引用本文： 吴石凯, 肖玉玲, 卫丽, 何燕玲, 王成成, 吴文静, 文虹霞, 刘露, 唐光敏, 宗志勇. 耐碳青霉烯类肠杆菌属细菌的抗菌药物耐药性及氨曲南联合阿维巴坦体外杀菌试验研究. 华西医学, 2023, 38(3): 364-369. doi: 10.7507/1002-0179.202301099 复制
抗菌药物耐药是世界卫生组织 2021 年发布的十大全球亟需关注的健康问题之一，其中耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌的流行给临床上抗菌药物选择和患者治疗带来极大挑战[1-2]。2022 年中国细菌耐药监测网显示，肠杆菌科中的肠杆菌属细菌对碳青霉烯的耐药率为 9.7%～12.5%。在我国，新德里金属β-内酰胺酶是耐碳青霉烯类肠杆菌属细菌（carbapenem-resistant Enterobacter spp., CREn）中最常见的碳青霉烯酶[3]。新德里金属β-内酰胺酶能水解除单环类（氨曲南）外的所有临床用 β-内酰胺类抗菌药物，且不被目前临床用的各种β-内酰胺酶抑制剂抑制[4]。CREn 又常同时产水解氨曲南的其他β-内酰胺酶（丝氨酸酶），因此单用氨曲南难以对抗产金属酶的 CREn[5]。阿维巴坦是新近批准上市的新型β-内酰胺酶抑制剂，能有效抑制除金属酶外的其他β-内酰胺酶（丝氨酸酶），保护氨曲南不被水解[6]。头孢他啶与阿维巴坦的组合已在临床使用，而目前氨曲南-阿维巴坦这一组合尚在临床试验阶段[7]。本研究通过分析四川大学华西医院（以下简称“华西医院”）6 年内分离的 CREn 菌株的抗菌药物敏感性（药敏）结果并进行体外杀菌试验，了解 CREn 的临床分布、对各类常用抗菌药物的耐药情况，并对比测试目前临床常用的多黏菌素与新的抗菌药物酶抑制剂组合（氨曲南联合阿维巴坦）对 CREn 的杀菌作用，为临床治疗提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
菌株来源为华西医院 2016 年－2021 年自临床分离且鉴定为 CREn 的菌株。药敏质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）购自美国标准培养中心（American Type Culture Center）。
1.2 试剂和仪器
抗菌药物：美罗培南、厄他培南、多黏菌素 E、氨曲南、阿维巴坦（大连美仑生物技术有限公司）和亚胺培南（北京索莱宝科技有限公司）。培养基和试剂： CHROMagar 尿路菌群定位显色培养基（法国生物梅里埃股份有限公司）、Luria-Bertani 琼脂及阳离子调节肉汤（青岛海博生物技术有限公司）和 Taq Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。仪器和耗材：96 孔细胞培养板（美国康宁公司）、TU-10 型号恒温金属浴器（上海一恒科学仪器有限公司）、T100 型号 PCR 仪（美国 BIO-RAD 公司）、Vitek Ⅱ全自动微生物生化鉴定仪（法国生物梅里埃股份有限公司）、SPX 型号医用生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）和 MDF-86V588E 型号超低温冰箱（安徽中科都菱商用电器股份有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种鉴定
对细菌看家基因 gyrB（编码 DNA 促旋酶 B 亚基）进行扩增测序以鉴定菌种[8]。挑取过夜培养生长的单菌落于 50 μL 双蒸水中，恒温金属浴器 100℃ 12 min，12000 r/min 离心后取上层清液用作 PCR 模板。gyrB 基因 PCR 正向引物 UP-1S（5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’）及反向引物 UP-2Sr（5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’）[8]由生工生物工程（成都）有限公司合成。PCR 反应循环条件：94℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 90 s。