引用本文： 林强, 蔡杨庭, 李皓莘. 负载浓度梯度NGF的周围神经导管修复大鼠周围神经缺损的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2014, 28(2): 167-172. doi: 10.7507/1002-1892.20140037 复制
周围神经损伤是临床常见的创伤并发症，受损神经的再生及功能修复是临床难题。近年来，应用组织工程技术构建具有良好生物相容性的周围神经导管修复神经损伤，成为研究热点[1]。研究表明，周围神经导管上负载生长因子能显著提高神经修复效果。在神经系统发育过程中，生长因子呈浓度梯度分布，形成一种空间或方向信号，引导轴突再生[2]。理论上，将生长因子呈浓度梯度负载于周围神经导管上，更接近生理结构。为此，我们利用吸附丝蛋白/NGF的时间差异，制备负载浓度梯度NGF的周围神经导管，并建立大鼠坐骨神经缺损模型，用该周围神经导管桥接缺损神经，探讨其修复效果，以期为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康雄性成年SD大鼠24只，体重220～250 g，由中山大学实验动物中心提供。B.mori蚕丝（浙江衢州市桑蚕协会）；聚己内酯-丙交酯嵌段共聚物[poly（ε-caprolactone）-block-poly（L-lactide-co-ε-caprolactone），PCL-b-P（LLA-co-CL）] 由广州医学院朱继翔博士提供；四氢呋喃（广州化学试剂厂）；NGF（PeproTech公司，美国）；ELISA试剂盒（Becton Dickinson公司，美国）。玻璃干燥器（四川蜀牛玻璃仪器厂）；微量注射泵（KD Scientific公司，美国）；Image J分析软件（Bethesda公司，美国）；透射电镜（Hitachi公司，日本）。
1.2 负载浓度梯度NGF的周围神经导管制备及检测
1.2.1 丝蛋白制备
称取干燥蚕丝8 g，放入饱和Na2CO3溶液中煮沸，每3小时更换新鲜饱和Na2CO3 溶液1次，共3次；过滤，干燥，获得纯丝蛋白。将纯丝蛋白溶解于LiBr（1 g/mL）水溶液中制得10%丝蛋白溶液，将丝蛋白溶液放入截留分子量为5 000的透析袋中，用超纯水透析3 d；每半天更换透析液1次，除去LiBr；定容后获得3%丝蛋白溶液，置于4℃冰箱备用[3]。
1.2.2 周围神经导管制备
于55℃水浴条件下，将PCL-b-P（LLA-co-CL）溶解于四氢呋喃中，配制成6%溶液。将其注入内径1.5 mm、外径3.0 mm、长15 mm的圆柱形模具中；迅速降温至- 40℃，凝胶化3 h；- 40℃无水乙醇浸泡，置换样品中的四氢呋喃，每隔6 h更换1次无水乙醇，共6次；置于4℃去离子水浸泡，置换样品中的无水乙醇，每隔6 h更换1次去离子水，共6次； - 20℃冷冻干燥5 d，取出后室温真空干燥1 d，置于干燥器中备用[4]。
1.2.3 均匀负载NGF
取周围神经导管置于无水乙醇中，真空（0.04 MPa）除气1 h；PBS清洗3次，每次10 min，除去乙醇。将10 μg NGF溶解于1 mL 3%丝蛋白溶液中；将除气后的周围神经导管浸泡于含丝蛋白和NGF的混合溶液中，4℃、摇床40 r/min浸泡2 h； PBS清洗5 min；浸入90%甲醇溶液10 min；超纯水清洗3次，每次5 min。获得均匀负载NGF的周围神经导管，备用[5]。
1.2.4 浓度梯度负载NGF
将10 μg NGF溶解于1 mL 3%丝蛋白溶液。取已除气的周围神经导管竖立固定于长10 mm、宽5 mm、高50 mm的玻璃器皿。使用微量注射泵将含有NGF的丝蛋白溶液按照3.2 μL/ min 注入玻璃器皿中，4 h后停止注射，此时液面稍没过样品上缘。取出导管，PBS清洗5 min；浸入90%甲醇溶液中 10 min； PBS清洗3次，每次5 min。获得浓度梯度负载NGF的周围神经导管，备用。
1.2.5 NGF释放检测
