UCB-MSCs具有较低的免疫原性，本次实验重点针对成骨分化的UCB-MSCs免疫原性进行观察与检测。我们选择成骨诱导2周的UCB-MSCs细胞进行检测，因为此时细胞已分化为成骨细胞（茜素红染色为阳性），但细胞外基质的钙化程度对细胞消化、分离等实验操作无显著影响[15]。
流式细胞仪检测结果发现，正常状态下UCB-MSCs表达HLA-Ⅰ类分子，不表达HLA-Ⅱ类分子；在应用IFN-γ刺激后，HLA-Ⅱ类分子表达明显增高。表明UCB-MSCs具有弱免疫原性，与既往实验报道结果一致[10-13]。成骨诱导分化后的UCB-MSCs同样表达HLA-Ⅰ类分子，并且HLA-Ⅱ类分子的阳性表达率比未诱导细胞升高，提示其免疫原性较正常UCB-MSCs发生了改变，与IFN-γ的刺激效果相似。
我们以混合T淋巴细胞反应模拟体内免疫微环境条件，观察成骨诱导分化的UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖反应的免疫调节作用。T淋巴细胞增殖实验结果表明，正常状态下UCB-MSCs不能刺激异体T淋巴细胞增殖；在经IFN-γ刺激后，HLA-Ⅱ类分子表达增高，但仍未刺激T淋巴细胞增殖升高。上述结果与既往实验报道[10-13]一致，表明未经成骨诱导分化的UCB-MSCs具有抑制混合T淋巴细胞反应的免疫调节功能，且此种负向免疫调节功能呈细胞数量依赖性，而与HLA-Ⅱ类分子的表达无关。但是经成骨诱导分化后，抑制T淋巴细胞增殖的效果明显低于未分化细胞，且不存在细胞数量依赖性。应用IFN-γ刺激后，成骨分化UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖的抑制作用基本消失，表明其免疫原性的改变与HLA-Ⅱ类分子表达升高有关。
为了进一步观察UCB-MSCs对非特异性淋巴细胞增殖反应的作用，我们先以PHA刺激T淋巴细胞增殖。结果发现1 ×104个/孔及以上数量级的未分化UCB-MSCs可抑制PHA刺激的T淋巴细胞增殖，但这种抑制效果能够被IL-2所逆转。而不同数量级的成骨分化UCB-MSCs对PHA刺激的T淋巴细胞增殖反应无抑制效果，不论是否添加IL-2均无逆转。
Transwell通透性隔离腔膜片的孔径为0.3 µm，因此采用Transwell培养法既可有效隔离UCB-MSCs与T淋巴细胞的相互接触，又能够保证大分子物质在隔离腔内外自由弥散，以判断UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖反应的影响是否为细胞间的直接接触所致。研究发现，隔离腔培养与直接接触培养的实验结果一致，即成骨分化的UCB-MSCs对T淋巴细胞增殖反应的抑制效果显著低于未分化的UCB-MSCs。表明UCB-MSCs对混合T淋巴细胞增殖反应的抑制作用不依赖于细胞间的直接接触，可能与UCB-MSCs分泌的免疫原性相关细胞因子有关[16-18]。
综上述，本实验结果显示，经成骨诱导分化的UCB-MSCs不再具有未分化状态细胞的低免疫原性和调节免疫反应的能力，不能抑制混合T淋巴细胞的体外增殖反应，也不适合作为异源性骨组织工程或细胞治疗的种子细胞来源。下一步我们将重点观察此种免疫调控机制改变与经体外成骨诱导分化后UCB-MSCs分泌的细胞因子和免疫原性膜蛋白的相关性。
