引用本文： 拓振合, 赵琳, 王栓科, 鲁永婷, 任广铁, 张苍宇, 庾佳佳, 孙瑞, 汪静. 组织工程骨膜及脱蛋白骨辅助支架修复兔桡骨大段骨缺损. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(4): 511-516. doi: 10.7507/1002-1892.20140115 复制
四肢长骨易受外界暴力致伤，也是骨肿瘤好发部位，加上感染及医源性因素，致使长骨大段骨缺损患者数量巨大。传统治疗方法主要有自体、同种异体骨移植修复，但自体骨移植取骨量大、增加额外创伤和感染率，同种异体骨来源有限、生物活性差，且存在免疫排斥和传染疾病等缺陷，限制了其临床广泛应用。近年来，骨组织工程的迅速发展为临床治疗长骨大段骨缺损带来了希望[1]。本实验将目前研究较为成熟的BMSCs成骨诱导后作为种子细胞复合猪小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）构建组织工程骨膜，并以同种异体脱蛋白骨（deproteinized bone，DPB）作为组织工程骨膜的辅助内支撑物，探索其体内修复兔桡骨大段骨缺损的可行性，为将来临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
1月龄清洁级新西兰大白兔3只，雌雄不限，体重0.5～0.6 kg；4月龄清洁级新西兰大白兔60只，雌雄不限，体重2～3 kg；均由兰州大学实验动物中心提供。健康成年家猪1只，由兰州市肉联厂提供。
L/H-DMEM、FBS（HyClone公司，美国）；胰蛋白酶、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠（Amresco公司，美国）。倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；扫描电镜（JEOL公司，日本）。
1.2 组织工程骨膜制备
1.2.1 BMSCs分离与成骨诱导培养
取1月龄清洁级新西兰大白兔3只，按文献[2]方法分离培养BMSCs。消化收集第3代BMSCs，换用成骨诱导培养液（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C、1 × 10-8 mol/L地塞米松的H-DMEM）继续培养14 d，用于构建组织工程骨膜。倒置相差显微镜观察原代及诱导后细胞形态学变化。
1.2.2 SIS制备
健康成年家猪处死后4 h内取小肠，按文献[3]方法制备SIS，制成大小为4 cm × 4 cm。分别置入培养瓶中，每瓶1片，加入3 mL成骨诱导培养液；然后将培养瓶置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中预湿12 h后，更换成骨诱导培养液继续预湿12 h，PBS反复冲洗3次备用。
1.2.3 组织工程骨膜体外构建
消化收集成骨诱导14 d的BMSCs，以离心半径4.5 cm、1 000 r/min离心5 min，弃上清，调整细胞浓度为5 ×109个/L，立即用微量移液器滴加至培养瓶中的SIS上，每片50 μL。将培养瓶置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中静置5 h，再加入3 mL成骨诱导培养液继续培养7 d。
1.3 DPB及组织工程骨膜/DPB复合体制备
取4月龄清洁级新西兰大白兔12只，空气栓塞法处死后，切取双侧桡骨并去掉干骺端，在骨段上细密打孔若干后，按文献[4]方法进行脱蛋白处理，去除抗原性，制成仅保留无机盐成分的支架材料，封口塑料包装后以60Co辐照消毒，作为组织工程骨膜辅助内支撑物。
无菌环境下，取生理盐水浸泡8 h预湿处理后的DPB，用组织工程骨膜呈“外套状”包被，两端以可吸收缝线捆扎，使组织工程骨膜紧贴DPB，制备组织工程骨膜/DPB复合体。
