引用本文： 程相国, 胡斌, 盛加根, 张长青. 应用基因芯片技术对激素性股骨头缺血性坏死差异表达基因筛选的初步研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(5): 586-590. doi: 10.7507/1002-1892.20140131 复制
股骨头缺血性坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是由多种病因引起股骨头血供障碍所致，其致残率高，是临床亟待解决的重大难题[1-3]。其中糖皮质激素引起的ONFH占非创伤性ONFH的首位[1-4]，其发病机制有10余种假说，主要包括脂质代谢紊乱、骨内压增高、BMSCs的成脂分化、微血管损伤及血管内凝血等，目前倾向于为多因素所致[5-11]。研究表明，不同人群对糖皮质激素的反应存在个体差异[12]，但罕见在基因水平分析该差异表达的研究报道。基因芯片技术能对微量样品中核酸序列进行检测和分析，具有快速、准确、高效等特点，已广泛应用于分子生物学研究领域 [13]。本研究采用基因芯片技术检测激素性ONFH骨组织和正常骨组织中基因表达的差异，筛选相关基因群，为进一步研究ONFH的发病机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
Trizol（Invitrogen公司，美国）；Cy3-dUTP、Cy5-dUTP（Amersham-Pharmacia公司，英国）；焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC；上海生工生物工程有限公司）。Agilent扫描仪（GenePix公司，美国）；PCR仪（Bio-Rad公司，美国）；台式多功能冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）；杂交箱（UVP公司，美国）；GeneSpring分析软件（Agilent公司，美国）；Cluster分析软件（美国斯坦福大学）。
1.2 实验标本
本实验共纳入4例股骨头组织标本。其中3例由激素性ONFH男性患者自愿捐赠，为吻合血管游离腓骨移植术中切取的坏死股骨头组织；患者年龄分别为25、31、38岁；应用糖皮质激素治疗的原发病分别为面神经麻痹、动眼神经麻痹和脑外伤；每例患者激素累计用量均超过1 800 mg；接受糖皮质激素治疗距发生ONFH时间为6～32个月，平均20个月；均经MRI检查确诊。另1例取自因交通意外死亡的26岁健康男性捐献者尸体，X线片检查证实双侧髋关节无异常改变。4例股骨头组织均制备为1 cm × 1 cm × 1 cm大小标本，取一部分置于4%多聚甲醛溶液固定，另一部分经DEPC漂洗后液氮冻存备用。
1.3 观测指标
1.3.1 组织学检查
取4%多聚甲醛溶液固定24 h的标本，EDTA微波脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，5 μm厚切片，常规HE染色，光镜下观察。
1.3.2 总RNA抽提
取液氮冻存标本，每例100 mg，分别置于液氮预冷的研钵中研磨成粉末状。加入1 mL Trizol，混匀静置5 min；加入0.2 mL氯仿，充分混匀，室温静置3 min；4℃以12 000 × g 离心15 min。取上清液，加入0.5 mL异丙醇，室温静置10 min；同上法离心10 min。弃上清，加入1 mL预冷的75%乙醇溶液洗涤；4℃以7 500 × g 离心5 min。弃上清，气干沉淀5～10 min，加入20～30 μL无核酸酶纯水完全溶解沉淀并保存于-80℃。对总RNA的纯度进行电泳测定。
1.3.3 基因芯片技术筛选差异表达基因