PCR 产物送同一公司进行 Sanger 双向测序，结果用 Sequence Scanner v1.0 软件查看。正反双向测序结果拼接后在美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information）网站和肠杆菌属各菌种模式菌株（type strain）的 gyrB 基因进行比对，以相似度（identity）≥97%中相似度最高的菌株作为菌种鉴定结果[9]。最终鉴定菌种的模式菌株和基因库（GenBank）接入号：香坊肠杆菌（Enterobacter xiangfangensis, CP017183.1）、霍夫曼肠杆菌（Enterobacter hoffmannii, CP017186.1）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae, CP056776.1）、成都肠杆菌（Enterobacter chengduensis, CP043318.1）、神户肠杆菌（Enterobacter kobei, CP017181.1）、布干达肠杆菌（Enterobacter bugandensis, LT992502.1）以及尚无中文菌种名称的 Enterobacter dykesii（VTTY01000013.1）和 Enterobacter soli（LXES01000018.1）。
1.3.2 相关临床信息收集
CREn 菌株的临床标本信息和相关患者的科室分布信息由医院信息系统导出。本研究获华西医院伦理委员会批准［2022 年审（1519）号］，仅涉及分析菌株和临床科室分布，不涉及患者其他信息和任何干预，华西医院伦理委员会同意豁免知情同意书。
1.3.3 药敏试验
对 CREn 进行 3 种目前国内临床常用的碳青霉烯类、多黏菌素 E 及氨曲南-阿维巴坦的药敏试验。用 Vitek Ⅱ系统进行临床菌株的初步药敏试验，即用微量肉汤稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），但其所测浓度只包含判读为耐药、中介和敏感的 3 个 MIC 范围（如 MIC≥16 μg/mL和≤2 μg/mL ）。因此，还使用美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）推荐的标准微量肉汤稀释法测定 3 种碳青霉烯类（厄他培南、亚胺培南和美罗培南）、氨曲南-阿维巴坦、多黏菌素 E 的 MIC ，以确认菌株确为碳青霉烯类耐药和对 2 种 CREn 主要治疗用药（氨曲南-阿维巴坦与多黏菌素）的敏感性。参照 CLSI 推荐方法[10-11]进行微量肉汤稀释法测定并解读。对于氨曲南-阿维巴坦，阿维巴坦的终浓度固定在 4 μg/mL。因 CLSI 尚未给出氨曲南-阿维巴坦判断的标准，按照 CLSI 中氨曲南的标准（≤4 μg/mL 敏感，8 μg/mL 中介，≥16 μg/mL 耐药）对氨曲南-阿维巴坦进行药敏结果判读[12]。CLSI 标准中多黏菌素 E 的 MIC≥4 μg/mL 为耐药，≤2 μg/mL 为中介，无敏感分类[10]。此外，因 CLSI 未给出替加环素的判断标准，参照美国食品药品监督管理局的判断标准（≤2 μg/mL 敏感，≥8 μg/mL 耐药）对 Vitek Ⅱ系统的替加环素结果进行判断。
1.3.4 体外杀菌试验
选取均来自痰标本的多黏菌素耐药及中介的 CREn 菌株各一株，其菌株编号分别为 020122（菌种为 Enterobacter dykesii，多黏菌素耐药）和 020038（菌种为香坊肠杆菌，多黏菌素中介）。参照 CLSI 文件 M26-A 标准及相关文献报道进行多黏菌素 E 和氨曲南-阿维巴坦的体外杀菌试验[11, 13]。
过夜培养菌液比浊至 0.5 麦氏浊度（McFaland），以 1∶1000 加入 10 mL CAMHB 肉汤中，依据测定的氨曲南-阿维巴坦 MIC 加入终浓度为 1×MIC、2×MIC、4×MIC 的氨曲南，阿维巴坦的终浓度固定为 4 μg/mL。参照多黏菌素 E 的平均稳态血药浓度 1.27 μg/mL[14]和 CLSI 2022 版对多黏菌素 E 判断的折点[10]，选取多黏菌素 E 的 3 个浓度即 1 μg/mL（中介）、2 μg/mL（中介）和 4 μg/mL（耐药），进行多黏菌素 E 杀菌试验。以未加抗菌药物的一管菌液作为对照组，通过琼脂倾注法以 0、2、4、8、12 及 24 h 为时间间隔进行体外杀菌试验。两种抗菌药物每个浓度、每个时刻均进行 3 个技术重复。37℃培养 18 h 后分别统计不同时刻的菌落数，并绘制时间-杀菌曲线。菌量下降≥3 log10 CFU/mL 时判定为该浓度的抗菌药物有杀菌效果[13]。