取均匀负载NGF和浓度梯度负载NGF的两种周围神经导管，平均切割成5段，每段3 mm。将样品分别置于1 mL塑料试管中，加入400 μL PBS液。于37℃、摇床40 r/ min条件下，分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周取PBS液，用ELISA试剂盒检测NGF含量，取均值，并制作缓释曲线，计算12周累积释放量。各时间点均更换新鲜PBS 液。
1.3 实验方法及分组
取24只SD大鼠，以10%水合氯醛（0.4 mL/ kg）腹腔注射麻醉后，于右下肢后部作斜形切口，长约20 mm。钝性分离皮下，沿后外侧肌间隙钝性分离至闭孔处，显露并切除5 mm长坐骨神经，使其自然回缩，制备14 mm长坐骨神经缺损模型。根据修复方法不同，将大鼠随机分为A、B、C、D 4组（n=6）：分别采用单纯周围神经导管、均匀负载NGF的周围神经导管、浓度梯度负载NGF的周围神经导管、自体神经修复缺损。A、B、C组：将导管两端套于坐骨神经两断端，每端套入长约 0.5 mm，采用9-0显微缝合线固定1针，以防大鼠肢体活动时神经脱出导管。D组：采用9-0显微缝线将切取的自体神经直接与两断端缝合修复。间断缝合肌筋膜，缝合皮肤。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况
术后观察各组大鼠存活、切口愈合及肢体运动情况。
1.4.2 大体观察
术后12周，各组大鼠同上法麻醉后，沿原切口入路显露坐骨神经，大体观察A、B、C组移植物形态及桥接的神经有无脱出。
1.4.3 电生理检测
大体观察后，用双根银丝刺激电极置于各组缺损桥接物近端神经干及腓总神经横跨腓骨肌处，两刺激电极间距为2 cm。同心针记录双电极45°斜行插入腓肠肌肌腹中部，记录诱发的复合肌肉动作电位波幅；刺激强度750 mV，刺激频率1 Hz，持续时间1 ms。同时测定健侧腓肠肌的复合肌肉动作电位波幅，将各组结果与健侧值进行比较，并以与健侧值的百分比表示复合肌肉动作电位结果[6]。
1.4.4 组织学观察
电生理检测后取移植物和所支配的腓肠肌。将移植物置于2.5%戊二醛固定3 h，丙酮逐级脱水，Epon812环氧树脂包埋剂与100%丙酮按1∶1比例浸泡包埋。取移植物中段先行半薄切片，片厚1 μm，常规甲苯胺蓝溶液染色，光镜下观察轴突。于400倍镜下，每组取5张切片，每张切片取5个视野，采用Image J分析软件计数轴突，观察再生的神经横截面积，按以下公式计算轴突密度，轴突密度=轴突总数 /神经横截面积）[7]。
将腓肠肌标本置入4%多聚甲醛固定5 h，30%蔗糖溶液脱水，OCT包埋后冰冻切片，行HE染色，光镜下观察肌肉及胶原纤维。于400倍镜下，每组取5张切片，每张切片取5个视野，采用Image J分析软件测量肌纤维横截面积。
1.4.5 透射电镜观察
取1.4.4中切片再行超薄切片，片厚60 nm，用醋酸铀及硝酸铅双重染色，透射电镜观察再生神经纤维超微结构。于5 800倍镜下，每组取5 张切片，每张切片取10个视野，采用Image J分析软件测量髓鞘厚度及轴突直径，取均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 NGF释放检测
随着时间延长，两种周围神经导管NGF累积释放量均不断增加，各时间点两组间比较差异均无统计学意义（P＞ 0.05），见图 1。浓度梯度负载NGF和均匀负载NGF的导管12周内NGF累积释放量分别为（14.2 ± 1.4）、（13.7 ± 1.3）ng/mg，两组比较差异无统计学意义（t=0.564，P=0.570）。
图1
两种周围神经导管NGF缓释曲线 2.2 一般情况
大鼠切口均Ⅰ期愈合，存活至实验完成。术后4 d各组大鼠均出现足底溃疡，3周时最严重，之后逐渐愈合，至12周时足底溃疡基本愈合；其中C、D组大鼠愈合情况优于A、B组。
2.3 大体观察
术后12周，A、B、C组移植物贴附于一侧肌肉，表面已完全血管化，有结缔组织包裹，神经导管与坐骨神经两端连接，未见神经瘤形成。见图 2。