1.4 动物模型制备及实验分组
取4月龄清洁级新西兰大白兔48只，随机分成A、B、C、D 4组，每组12只。各组动物均以3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定，于左前肢桡侧中段作纵切口，逐层显露桡骨中段，切除桡骨干3.5 cm长骨段，并彻底切除该段骨膜，制备左侧桡骨大段骨缺损动物模型。A组于骨缺损处植入组织工程骨膜，植入的膜状物拉伸呈圆桶状缠绕于骨缺损两断端上，膜对合缘以7-0无创伤缝线缝合，两端缝合固定于骨断端残余骨膜或周围软组织上，避免膜皱缩；B组于骨缺损处植入与缺损长度相等的DPB，紧嵌于两断端之间，接触断面打孔以可吸收缝线缝合固定；C组于骨缺损处植入组织工程骨膜/DPB复合体，同B组方法固定缝合；D组骨缺损处旷置，作为空白对照。1号丝线逐层缝合伤口。术后各组实验动物左前肢以管型石膏作保护性制动，石膏开槽以便换药及观察，4周后拆除石膏。动物分笼饲养，术后连续3 d肌肉注射青霉素4万U/d，预防感染。
1.5 观测指标
1.5.1 材料大体及扫描电镜观察
对SIS、组织工程骨膜、DPB及组织工程骨膜/DPB复合体行大体观察；对SIS和复合培养7 d的组织工程骨膜行扫描电镜观察。
1.5.2 实验动物大体观察
术后观察实验动物饮食、日常行为、切口情况及伤肢负重情况。
1.5.3 X线片观察
各组分别于术后4、8、12周随机取4只动物，对骨缺损区行X线片检查，并按Lane等[5]影像学评分标准进行评分。
1.5.4 组织学观察
各组于术后8周X线片检查后随机取4只动物，空气栓塞法处死后，取骨缺损区组织标本常规固定、脱钙、脱水、包埋、3～4 μm厚切片，行HE及Masson染色观察。
1.6 统计学方法
采用SSPS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
原代BMSCs接种3 d呈短棒形、梭形及不规则形状。第3代BMSCs经成骨诱导14 d后细胞体积增大，以三角形、方形及多边形为主。见图 1。
图1
细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 原代接种3 d BMSCs ⓑ 第3代BMSCs成骨诱导后14 d 2.2 材料大体及扫描电镜观察
SIS呈白色，薄膜状，厚度约100 μm；复合BMSCs构建的组织工程骨膜质地柔软，韧性好，外形与生理骨膜相似；DPB呈白色，质硬脆，髓腔内中空；组织工程骨膜与DPB复合后，组织工程骨膜包绕DPB，透过组织工程骨膜DPB清晰可见。见图 2。
扫描电镜观察示，单纯SIS胶原纤维纵横交错；而复合培养7 d的组织工程骨膜可见SIS上黏附大量细胞。见图 3。
2.3 实验动物大体观察
4组动物术后饮食及日常行为基本正常，切口对合良好，无红肿。术后4周拆除石膏后，伤肢基本能负重行走。
2.4 X线片观察
A组：术后4周骨缺损处有长柱状新生骨形成，并与截骨断端骨性融合，密度与正常骨相近；8周时新生骨量增多，并可见不规则骨髓腔；12周时骨髓腔已贯通。B组：术后4周可见植入的DPB，植入前DPB上所打的小孔清晰可见；8周时两截骨断端变钝，有少许延长，并可见DPB降解迹象；12周时仍可见植入的DPB，与术后8周相比降解不明显。C组：术后4周有新生骨组织包被DPB，DPB上的小孔已模糊；8周时已不见小孔，植入的组织工程骨膜/DPB复合体与截骨断端有部分骨性融合；12周时植入的组织工程骨膜/DPB复合体与截骨断端骨性融合，未见明显的植入物DPB，新生骨可见串珠状连续不规则骨髓腔。D组至12周时两截骨断端仅有少许骨性延长，骨缺损处无成骨征象，密度与周围软组织影相似。见图 4。