2 结果
2.1 CREn 鉴定结果及相关临床信息
共纳入 110 株 CREn 临床菌株。其菌种分布为：香坊肠杆菌 91 株，霍夫曼肠杆菌 11 株，阴沟肠杆菌 2 株，Enterobacter dykesii 2 株，另有成都肠杆菌、神户肠杆菌、布干达肠杆菌和 Enterobacter soli 各 1 株。2 株 Enterobacter dykesii 和 1 株 Enterobacter soli 的 gyrB基因与肠杆菌属模式菌株 gyrB 相似度分别为 97.84%、97.30%及 97.97%，其余菌株相似度> 98%。
临床科室分布显示，CREn 最多的 5 个科室为重症监护病房（30 株，27.27%）、心脏外科（13 株，11.82%）、呼吸内科（9 株，8.18%）、骨科（7 株，6.36%）及急诊科（7 株，6.36%）。呼吸道来源的标本占比超过 40%（45 株，40.91%），其次是血液（28 株，25.45%）、尿液（15 株，13.64%）、分泌物（12 株，10.91%）及其他（10 株，9.09%）。
2.2 CREn 药敏结果
Vitek Ⅱ药敏结果见表1。CREn 对β-内酰胺类、喹诺酮类、磺胺类等抗菌药物的耐药率均超过 70%，仅有氨基糖苷类的阿米卡星（7.00%）和四环素类的替加环素（4.90%）耐药率低于 10%。
表1
110 株 CREn 临床菌株的 Vitek Ⅱ抗菌药物药敏结果
药敏试验显示，所有菌株对 3 种碳青霉烯类药物均耐药（美罗培南和亚胺培南 MIC≥4 μg/mL，厄他培南 MIC≥2 μg/mL）且大多为高水平耐药（MIC≥16 μg/ml）。高水平耐药菌株数：亚胺培南 96 株（87.27%），美罗培南 103 株（93.64%），厄他培南 108 株（98.18%）。有 26 株 CREn 的多黏菌素 E MIC≥4 μg/mL（耐药），耐药率 23.64%，其余均中介。氨曲南-阿维巴坦仅 1 株 MIC=8 μg/mL（中介），其余 MIC 均≤2 μg/mL（敏感），未发现对其耐药的菌株（耐药率为 0）。
2.3 CREn 时间-杀菌曲线
多黏菌素耐药菌株 020122（Enterobacter dykesii，多黏菌素 E MIC 32 μg/mL，氨曲南-阿维巴坦 MIC 0.25/4 μg/mL）和多黏菌素中介菌株 020038（香坊肠杆菌，多黏菌素 E MIC 1 μg/mL，氨曲南-阿维巴坦 MIC 1/4 μg/mL）的时间-杀菌曲线结果见图1。
图1
时间-杀菌曲线
020038：多黏菌素中介 CREn 临床菌株；020122：多黏菌素耐药 CREn 临床菌株。ATM：氨曲南，AVI：阿维巴坦，COL：多黏菌素 E，对照组：未加抗菌药物的菌液。药物后面的数字为终浓度（μg/mL），例如 ATM 0.25/AVI 4 代表 0.25 μg/mL 氨曲南和 4 μg/mL 阿维巴坦；COL 1 代表1 μg/mL 多黏菌素 E
多黏菌素中介菌株 020038 在氨曲南-阿维巴坦浓度为 1×MIC 组中，菌量在 8 h 内随时间缓慢下降约 3 log10 CFU/mL，随后开始上升，24 h 上升至约 6 log10 CFU/mL。在氨曲南-阿维巴坦浓度为 2×MIC 及 4×MIC 组中，菌量随时间呈缓慢下降趋势（曲线无反弹），下降幅度与药物浓度无明显关联，12 h 均下降约 5 log10 CFU/mL。而多黏菌素 E 浓度为 1、2 和 4 μg/mL 时，2 h 内均能使 020038 的菌量下降 5 log10 CFU/mL 左右，直到 24 h 菌量均未出现反弹。
多黏菌素耐药菌株 020122 在氨曲南-阿维巴坦浓度为 1～4 倍 MIC 时菌量随时间缓慢下降（无反弹），24 h 均下降约 5 log10 CFU/mL。而多黏菌素 E 无论 1、2、4 μg/mL，菌量在 2 h 内下降约 3 log10 CFU/mL ，随后均出现反弹，然后迅速上升，24 h 上升至对照组水平，与其多黏菌素耐药的表型一致。