2.4 电生理检测
术后12周，A、B、C、D组复合肌肉动作电位分别为25.1% ± 4.2%、42.3% ± 9.3%、57.1% ± 10.3%、62.1% ± 13.7 %。A组显著低于B、C、D组，B组显著低于C、D组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；C、D组间比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。
2.5 组织学观察
2.5.1 移植物
术后12 周，甲苯胺蓝染色示C、D组再生神经纤维形成大小不等的纤维束，神经纤维髓鞘化明显；A、B组观察结果与C、D组相似，但轴突分布较C、D组稀疏。见图 3。D组轴突总数显著高于A、B、C组，C组高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。C组轴突密度显著高于A、B、D组，B组高于A、D组，D组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。
表1
各组组织学及透射电镜测量指标比较（n=6，2.5.2 腓肠肌
术后12周，Masson染色示D组肌纤维最粗、胶原纤维最细，之后为C、B组，而A组肌肉萎缩最严重，有大量胶原纤维增生。见图 4。D组肌纤维横截面积显著高于A、B、C组，C组高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05），见表 1。
2.6 透射电镜观察
术后12 周，透射电镜下各组均可见再生有髓神经纤维和无髓纤维混合，雪旺细胞形态正常，包绕再生轴突形成有髓纤维，大多数髓鞘结构发育良好，呈同心圆板层样结构，少数为未完全闭合的不成熟髓鞘。其中C、D组髓鞘较厚，排列整齐，新生神经纤维较密集，神经纤维基本发育成熟。而A、B组新生神经纤维数量较少，髓鞘厚度也略小于C、D组。见图 5。
D组轴突直径显著高于A、B、C组，C组高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。C、D组髓鞘厚度比较差异无统计学意义（P＞ 0.05），但均优于A、B组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；B组优于A组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。
3 讨论
目前，许多利用组织工程原理修复周围神经损伤的效果仍不理想，主要原因是轴突生长缺乏方向性，在导管内弥漫生长[8]。在神经系统发育过程中，生长锥被多种生长因子引导，朝着靶向组织生长。这些因子被称为趋化因子或趋触因子，均呈浓度梯度分布[9]。这些呈浓度梯度分布的生长因子给予轴突生长一种空间或方向信号，能引导轴突再生[10]。如小鼠前脑的嗅球有中间神经元，其生于前脑亚室管膜层，需沿着头端迁移渠道向前迁移几毫米才能达到嗅球[11]。因此，构建组织工程神经支架时，除需负载生长因子，除需考虑长时间保持生长因子活性外，还需考虑将生长因子呈浓度梯度负载。
目前出现了一些浓度梯度负载生长因子至二维支架上的方法，如微流体法、扩散法、光雕刻法等[12-14]。但是将生长因子以浓度梯度负载至三维支架上，并用于体内实验的报道较少。本实验中利用吸附丝蛋白/NGF的时间差异，制备出了浓度梯度负载NGF的周围神经导管。在进行梯度NGF负载时，变化的是吸附时间。支架靠近器皿底部的部分，由于接触含有NGF的丝蛋白溶液时间长，所以吸附 的 NGF量多；而顶部由于接触时间短，吸附的NGF量少。我们通过变化吸附时间，成功获得浓度梯度负载NGF的周围神经导管。