各组X线片评分随时间延长均逐渐递增，组内各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。术后各时间点A、C组评分显著高于B、D组，A组高于C组，B组高于D组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点各组X线片评分比较（n=4，2.5 组织学观察
HE染色：A组骨缺损处有新骨形成，骨组织中可见血管腔及不规则髓腔样结构，未见明显异物巨噬细胞及淋巴细胞浸润征象；B组骨缺损区未见明显新骨生成，仍可见植入的DPB；C组骨缺损处有新骨形成并包被植入的DPB，骨组织中可见血管腔及不规则髓腔样结构，DPB降解吸收迹象明显，DPB量明显少于B组；D组骨缺损处仅见胶原瘢痕组织形成。见图 5。
Masson染色：A组骨缺损中段处可见大量蓝染新生骨组织；B组骨缺损区仍可见植入的大量DPB，同时可见极少量新生骨；C组骨缺损处有较多蓝染新骨形成并包被植入的DPB；D组仅见蓝染的胶原纤维，未发现新生骨组织。见图 6。
图5
术后8周各组HE染色观察（× 200） 黑箭头示新生骨，白箭头示DPB，红箭头示胶原瘢痕组织 ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 3 讨论
骨膜是致密的结缔组织纤维膜，分为骨表面的骨外膜和骨髓腔面的骨内膜。骨膜细胞有MSCs的特性和良好的成骨、成软骨分化潜能[6]，自体移植能够生成骨和软骨[7]，临床已有骨膜移植修复骨缺损、骨不连的相关报道[8-9]。然而自体骨膜移植来源有限，并以牺牲自身正常组织为代价，同时供区存在感染等风险。构建组织工程骨膜应用于临床有一定实用意义。
本课题组既往采用BMSCs成骨诱后接种于SIS制备组织工程骨膜[10]，显示了较好骨缺损修复能力。本实验中BMSCs与SIS复合培养7 d后扫描电镜观察见BMSCs大量黏附于SIS上，生长状态良好，表明SIS与BMSCs之间具有良好的生物相容性，以BMSCs与SIS体外构建组织工程骨膜切实可行。
本研究动物实验结果表明，组织工程骨膜在兔体内有很强的成骨能力，可以修复兔桡骨大段骨缺损。不足的是组织工程骨膜质软，易受到肌肉等软组织挤压而变形，虽然在兔体内可修复桡骨大段骨缺损，但兔骨管腔直径与人体长管状骨相差较大，若组织工程骨膜植入体内，受挤压变形后，可能不利于形成规则的长管状骨。我们制备了DPB作为组织工程骨膜的辅助支架，设想随着新骨生成，DPB不断被吸收，其矿物质被新生骨组织所利用，达到支撑与促进新骨生成的作用。然而从本实验结果看，C组骨形成、骨连接、骨塑形方面均差于A组。原因可能有以下三方面：首先，从X线片及组织学观察结果看，DPB降解速度慢于组织工程骨膜新骨形成速度，因此制备的DPB对新骨形成起到空间位阻的负面作用，影响了组织工程骨膜在体内成骨；其次，目前普遍认为DPB只有载体作用，无成骨及成骨诱导作用，这一点与B组结果一致；第三，DPB虽然保留了原骨的三维网状孔隙结构，但细胞长入必须依赖良好的营养物质供应，而体内只有距毛细血管20～200 μm的细胞才能通过弥散作用获得营养[11]，故由于营养物质缺乏，细胞很难长入DPB，而单纯组织工程骨膜在成骨同时建立了较完善的显微脉管系统，保证了营养物质的供应。我们按文献[4]方法制备的DPB质硬脆，强度差，究其原因可能是蛋白质和胶原纤维被彻底破坏。脱蛋白越完全，其生物相容性越好，但生物力学强度越差[12]。有学者通过改良方法制备DPB，尽量保留胶原蛋白，去除非胶原蛋白及肽类等，以达到降低抗原的同时保留力学强度[13]。
综上述，体外构建组织工程骨膜切实可行，组织工程骨膜在兔体内有较强的成骨能力，可修复兔桡骨大段骨缺损，但DPB作为组织工程骨膜的辅助支架效果欠佳，有待进一步探索。在今后研究中，需要进一步进行改良、修饰DPB相关的实验研究，使其有更好的力学强度及生物相容性，或者探索其他材料如金属、生物降解陶瓷等作为组织工程骨膜的辅助支架。本实验不足之处包括未进行新生骨骨密度测定及生物力学检测等；以及种子细胞大量扩增后遗传物质有无改变，成骨诱导后的细胞远期生物安全性问题及组织工程骨膜体内成骨的机制等，均有待深入研究明确。