对多黏菌素中介菌株，多黏菌素相比氨曲南-阿维巴坦能在更短时间内达到杀菌效果（图1），但无论菌株是否对多黏菌素耐药，2 μg/mL 的氨曲南-阿维巴坦在 24 h 的杀菌率均能超过 99%。
3 讨论
肠杆菌属细菌是医院感染的常见病原体，也是肠杆菌科细菌中仅次于埃希菌属和克雷伯菌属的第三常见菌属[3]。本研究中，肠杆菌属细菌的呼吸道来源样本最多，与其他报道一致[15]。重症监护病房是分离 CREn 最多的科室，因此临床工作中需注意病房环境、人员仪器是否存在 CREn 潜伏的“储存库”。
我国流行的肠杆菌属细菌因其多产金属酶而对碳青霉烯类耐药[16-17]，如何治疗 CREn 所致感染已成为临床难点[18]。本研究中，华西医院 6 年内分离的所有 CREn 药敏结果显示其对临床常用的大多数种类的抗菌药物耐药率都很高，仅少数耐药率低于 10%，可选药物十分有限。其中临床常用的治疗药物多黏菌素 E 的耐药率达 23.64%，并且可能存在异质性耐药菌株使患者治疗效果同体外药敏结果不一致[3]。而阿米卡星和替加环素虽耐药率较低，但与多黏菌素一样因严重副作用、适应证局限性或治疗效果不确切而未被美国感染病学会和欧洲临床微生物与感染性疾病学会指南推荐用于产金属酶的革兰阴性杆菌所致严重感染[19-20]。
氨曲南-阿维巴坦是目前正在进行 3 期临床试验的新抗菌药物-酶抑制剂组合，氨曲南对金属酶稳定，而阿维巴坦可抑制其他丝氨酸类β-内酰胺酶以保护氨曲南不被水解[21]，因此这一组合被视为对抗耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌的有效方案。欧美指南均推荐使用已用于临床的头孢他啶-阿维巴坦联合氨曲南，以实现事实上的氨曲南-阿维巴坦来治疗产金属酶的肠杆菌科细菌所致严重感染[19-20]。研究表明氨曲南-阿维巴坦对碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE）有优秀的体外抗菌活性[21-22]，临床研究也发现氨曲南-阿维巴坦治疗产金属酶 CRE 感染的患者相比传统药物有更高的临床缓解率和更低的死亡率[23]。本研究中，对 CREn 的药敏结果显示其对氨曲南-阿维巴坦的敏感率超过 99%，而对多黏菌素的耐药率达到 23.64%。因此，相比多黏菌素，选择氨曲南-阿维巴坦治疗产金属酶 CRE 感染更可能使患者获益，尤其是多黏菌素耐药菌株所致感染。本研究中，对多黏菌素耐药的 CREn 临床菌株的杀菌试验显示，2 μg/mL（小于治疗浓度及敏感的折点浓度 4 μg/mL）的氨曲南-阿维巴坦对多黏菌素耐药菌株即有杀菌活性，可用于多黏菌素耐药菌株的治疗。对多黏菌素中介的 CREn 菌株，治疗浓度的氨曲南-阿维巴坦和多黏菌素 E（2 μg/mL，也是其判读为中介的折点浓度）都具有杀菌作用，但氨曲南-阿维巴坦达到杀菌效果的时间要长于多黏菌素 E。这提示多黏菌素对其中介的菌株有杀菌作用，临床治疗可能有效。研究表明氨曲南联合阿维巴坦对产新德里金属β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌杀菌作用良好，时间-杀菌曲线显示菌量下降超过 3 log10 CFU/mL 后在 24 h 内无明显反弹[24]，而部分多黏菌素敏感的肠杆菌属细菌应用多黏菌素菌量降为 0 之后的 24 h 内菌量可再次上升至对照组水平[25]。
与 CLSI 标准中仅有中介和耐药而没有敏感分类不同，欧洲抗菌药敏试验委员会对多黏菌素保留了敏感这一分类（MIC≤2 μg/mL）。因此在治疗产金属酶的 CREn 所致感染时，多黏菌素仍有其价值。尤其是虽然本研究中并未发现对氨曲南-阿维巴坦耐药的 CREn 菌株，但此种耐药菌已有报道[12, 26-27]。因此，氨曲南-阿维巴坦和多黏菌素作为治疗 CREn 的 2 种选择时，若 CREn 对其中一种药物耐药或疗效不佳，则另一种可作为替代选择。值得注意的是，氨曲南为β-内酰胺类，是时间依赖性抗菌药物。体外杀菌试验也表明 1×MIC 浓度的氨曲南-阿维巴坦作用下 8 h 有菌株的菌量出现反弹，提示至少需要每 8 小时给药一次。