丝蛋白是从蚕丝中提取的天然生物材料，具有良好的生物相容性、降解速率及与组织生成相匹配等优点，在生物医学领域有广泛用途，目前已用于组织工程领域和药物控释领域[15-16]。丝蛋白拥有亲水基团和疏水基团，在一定条件下，如低温、甲醇等环境会发生蛋白的构象转变，形成β-折叠，从溶于水变为不溶于水，同时将小分子蛋白包裹[17]；其在体内外降解速度慢，作为药物载体时，药物释放时间长，因此用丝蛋白负载生长因子是一种温和的方法[18]。本实验中，当丝蛋白和NGF吸附在材料表面后，通过加入甲醇，使得丝蛋白形成β-折叠，从溶于水变为不溶于水，并固定在材料表面，同时也包裹了固定在材料表面的NGF。因此，NGF的释放与丝蛋白降解有关，随着丝蛋白的降解，被包裹住的NGF分子被释放。由于丝蛋白具有较慢的降解速率，因此本实验在体外12周时，仍能检测到具有活性的NGF释放。
体外研究表明，负载梯度信号的支架能引导并促进轴突生长[19]。其作用机制主要为：生长锥直径改为10 μm，它能感受该直径范围内NGF的浓度[20]。当生长锥表面的丝状伪足探测到外周导向分子（如NGF），微管就能优先沿该丝状伪足内的肌动蛋白丝生长，整个轴突就会发生转向反应[21]。同时，生长锥内不对称的信号能引起肌动蛋白mRNA在生长因子浓度高的一侧快速募集，通过激活转录因子调节分子eIF4B结合蛋白，迅速产生大量β-肌动蛋白，为轴突的生长提供充足原料，从而加快轴突生长速度[22]。但是负载浓度梯度信号的神经导管在体内是否能促进神经再生目前罕见报道。本实验中，我们采用的是大鼠14 mm坐骨神经缺损模型，属于长节段缺损，自行修复效果较差，因此能更好地显示各种导管在体内的修复效果[23]。本实验通过大体观察、电生理检测、组织学观察及透射电镜观察，结果表明采用不同周围神经导管修复后，再生的神经纤维均成功长入材料内，并穿过损伤区，成功支配肌肉。但在轴突总数、轴突密度、髓鞘厚度、轴突直径、肌纤维面积及复合肌肉动作电位指标上，负载NGF的周围神经导管优于单纯周围神经导管，而浓度梯度负载NGF的周围神经导管则优于均匀负载NGF的周围神经导管。其中采用浓度梯度负载NGF的周围神经导管修复后，髓鞘厚度和轴突总数与自体神经修复相近，提示该导管在体内能更好地促进神经再生。
综上述，本实验利用丝蛋白差异吸附成功将NGF以浓度梯度方式负载至周围神经导管上，体外释放实验提示NGF的活性能维持12周以上；体内实验提示，浓度梯度负载NGF的周围神经导管能有效促进神经再生。
周围神经损伤是临床常见的创伤并发症，受损神经的再生及功能修复是临床难题。近年来，应用组织工程技术构建具有良好生物相容性的周围神经导管修复神经损伤，成为研究热点[1]。研究表明，周围神经导管上负载生长因子能显著提高神经修复效果。在神经系统发育过程中，生长因子呈浓度梯度分布，形成一种空间或方向信号，引导轴突再生[2]。理论上，将生长因子呈浓度梯度负载于周围神经导管上，更接近生理结构。为此，我们利用吸附丝蛋白/NGF的时间差异，制备负载浓度梯度NGF的周围神经导管，并建立大鼠坐骨神经缺损模型，用该周围神经导管桥接缺损神经，探讨其修复效果，以期为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康雄性成年SD大鼠24只，体重220～250 g，由中山大学实验动物中心提供。B.mori蚕丝（浙江衢州市桑蚕协会）；聚己内酯-丙交酯嵌段共聚物[poly（ε-caprolactone）-block-poly（L-lactide-co-ε-caprolactone），PCL-b-P（LLA-co-CL）] 由广州医学院朱继翔博士提供；四氢呋喃（广州化学试剂厂）；NGF（PeproTech公司，美国）；ELISA试剂盒（Becton Dickinson公司，美国）。玻璃干燥器（四川蜀牛玻璃仪器厂）；微量注射泵（KD Scientific公司，美国）；Image J分析软件（Bethesda公司，美国）；透射电镜（Hitachi公司，日本）。
1.2 负载浓度梯度NGF的周围神经导管制备及检测
1.2.1 丝蛋白制备