四肢长骨易受外界暴力致伤，也是骨肿瘤好发部位，加上感染及医源性因素，致使长骨大段骨缺损患者数量巨大。传统治疗方法主要有自体、同种异体骨移植修复，但自体骨移植取骨量大、增加额外创伤和感染率，同种异体骨来源有限、生物活性差，且存在免疫排斥和传染疾病等缺陷，限制了其临床广泛应用。近年来，骨组织工程的迅速发展为临床治疗长骨大段骨缺损带来了希望[1]。本实验将目前研究较为成熟的BMSCs成骨诱导后作为种子细胞复合猪小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）构建组织工程骨膜，并以同种异体脱蛋白骨（deproteinized bone，DPB）作为组织工程骨膜的辅助内支撑物，探索其体内修复兔桡骨大段骨缺损的可行性，为将来临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
1月龄清洁级新西兰大白兔3只，雌雄不限，体重0.5～0.6 kg；4月龄清洁级新西兰大白兔60只，雌雄不限，体重2～3 kg；均由兰州大学实验动物中心提供。健康成年家猪1只，由兰州市肉联厂提供。
L/H-DMEM、FBS（HyClone公司，美国）；胰蛋白酶、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠（Amresco公司，美国）。倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；扫描电镜（JEOL公司，日本）。
1.2 组织工程骨膜制备
1.2.1 BMSCs分离与成骨诱导培养
取1月龄清洁级新西兰大白兔3只，按文献[2]方法分离培养BMSCs。消化收集第3代BMSCs，换用成骨诱导培养液（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C、1 × 10-8 mol/L地塞米松的H-DMEM）继续培养14 d，用于构建组织工程骨膜。倒置相差显微镜观察原代及诱导后细胞形态学变化。
1.2.2 SIS制备
健康成年家猪处死后4 h内取小肠，按文献[3]方法制备SIS，制成大小为4 cm × 4 cm。分别置入培养瓶中，每瓶1片，加入3 mL成骨诱导培养液；然后将培养瓶置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中预湿12 h后，更换成骨诱导培养液继续预湿12 h，PBS反复冲洗3次备用。
1.2.3 组织工程骨膜体外构建
消化收集成骨诱导14 d的BMSCs，以离心半径4.5 cm、1 000 r/min离心5 min，弃上清，调整细胞浓度为5 ×109个/L，立即用微量移液器滴加至培养瓶中的SIS上，每片50 μL。将培养瓶置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中静置5 h，再加入3 mL成骨诱导培养液继续培养7 d。
1.3 DPB及组织工程骨膜/DPB复合体制备
取4月龄清洁级新西兰大白兔12只，空气栓塞法处死后，切取双侧桡骨并去掉干骺端，在骨段上细密打孔若干后，按文献[4]方法进行脱蛋白处理，去除抗原性，制成仅保留无机盐成分的支架材料，封口塑料包装后以60Co辐照消毒，作为组织工程骨膜辅助内支撑物。
无菌环境下，取生理盐水浸泡8 h预湿处理后的DPB，用组织工程骨膜呈“外套状”包被，两端以可吸收缝线捆扎，使组织工程骨膜紧贴DPB，制备组织工程骨膜/DPB复合体。
1.4 动物模型制备及实验分组