采用逆转录标记法进行探针标记。用Cy3-dUTP标记正常股骨头组织的RNA，Cy5-dUTP标记激素性ONFH骨组织的RNA。将预杂交后的芯片置于95℃水浴中变性30 s，浸无水乙醇30 s；探针置于95℃水浴中变性2 min，取出后迅速置于冰上。然后将探针置于芯片上，盖玻片覆盖，放入42℃杂交箱内，避光杂交18 h后洗涤。将分别装有溶液Ⅰ（1 × SSC + 0.2% SDS）、溶液Ⅱ（1 × SSC + 0.2% Tween）的染色缸，置于25℃水浴锅中。杂交后的芯片依次浸入以上2个染色缸中洗涤6 min，0.1 × SSC 冲洗玻片，室温下晾干。使用Agilent扫描仪获取图像，扫描像素值10 μm。将Cy3和Cy5的原始信号数据导入GeneSpring分析软件进行数据分析和标准化处理，Cluster分析软件进行层级聚类分析。采用标准化后的Cy3和Cy5值计算Cy3/Cy5比值，比值＜ 0.5为表达减弱，比值＞ 2为表达增强。
2 结果
2.1 组织学观察
镜下观察示，正常股骨头标本可见由板层骨构成的完整骨单位，板层骨连续完整，围绕血管呈同心圆排列，骨小梁陷窝内可见正常骨细胞（图 1 a）。激素性ONFH标本可见髓腔内脂肪组织、脂肪细胞增多并充填于髓腔，微血管受挤压；骨小梁内骨细胞减少，核染色质深染，细胞核固缩、裂解或消失；部分骨陷窝中骨细胞消失，骨小梁变细、稀疏、中断，单位视野内骨组织面积减小（图 1 b）。
图1
组织学观察股骨头组织（HE × 20） ⓐ 正常股骨头标本 ⓑ 激素性ONFH标本
Figure1.
The histological observation of the femoral head tissue (HE × 20) ⓐ Normal femoral head ⓑ Steroid-induced ONFH
2.2 总RNA抽提结果
总RNA抽提电泳图显示，4个样本总RNA 28S、18S的条带清晰，亮度比约为2∶1，提示总RNA质量好，可以进行芯片实验。见图 2。
图2
总RNA抽提电泳图 1～3：激素性ONFH标本 4：正常股骨头标本
Figure2.
The electrophoretogram of total RNA 1-3: Steroid-induced ONFH 4: Normal femoral head
2.3 差异表达基因筛选
4例样本完成3组基因芯片。与正常股骨头组织相比，1号患者上调基因140条，下调基因123条；2号患者上调基因118条，下调基因123条；3号患者上调基因120条，下调基因73条。其中44条基因在3张芯片中均出现差异表达，其中上调基因28条，下调基因16条。将其按功能分析并大体归为7大类：细胞代谢基因、信号转导基因、基因与蛋白表达基因、细胞分裂基因、细胞防御基因、细胞结构/细胞运动基因以及未分类基因。见表 1、2。
表1
表达上调的基因名称和功能分类
Table1.
Name and functional classification of the up-regulated expression genes
表2
表达下调基因的名称和功能分类
Table2.
Name and functional classification of the down-regulated expression genes
3 讨论
基因芯片又称基因微矩阵或cDNA微矩阵，是将大量靶基因片段有序、高密度排列在玻璃或硅胶等载体上，再将样品用荧光染料标记制备成探针，与芯片进行分子杂交，检测杂交信号强度，并经计算机分析和数据处理，对基因序列和功能进行大规模、高通量的研究[14]。本研究主要通过基因芯片技术检测激素性ONFH组织和正常股骨头组织中基因表达的差异，筛选出相关基因群，尝试从基因水平揭示激素性ONFH的发病机制。
本项研究应用含有12 722个基因的基因芯片技术，在全基因组范围内比较正常股骨头组织与激素性ONFH组织之间基因表达差异，发现了44条表达有显著差异的基因，其中上调基因28条，下调基因16条，涉及7大类基因。将筛选出的基因在Gene Bank进行检索分析，选出与骨代谢密切相关的TSG101基因及SMAD5基因进行分析。
3.1 TSG101