称取干燥蚕丝8 g，放入饱和Na2CO3溶液中煮沸，每3小时更换新鲜饱和Na2CO3 溶液1次，共3次；过滤，干燥，获得纯丝蛋白。将纯丝蛋白溶解于LiBr（1 g/mL）水溶液中制得10%丝蛋白溶液，将丝蛋白溶液放入截留分子量为5 000的透析袋中，用超纯水透析3 d；每半天更换透析液1次，除去LiBr；定容后获得3%丝蛋白溶液，置于4℃冰箱备用[3]。
1.2.2 周围神经导管制备
于55℃水浴条件下，将PCL-b-P（LLA-co-CL）溶解于四氢呋喃中，配制成6%溶液。将其注入内径1.5 mm、外径3.0 mm、长15 mm的圆柱形模具中；迅速降温至- 40℃，凝胶化3 h；- 40℃无水乙醇浸泡，置换样品中的四氢呋喃，每隔6 h更换1次无水乙醇，共6次；置于4℃去离子水浸泡，置换样品中的无水乙醇，每隔6 h更换1次去离子水，共6次； - 20℃冷冻干燥5 d，取出后室温真空干燥1 d，置于干燥器中备用[4]。
1.2.3 均匀负载NGF
取周围神经导管置于无水乙醇中，真空（0.04 MPa）除气1 h；PBS清洗3次，每次10 min，除去乙醇。将10 μg NGF溶解于1 mL 3%丝蛋白溶液中；将除气后的周围神经导管浸泡于含丝蛋白和NGF的混合溶液中，4℃、摇床40 r/min浸泡2 h； PBS清洗5 min；浸入90%甲醇溶液10 min；超纯水清洗3次，每次5 min。获得均匀负载NGF的周围神经导管，备用[5]。
1.2.4 浓度梯度负载NGF
将10 μg NGF溶解于1 mL 3%丝蛋白溶液。取已除气的周围神经导管竖立固定于长10 mm、宽5 mm、高50 mm的玻璃器皿。使用微量注射泵将含有NGF的丝蛋白溶液按照3.2 μL/ min 注入玻璃器皿中，4 h后停止注射，此时液面稍没过样品上缘。取出导管，PBS清洗5 min；浸入90%甲醇溶液中 10 min； PBS清洗3次，每次5 min。获得浓度梯度负载NGF的周围神经导管，备用。
1.2.5 NGF释放检测
取均匀负载NGF和浓度梯度负载NGF的两种周围神经导管，平均切割成5段，每段3 mm。将样品分别置于1 mL塑料试管中，加入400 μL PBS液。于37℃、摇床40 r/ min条件下，分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周取PBS液，用ELISA试剂盒检测NGF含量，取均值，并制作缓释曲线，计算12周累积释放量。各时间点均更换新鲜PBS 液。
1.3 实验方法及分组
取24只SD大鼠，以10%水合氯醛（0.4 mL/ kg）腹腔注射麻醉后，于右下肢后部作斜形切口，长约20 mm。钝性分离皮下，沿后外侧肌间隙钝性分离至闭孔处，显露并切除5 mm长坐骨神经，使其自然回缩，制备14 mm长坐骨神经缺损模型。根据修复方法不同，将大鼠随机分为A、B、C、D 4组（n=6）：分别采用单纯周围神经导管、均匀负载NGF的周围神经导管、浓度梯度负载NGF的周围神经导管、自体神经修复缺损。A、B、C组：将导管两端套于坐骨神经两断端，每端套入长约 0.5 mm，采用9-0显微缝合线固定1针，以防大鼠肢体活动时神经脱出导管。D组：采用9-0显微缝线将切取的自体神经直接与两断端缝合修复。间断缝合肌筋膜，缝合皮肤。
1.4 观测指标
1.4.1 一般情况
术后观察各组大鼠存活、切口愈合及肢体运动情况。
1.4.2 大体观察
术后12周，各组大鼠同上法麻醉后，沿原切口入路显露坐骨神经，大体观察A、B、C组移植物形态及桥接的神经有无脱出。
1.4.3 电生理检测
大体观察后，用双根银丝刺激电极置于各组缺损桥接物近端神经干及腓总神经横跨腓骨肌处，两刺激电极间距为2 cm。同心针记录双电极45°斜行插入腓肠肌肌腹中部，记录诱发的复合肌肉动作电位波幅；刺激强度750 mV，刺激频率1 Hz，持续时间1 ms。同时测定健侧腓肠肌的复合肌肉动作电位波幅，将各组结果与健侧值进行比较，并以与健侧值的百分比表示复合肌肉动作电位结果[6]。
1.4.4 组织学观察