取4月龄清洁级新西兰大白兔48只，随机分成A、B、C、D 4组，每组12只。各组动物均以3%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定，于左前肢桡侧中段作纵切口，逐层显露桡骨中段，切除桡骨干3.5 cm长骨段，并彻底切除该段骨膜，制备左侧桡骨大段骨缺损动物模型。A组于骨缺损处植入组织工程骨膜，植入的膜状物拉伸呈圆桶状缠绕于骨缺损两断端上，膜对合缘以7-0无创伤缝线缝合，两端缝合固定于骨断端残余骨膜或周围软组织上，避免膜皱缩；B组于骨缺损处植入与缺损长度相等的DPB，紧嵌于两断端之间，接触断面打孔以可吸收缝线缝合固定；C组于骨缺损处植入组织工程骨膜/DPB复合体，同B组方法固定缝合；D组骨缺损处旷置，作为空白对照。1号丝线逐层缝合伤口。术后各组实验动物左前肢以管型石膏作保护性制动，石膏开槽以便换药及观察，4周后拆除石膏。动物分笼饲养，术后连续3 d肌肉注射青霉素4万U/d，预防感染。
1.5 观测指标
1.5.1 材料大体及扫描电镜观察
对SIS、组织工程骨膜、DPB及组织工程骨膜/DPB复合体行大体观察；对SIS和复合培养7 d的组织工程骨膜行扫描电镜观察。
1.5.2 实验动物大体观察
术后观察实验动物饮食、日常行为、切口情况及伤肢负重情况。
1.5.3 X线片观察
各组分别于术后4、8、12周随机取4只动物，对骨缺损区行X线片检查，并按Lane等[5]影像学评分标准进行评分。
1.5.4 组织学观察
各组于术后8周X线片检查后随机取4只动物，空气栓塞法处死后，取骨缺损区组织标本常规固定、脱钙、脱水、包埋、3～4 μm厚切片，行HE及Masson染色观察。
1.6 统计学方法
采用SSPS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
原代BMSCs接种3 d呈短棒形、梭形及不规则形状。第3代BMSCs经成骨诱导14 d后细胞体积增大，以三角形、方形及多边形为主。见图 1。
图1
细胞形态学观察（倒置相差显微镜×100） ⓐ 原代接种3 d BMSCs ⓑ 第3代BMSCs成骨诱导后14 d 2.2 材料大体及扫描电镜观察
SIS呈白色，薄膜状，厚度约100 μm；复合BMSCs构建的组织工程骨膜质地柔软，韧性好，外形与生理骨膜相似；DPB呈白色，质硬脆，髓腔内中空；组织工程骨膜与DPB复合后，组织工程骨膜包绕DPB，透过组织工程骨膜DPB清晰可见。见图 2。
扫描电镜观察示，单纯SIS胶原纤维纵横交错；而复合培养7 d的组织工程骨膜可见SIS上黏附大量细胞。见图 3。
2.3 实验动物大体观察
4组动物术后饮食及日常行为基本正常，切口对合良好，无红肿。术后4周拆除石膏后，伤肢基本能负重行走。
2.4 X线片观察
A组：术后4周骨缺损处有长柱状新生骨形成，并与截骨断端骨性融合，密度与正常骨相近；8周时新生骨量增多，并可见不规则骨髓腔；12周时骨髓腔已贯通。B组：术后4周可见植入的DPB，植入前DPB上所打的小孔清晰可见；8周时两截骨断端变钝，有少许延长，并可见DPB降解迹象；12周时仍可见植入的DPB，与术后8周相比降解不明显。C组：术后4周有新生骨组织包被DPB，DPB上的小孔已模糊；8周时已不见小孔，植入的组织工程骨膜/DPB复合体与截骨断端有部分骨性融合；12周时植入的组织工程骨膜/DPB复合体与截骨断端骨性融合，未见明显的植入物DPB，新生骨可见串珠状连续不规则骨髓腔。D组至12周时两截骨断端仅有少许骨性延长，骨缺损处无成骨征象，密度与周围软组织影相似。见图 4。
各组X线片评分随时间延长均逐渐递增，组内各时间点间比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。术后各时间点A、C组评分显著高于B、D组，A组高于C组，B组高于D组，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。