TSG101基因是一个泛表达基因，几乎表达于所有组织，脑及妊娠期乳腺表达水平最高，肝脏中最低[15-16]。TSG101蛋白无论在小鼠或人细胞中均维持稳定含量，含量不足或过量均可引起细胞转化或细胞周期紊乱[17]。Wagner等[18]的研究结果显示，外源性TSG101基因过度表达可造成内生性及外源性TSG101蛋白降解，以免TSG101蛋白在细胞中堆积；而TSG101蛋白的连续过表达将加速细胞内所有TSG101蛋白降解，使细胞内TSG101蛋白被外源性TSG101蛋白取代。Ma等 [19] 报道，当小鼠体内TSG101缺乏时可导致p53蓄积及细胞分化增殖障碍，从而导致细胞凋亡。同时，TSG101还参与了缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α） 的表达，而HIF-1α的高表达与激素性ONFH的发生密切相[20-21]，但TSG101的表达与ONFH的关系有待进一步分析和研究。
3.2 SMAD5
SMAD5基因是TGF-β 信号转导途径中的一个重要新基因家族--SMADs家族成员之一[22]。SMAD5基因所编码的蛋白为受体激活型SMAD，也称为途径限制型SMAD。SMAD5与SMAD1（可能还有SMAD8、9）分别与特异的Ⅰ型Ser/Thr激酶受体作用，并被磷酸化；磷酸化的SMAD与通用型SMAD形成复合物后转移至核内，调节靶基因对TGF-β的信号应答。Grönroos等[23]报道，SMAD5是BMP特异的细胞内信号转导基因，SMAD5被BMP受体磷酸化后，介导BMP信号，BMP受体对受体激活型SMADs的磷酸化，使活化的SMADs构象发生变化并从BMP受体上解离下来，并与SMAD5结合，结合后异源寡聚物转移至核内，激活特定基因的转录。BMPs除BMP-1外，同属于TGF-β超家族成员，而BMP在人体骨与软骨组织生成过程中具有重要作用。许多研究表明，SMAD5可以调节血管重塑过程，促进细胞外基质形成，促进基质细胞分化成血管平滑肌细胞并抑制血管内皮细胞生长[24-26]。目前，尚缺乏SMAD5与ONFH之间关系的相关报道，在本研究中SMAD基因上调可能与ONFH发生后的修复有关。
ONFH的发病机制十分复杂，采用基因芯片技术对其差异表达基因进行筛选，可能有助于从基因水平揭示该病的发病机制。下一步我们将应用显著性分析方法和顶级评分基因方法对数据进一步分析与挖掘，以期初步构建激素性ONFH的基因调控网络。
股骨头缺血性坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是由多种病因引起股骨头血供障碍所致，其致残率高，是临床亟待解决的重大难题[1-3]。其中糖皮质激素引起的ONFH占非创伤性ONFH的首位[1-4]，其发病机制有10余种假说，主要包括脂质代谢紊乱、骨内压增高、BMSCs的成脂分化、微血管损伤及血管内凝血等，目前倾向于为多因素所致[5-11]。研究表明，不同人群对糖皮质激素的反应存在个体差异[12]，但罕见在基因水平分析该差异表达的研究报道。基因芯片技术能对微量样品中核酸序列进行检测和分析，具有快速、准确、高效等特点，已广泛应用于分子生物学研究领域 [13]。本研究采用基因芯片技术检测激素性ONFH骨组织和正常骨组织中基因表达的差异，筛选相关基因群，为进一步研究ONFH的发病机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
Trizol（Invitrogen公司，美国）；Cy3-dUTP、Cy5-dUTP（Amersham-Pharmacia公司，英国）；焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC；上海生工生物工程有限公司）。Agilent扫描仪（GenePix公司，美国）；PCR仪（Bio-Rad公司，美国）；台式多功能冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）；杂交箱（UVP公司，美国）；GeneSpring分析软件（Agilent公司，美国）；Cluster分析软件（美国斯坦福大学）。
1.2 实验标本
本实验共纳入4例股骨头组织标本。其中3例由激素性ONFH男性患者自愿捐赠，为吻合血管游离腓骨移植术中切取的坏死股骨头组织；患者年龄分别为25、31、38岁；应用糖皮质激素治疗的原发病分别为面神经麻痹、动眼神经麻痹和脑外伤；每例患者激素累计用量均超过1 800 mg；接受糖皮质激素治疗距发生ONFH时间为6～32个月，平均20个月；均经MRI检查确诊。另1例取自因交通意外死亡的26岁健康男性捐献者尸体，X线片检查证实双侧髋关节无异常改变。4例股骨头组织均制备为1 cm × 1 cm × 1 cm大小标本，取一部分置于4%多聚甲醛溶液固定，另一部分经DEPC漂洗后液氮冻存备用。