电生理检测后取移植物和所支配的腓肠肌。将移植物置于2.5%戊二醛固定3 h，丙酮逐级脱水，Epon812环氧树脂包埋剂与100%丙酮按1∶1比例浸泡包埋。取移植物中段先行半薄切片，片厚1 μm，常规甲苯胺蓝溶液染色，光镜下观察轴突。于400倍镜下，每组取5张切片，每张切片取5个视野，采用Image J分析软件计数轴突，观察再生的神经横截面积，按以下公式计算轴突密度，轴突密度=轴突总数 /神经横截面积）[7]。
将腓肠肌标本置入4%多聚甲醛固定5 h，30%蔗糖溶液脱水，OCT包埋后冰冻切片，行HE染色，光镜下观察肌肉及胶原纤维。于400倍镜下，每组取5张切片，每张切片取5个视野，采用Image J分析软件测量肌纤维横截面积。
1.4.5 透射电镜观察
取1.4.4中切片再行超薄切片，片厚60 nm，用醋酸铀及硝酸铅双重染色，透射电镜观察再生神经纤维超微结构。于5 800倍镜下，每组取5 张切片，每张切片取10个视野，采用Image J分析软件测量髓鞘厚度及轴突直径，取均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 NGF释放检测
随着时间延长，两种周围神经导管NGF累积释放量均不断增加，各时间点两组间比较差异均无统计学意义（P＞ 0.05），见图 1。浓度梯度负载NGF和均匀负载NGF的导管12周内NGF累积释放量分别为（14.2 ± 1.4）、（13.7 ± 1.3）ng/mg，两组比较差异无统计学意义（t=0.564，P=0.570）。
图1
两种周围神经导管NGF缓释曲线 2.2 一般情况
大鼠切口均Ⅰ期愈合，存活至实验完成。术后4 d各组大鼠均出现足底溃疡，3周时最严重，之后逐渐愈合，至12周时足底溃疡基本愈合；其中C、D组大鼠愈合情况优于A、B组。
2.3 大体观察
术后12周，A、B、C组移植物贴附于一侧肌肉，表面已完全血管化，有结缔组织包裹，神经导管与坐骨神经两端连接，未见神经瘤形成。见图 2。
2.4 电生理检测
术后12周，A、B、C、D组复合肌肉动作电位分别为25.1% ± 4.2%、42.3% ± 9.3%、57.1% ± 10.3%、62.1% ± 13.7 %。A组显著低于B、C、D组，B组显著低于C、D组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）；C、D组间比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。
2.5 组织学观察
2.5.1 移植物
术后12 周，甲苯胺蓝染色示C、D组再生神经纤维形成大小不等的纤维束，神经纤维髓鞘化明显；A、B组观察结果与C、D组相似，但轴突分布较C、D组稀疏。见图 3。D组轴突总数显著高于A、B、C组，C组高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。C组轴突密度显著高于A、B、D组，B组高于A、D组，D组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。
表1
各组组织学及透射电镜测量指标比较（n=6，2.5.2 腓肠肌
术后12周，Masson染色示D组肌纤维最粗、胶原纤维最细，之后为C、B组，而A组肌肉萎缩最严重，有大量胶原纤维增生。见图 4。D组肌纤维横截面积显著高于A、B、C组，C组高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05），见表 1。
2.6 透射电镜观察
术后12 周，透射电镜下各组均可见再生有髓神经纤维和无髓纤维混合，雪旺细胞形态正常，包绕再生轴突形成有髓纤维，大多数髓鞘结构发育良好，呈同心圆板层样结构，少数为未完全闭合的不成熟髓鞘。其中C、D组髓鞘较厚，排列整齐，新生神经纤维较密集，神经纤维基本发育成熟。而A、B组新生神经纤维数量较少，髓鞘厚度也略小于C、D组。见图 5。