表1
术后各时间点各组X线片评分比较（n=4，2.5 组织学观察
HE染色：A组骨缺损处有新骨形成，骨组织中可见血管腔及不规则髓腔样结构，未见明显异物巨噬细胞及淋巴细胞浸润征象；B组骨缺损区未见明显新骨生成，仍可见植入的DPB；C组骨缺损处有新骨形成并包被植入的DPB，骨组织中可见血管腔及不规则髓腔样结构，DPB降解吸收迹象明显，DPB量明显少于B组；D组骨缺损处仅见胶原瘢痕组织形成。见图 5。
Masson染色：A组骨缺损中段处可见大量蓝染新生骨组织；B组骨缺损区仍可见植入的大量DPB，同时可见极少量新生骨；C组骨缺损处有较多蓝染新骨形成并包被植入的DPB；D组仅见蓝染的胶原纤维，未发现新生骨组织。见图 6。
图5
术后8周各组HE染色观察（× 200） 黑箭头示新生骨，白箭头示DPB，红箭头示胶原瘢痕组织 ⓐ A组 ⓑ B组 ⓒ C组 ⓓ D组 3 讨论
骨膜是致密的结缔组织纤维膜，分为骨表面的骨外膜和骨髓腔面的骨内膜。骨膜细胞有MSCs的特性和良好的成骨、成软骨分化潜能[6]，自体移植能够生成骨和软骨[7]，临床已有骨膜移植修复骨缺损、骨不连的相关报道[8-9]。然而自体骨膜移植来源有限，并以牺牲自身正常组织为代价，同时供区存在感染等风险。构建组织工程骨膜应用于临床有一定实用意义。
本课题组既往采用BMSCs成骨诱后接种于SIS制备组织工程骨膜[10]，显示了较好骨缺损修复能力。本实验中BMSCs与SIS复合培养7 d后扫描电镜观察见BMSCs大量黏附于SIS上，生长状态良好，表明SIS与BMSCs之间具有良好的生物相容性，以BMSCs与SIS体外构建组织工程骨膜切实可行。
本研究动物实验结果表明，组织工程骨膜在兔体内有很强的成骨能力，可以修复兔桡骨大段骨缺损。不足的是组织工程骨膜质软，易受到肌肉等软组织挤压而变形，虽然在兔体内可修复桡骨大段骨缺损，但兔骨管腔直径与人体长管状骨相差较大，若组织工程骨膜植入体内，受挤压变形后，可能不利于形成规则的长管状骨。我们制备了DPB作为组织工程骨膜的辅助支架，设想随着新骨生成，DPB不断被吸收，其矿物质被新生骨组织所利用，达到支撑与促进新骨生成的作用。然而从本实验结果看，C组骨形成、骨连接、骨塑形方面均差于A组。原因可能有以下三方面：首先，从X线片及组织学观察结果看，DPB降解速度慢于组织工程骨膜新骨形成速度，因此制备的DPB对新骨形成起到空间位阻的负面作用，影响了组织工程骨膜在体内成骨；其次，目前普遍认为DPB只有载体作用，无成骨及成骨诱导作用，这一点与B组结果一致；第三，DPB虽然保留了原骨的三维网状孔隙结构，但细胞长入必须依赖良好的营养物质供应，而体内只有距毛细血管20～200 μm的细胞才能通过弥散作用获得营养[11]，故由于营养物质缺乏，细胞很难长入DPB，而单纯组织工程骨膜在成骨同时建立了较完善的显微脉管系统，保证了营养物质的供应。我们按文献[4]方法制备的DPB质硬脆，强度差，究其原因可能是蛋白质和胶原纤维被彻底破坏。脱蛋白越完全，其生物相容性越好，但生物力学强度越差[12]。有学者通过改良方法制备DPB，尽量保留胶原蛋白，去除非胶原蛋白及肽类等，以达到降低抗原的同时保留力学强度[13]。
综上述，体外构建组织工程骨膜切实可行，组织工程骨膜在兔体内有较强的成骨能力，可修复兔桡骨大段骨缺损，但DPB作为组织工程骨膜的辅助支架效果欠佳，有待进一步探索。在今后研究中，需要进一步进行改良、修饰DPB相关的实验研究，使其有更好的力学强度及生物相容性，或者探索其他材料如金属、生物降解陶瓷等作为组织工程骨膜的辅助支架。本实验不足之处包括未进行新生骨骨密度测定及生物力学检测等；以及种子细胞大量扩增后遗传物质有无改变，成骨诱导后的细胞远期生物安全性问题及组织工程骨膜体内成骨的机制等，均有待深入研究明确。