1.3 观测指标
1.3.1 组织学检查
取4%多聚甲醛溶液固定24 h的标本，EDTA微波脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，5 μm厚切片，常规HE染色，光镜下观察。
1.3.2 总RNA抽提
取液氮冻存标本，每例100 mg，分别置于液氮预冷的研钵中研磨成粉末状。加入1 mL Trizol，混匀静置5 min；加入0.2 mL氯仿，充分混匀，室温静置3 min；4℃以12 000 × g 离心15 min。取上清液，加入0.5 mL异丙醇，室温静置10 min；同上法离心10 min。弃上清，加入1 mL预冷的75%乙醇溶液洗涤；4℃以7 500 × g 离心5 min。弃上清，气干沉淀5～10 min，加入20～30 μL无核酸酶纯水完全溶解沉淀并保存于-80℃。对总RNA的纯度进行电泳测定。
1.3.3 基因芯片技术筛选差异表达基因
采用逆转录标记法进行探针标记。用Cy3-dUTP标记正常股骨头组织的RNA，Cy5-dUTP标记激素性ONFH骨组织的RNA。将预杂交后的芯片置于95℃水浴中变性30 s，浸无水乙醇30 s；探针置于95℃水浴中变性2 min，取出后迅速置于冰上。然后将探针置于芯片上，盖玻片覆盖，放入42℃杂交箱内，避光杂交18 h后洗涤。将分别装有溶液Ⅰ（1 × SSC + 0.2% SDS）、溶液Ⅱ（1 × SSC + 0.2% Tween）的染色缸，置于25℃水浴锅中。杂交后的芯片依次浸入以上2个染色缸中洗涤6 min，0.1 × SSC 冲洗玻片，室温下晾干。使用Agilent扫描仪获取图像，扫描像素值10 μm。将Cy3和Cy5的原始信号数据导入GeneSpring分析软件进行数据分析和标准化处理，Cluster分析软件进行层级聚类分析。采用标准化后的Cy3和Cy5值计算Cy3/Cy5比值，比值＜ 0.5为表达减弱，比值＞ 2为表达增强。
2 结果
2.1 组织学观察
镜下观察示，正常股骨头标本可见由板层骨构成的完整骨单位，板层骨连续完整，围绕血管呈同心圆排列，骨小梁陷窝内可见正常骨细胞（图 1 a）。激素性ONFH标本可见髓腔内脂肪组织、脂肪细胞增多并充填于髓腔，微血管受挤压；骨小梁内骨细胞减少，核染色质深染，细胞核固缩、裂解或消失；部分骨陷窝中骨细胞消失，骨小梁变细、稀疏、中断，单位视野内骨组织面积减小（图 1 b）。
图1
组织学观察股骨头组织（HE × 20） ⓐ 正常股骨头标本 ⓑ 激素性ONFH标本
Figure1.
The histological observation of the femoral head tissue (HE × 20) ⓐ Normal femoral head ⓑ Steroid-induced ONFH
2.2 总RNA抽提结果
总RNA抽提电泳图显示，4个样本总RNA 28S、18S的条带清晰，亮度比约为2∶1，提示总RNA质量好，可以进行芯片实验。见图 2。
图2
总RNA抽提电泳图 1～3：激素性ONFH标本 4：正常股骨头标本
Figure2.
The electrophoretogram of total RNA 1-3: Steroid-induced ONFH 4: Normal femoral head
2.3 差异表达基因筛选
4例样本完成3组基因芯片。与正常股骨头组织相比，1号患者上调基因140条，下调基因123条；2号患者上调基因118条，下调基因123条；3号患者上调基因120条，下调基因73条。其中44条基因在3张芯片中均出现差异表达，其中上调基因28条，下调基因16条。将其按功能分析并大体归为7大类：细胞代谢基因、信号转导基因、基因与蛋白表达基因、细胞分裂基因、细胞防御基因、细胞结构/细胞运动基因以及未分类基因。见表 1、2。
表1
表达上调的基因名称和功能分类
Table1.