D组轴突直径显著高于A、B、C组，C组高于A、B组，B组高于A组，比较差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。C、D组髓鞘厚度比较差异无统计学意义（P＞ 0.05），但均优于A、B组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；B组优于A组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表 1。
3 讨论
目前，许多利用组织工程原理修复周围神经损伤的效果仍不理想，主要原因是轴突生长缺乏方向性，在导管内弥漫生长[8]。在神经系统发育过程中，生长锥被多种生长因子引导，朝着靶向组织生长。这些因子被称为趋化因子或趋触因子，均呈浓度梯度分布[9]。这些呈浓度梯度分布的生长因子给予轴突生长一种空间或方向信号，能引导轴突再生[10]。如小鼠前脑的嗅球有中间神经元，其生于前脑亚室管膜层，需沿着头端迁移渠道向前迁移几毫米才能达到嗅球[11]。因此，构建组织工程神经支架时，除需负载生长因子，除需考虑长时间保持生长因子活性外，还需考虑将生长因子呈浓度梯度负载。
目前出现了一些浓度梯度负载生长因子至二维支架上的方法，如微流体法、扩散法、光雕刻法等[12-14]。但是将生长因子以浓度梯度负载至三维支架上，并用于体内实验的报道较少。本实验中利用吸附丝蛋白/NGF的时间差异，制备出了浓度梯度负载NGF的周围神经导管。在进行梯度NGF负载时，变化的是吸附时间。支架靠近器皿底部的部分，由于接触含有NGF的丝蛋白溶液时间长，所以吸附 的 NGF量多；而顶部由于接触时间短，吸附的NGF量少。我们通过变化吸附时间，成功获得浓度梯度负载NGF的周围神经导管。
丝蛋白是从蚕丝中提取的天然生物材料，具有良好的生物相容性、降解速率及与组织生成相匹配等优点，在生物医学领域有广泛用途，目前已用于组织工程领域和药物控释领域[15-16]。丝蛋白拥有亲水基团和疏水基团，在一定条件下，如低温、甲醇等环境会发生蛋白的构象转变，形成β-折叠，从溶于水变为不溶于水，同时将小分子蛋白包裹[17]；其在体内外降解速度慢，作为药物载体时，药物释放时间长，因此用丝蛋白负载生长因子是一种温和的方法[18]。本实验中，当丝蛋白和NGF吸附在材料表面后，通过加入甲醇，使得丝蛋白形成β-折叠，从溶于水变为不溶于水，并固定在材料表面，同时也包裹了固定在材料表面的NGF。因此，NGF的释放与丝蛋白降解有关，随着丝蛋白的降解，被包裹住的NGF分子被释放。由于丝蛋白具有较慢的降解速率，因此本实验在体外12周时，仍能检测到具有活性的NGF释放。
体外研究表明，负载梯度信号的支架能引导并促进轴突生长[19]。其作用机制主要为：生长锥直径改为10 μm，它能感受该直径范围内NGF的浓度[20]。当生长锥表面的丝状伪足探测到外周导向分子（如NGF），微管就能优先沿该丝状伪足内的肌动蛋白丝生长，整个轴突就会发生转向反应[21]。同时，生长锥内不对称的信号能引起肌动蛋白mRNA在生长因子浓度高的一侧快速募集，通过激活转录因子调节分子eIF4B结合蛋白，迅速产生大量β-肌动蛋白，为轴突的生长提供充足原料，从而加快轴突生长速度[22]。但是负载浓度梯度信号的神经导管在体内是否能促进神经再生目前罕见报道。本实验中，我们采用的是大鼠14 mm坐骨神经缺损模型，属于长节段缺损，自行修复效果较差，因此能更好地显示各种导管在体内的修复效果[23]。本实验通过大体观察、电生理检测、组织学观察及透射电镜观察，结果表明采用不同周围神经导管修复后，再生的神经纤维均成功长入材料内，并穿过损伤区，成功支配肌肉。但在轴突总数、轴突密度、髓鞘厚度、轴突直径、肌纤维面积及复合肌肉动作电位指标上，负载NGF的周围神经导管优于单纯周围神经导管，而浓度梯度负载NGF的周围神经导管则优于均匀负载NGF的周围神经导管。其中采用浓度梯度负载NGF的周围神经导管修复后，髓鞘厚度和轴突总数与自体神经修复相近，提示该导管在体内能更好地促进神经再生。
综上述，本实验利用丝蛋白差异吸附成功将NGF以浓度梯度方式负载至周围神经导管上，体外释放实验提示NGF的活性能维持12周以上；体内实验提示，浓度梯度负载NGF的周围神经导管能有效促进神经再生。