本研究也存在一些局限性：① 相应菌株尚未行进一步深度测序分析；② 杀菌快慢仅为观察性研究结果，尚需纳入更多菌株进行统计学分析得出更为可靠的结论；③ 还缺少体内试验的相应结果来进一步说明多黏菌素和氨曲南-阿维巴坦的优劣。
综上，CREn 最常见于呼吸道样本中，重症监护病房是分离最多的科室。药敏结果显示 CREn 对多黏菌素有约 1/4 的耐药率，但其对氨曲南-阿维巴坦的敏感率接近 100%。多黏菌素相比氨曲南-阿维巴坦更快达到杀菌效果，但无法抑制耐药菌株的生长。氨曲南-阿维巴坦在 24 h 内对多黏菌素中介或敏感的 CREn 杀菌率超过 99%，提示临床上在治疗 CREn 所致感染时可首选氨曲南-阿维巴坦。多黏菌素 E 对其中介的 CREn 菌株也有杀菌作用，但考虑到不良反应，可以作为对多黏菌素中介菌株所致感染的替代选择。总之，本研究为治疗 CREn 所致临床感染的药物选择提供了体外试验证据，但尚需更多体内试验及临床研究予以验证。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
抗菌药物耐药是世界卫生组织 2021 年发布的十大全球亟需关注的健康问题之一，其中耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌的流行给临床上抗菌药物选择和患者治疗带来极大挑战[1-2]。2022 年中国细菌耐药监测网显示，肠杆菌科中的肠杆菌属细菌对碳青霉烯的耐药率为 9.7%～12.5%。在我国，新德里金属β-内酰胺酶是耐碳青霉烯类肠杆菌属细菌（carbapenem-resistant Enterobacter spp., CREn）中最常见的碳青霉烯酶[3]。新德里金属β-内酰胺酶能水解除单环类（氨曲南）外的所有临床用 β-内酰胺类抗菌药物，且不被目前临床用的各种β-内酰胺酶抑制剂抑制[4]。CREn 又常同时产水解氨曲南的其他β-内酰胺酶（丝氨酸酶），因此单用氨曲南难以对抗产金属酶的 CREn[5]。阿维巴坦是新近批准上市的新型β-内酰胺酶抑制剂，能有效抑制除金属酶外的其他β-内酰胺酶（丝氨酸酶），保护氨曲南不被水解[6]。头孢他啶与阿维巴坦的组合已在临床使用，而目前氨曲南-阿维巴坦这一组合尚在临床试验阶段[7]。本研究通过分析四川大学华西医院（以下简称“华西医院”）6 年内分离的 CREn 菌株的抗菌药物敏感性（药敏）结果并进行体外杀菌试验，了解 CREn 的临床分布、对各类常用抗菌药物的耐药情况，并对比测试目前临床常用的多黏菌素与新的抗菌药物酶抑制剂组合（氨曲南联合阿维巴坦）对 CREn 的杀菌作用，为临床治疗提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
菌株来源为华西医院 2016 年－2021 年自临床分离且鉴定为 CREn 的菌株。药敏质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）购自美国标准培养中心（American Type Culture Center）。
1.2 试剂和仪器
抗菌药物：美罗培南、厄他培南、多黏菌素 E、氨曲南、阿维巴坦（大连美仑生物技术有限公司）和亚胺培南（北京索莱宝科技有限公司）。培养基和试剂： CHROMagar 尿路菌群定位显色培养基（法国生物梅里埃股份有限公司）、Luria-Bertani 琼脂及阳离子调节肉汤（青岛海博生物技术有限公司）和 Taq Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。仪器和耗材：96 孔细胞培养板（美国康宁公司）、TU-10 型号恒温金属浴器（上海一恒科学仪器有限公司）、T100 型号 PCR 仪（美国 BIO-RAD 公司）、Vitek Ⅱ全自动微生物生化鉴定仪（法国生物梅里埃股份有限公司）、SPX 型号医用生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）和 MDF-86V588E 型号超低温冰箱（安徽中科都菱商用电器股份有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种鉴定