Name and functional classification of the up-regulated expression genes
表2
表达下调基因的名称和功能分类
Table2.
Name and functional classification of the down-regulated expression genes
3 讨论
基因芯片又称基因微矩阵或cDNA微矩阵，是将大量靶基因片段有序、高密度排列在玻璃或硅胶等载体上，再将样品用荧光染料标记制备成探针，与芯片进行分子杂交，检测杂交信号强度，并经计算机分析和数据处理，对基因序列和功能进行大规模、高通量的研究[14]。本研究主要通过基因芯片技术检测激素性ONFH组织和正常股骨头组织中基因表达的差异，筛选出相关基因群，尝试从基因水平揭示激素性ONFH的发病机制。
本项研究应用含有12 722个基因的基因芯片技术，在全基因组范围内比较正常股骨头组织与激素性ONFH组织之间基因表达差异，发现了44条表达有显著差异的基因，其中上调基因28条，下调基因16条，涉及7大类基因。将筛选出的基因在Gene Bank进行检索分析，选出与骨代谢密切相关的TSG101基因及SMAD5基因进行分析。
3.1 TSG101
TSG101基因是一个泛表达基因，几乎表达于所有组织，脑及妊娠期乳腺表达水平最高，肝脏中最低[15-16]。TSG101蛋白无论在小鼠或人细胞中均维持稳定含量，含量不足或过量均可引起细胞转化或细胞周期紊乱[17]。Wagner等[18]的研究结果显示，外源性TSG101基因过度表达可造成内生性及外源性TSG101蛋白降解，以免TSG101蛋白在细胞中堆积；而TSG101蛋白的连续过表达将加速细胞内所有TSG101蛋白降解，使细胞内TSG101蛋白被外源性TSG101蛋白取代。Ma等 [19] 报道，当小鼠体内TSG101缺乏时可导致p53蓄积及细胞分化增殖障碍，从而导致细胞凋亡。同时，TSG101还参与了缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α） 的表达，而HIF-1α的高表达与激素性ONFH的发生密切相[20-21]，但TSG101的表达与ONFH的关系有待进一步分析和研究。
3.2 SMAD5
SMAD5基因是TGF-β 信号转导途径中的一个重要新基因家族--SMADs家族成员之一[22]。SMAD5基因所编码的蛋白为受体激活型SMAD，也称为途径限制型SMAD。SMAD5与SMAD1（可能还有SMAD8、9）分别与特异的Ⅰ型Ser/Thr激酶受体作用，并被磷酸化；磷酸化的SMAD与通用型SMAD形成复合物后转移至核内，调节靶基因对TGF-β的信号应答。Grönroos等[23]报道，SMAD5是BMP特异的细胞内信号转导基因，SMAD5被BMP受体磷酸化后，介导BMP信号，BMP受体对受体激活型SMADs的磷酸化，使活化的SMADs构象发生变化并从BMP受体上解离下来，并与SMAD5结合，结合后异源寡聚物转移至核内，激活特定基因的转录。BMPs除BMP-1外，同属于TGF-β超家族成员，而BMP在人体骨与软骨组织生成过程中具有重要作用。许多研究表明，SMAD5可以调节血管重塑过程，促进细胞外基质形成，促进基质细胞分化成血管平滑肌细胞并抑制血管内皮细胞生长[24-26]。目前，尚缺乏SMAD5与ONFH之间关系的相关报道，在本研究中SMAD基因上调可能与ONFH发生后的修复有关。
ONFH的发病机制十分复杂，采用基因芯片技术对其差异表达基因进行筛选，可能有助于从基因水平揭示该病的发病机制。下一步我们将应用显著性分析方法和顶级评分基因方法对数据进一步分析与挖掘，以期初步构建激素性ONFH的基因调控网络。