对细菌看家基因 gyrB（编码 DNA 促旋酶 B 亚基）进行扩增测序以鉴定菌种[8]。挑取过夜培养生长的单菌落于 50 μL 双蒸水中，恒温金属浴器 100℃ 12 min，12000 r/min 离心后取上层清液用作 PCR 模板。gyrB 基因 PCR 正向引物 UP-1S（5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’）及反向引物 UP-2Sr（5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’）[8]由生工生物工程（成都）有限公司合成。PCR 反应循环条件：94℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 90 s。PCR 产物送同一公司进行 Sanger 双向测序，结果用 Sequence Scanner v1.0 软件查看。正反双向测序结果拼接后在美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information）网站和肠杆菌属各菌种模式菌株（type strain）的 gyrB 基因进行比对，以相似度（identity）≥97%中相似度最高的菌株作为菌种鉴定结果[9]。最终鉴定菌种的模式菌株和基因库（GenBank）接入号：香坊肠杆菌（Enterobacter xiangfangensis, CP017183.1）、霍夫曼肠杆菌（Enterobacter hoffmannii, CP017186.1）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae, CP056776.1）、成都肠杆菌（Enterobacter chengduensis, CP043318.1）、神户肠杆菌（Enterobacter kobei, CP017181.1）、布干达肠杆菌（Enterobacter bugandensis, LT992502.1）以及尚无中文菌种名称的 Enterobacter dykesii（VTTY01000013.1）和 Enterobacter soli（LXES01000018.1）。
1.3.2 相关临床信息收集
CREn 菌株的临床标本信息和相关患者的科室分布信息由医院信息系统导出。本研究获华西医院伦理委员会批准［2022 年审（1519）号］，仅涉及分析菌株和临床科室分布，不涉及患者其他信息和任何干预，华西医院伦理委员会同意豁免知情同意书。
1.3.3 药敏试验
对 CREn 进行 3 种目前国内临床常用的碳青霉烯类、多黏菌素 E 及氨曲南-阿维巴坦的药敏试验。用 Vitek Ⅱ系统进行临床菌株的初步药敏试验，即用微量肉汤稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），但其所测浓度只包含判读为耐药、中介和敏感的 3 个 MIC 范围（如 MIC≥16 μg/mL和≤2 μg/mL ）。因此，还使用美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）推荐的标准微量肉汤稀释法测定 3 种碳青霉烯类（厄他培南、亚胺培南和美罗培南）、氨曲南-阿维巴坦、多黏菌素 E 的 MIC ，以确认菌株确为碳青霉烯类耐药和对 2 种 CREn 主要治疗用药（氨曲南-阿维巴坦与多黏菌素）的敏感性。参照 CLSI 推荐方法[10-11]进行微量肉汤稀释法测定并解读。对于氨曲南-阿维巴坦，阿维巴坦的终浓度固定在 4 μg/mL。因 CLSI 尚未给出氨曲南-阿维巴坦判断的标准，按照 CLSI 中氨曲南的标准（≤4 μg/mL 敏感，8 μg/mL 中介，≥16 μg/mL 耐药）对氨曲南-阿维巴坦进行药敏结果判读[12]。CLSI 标准中多黏菌素 E 的 MIC≥4 μg/mL 为耐药，≤2 μg/mL 为中介，无敏感分类[10]。此外，因 CLSI 未给出替加环素的判断标准，参照美国食品药品监督管理局的判断标准（≤2 μg/mL 敏感，≥8 μg/mL 耐药）对 Vitek Ⅱ系统的替加环素结果进行判断。
1.3.4 体外杀菌试验
选取均来自痰标本的多黏菌素耐药及中介的 CREn 菌株各一株，其菌株编号分别为 020122（菌种为 Enterobacter dykesii，多黏菌素耐药）和 020038（菌种为香坊肠杆菌，多黏菌素中介）。参照 CLSI 文件 M26-A 标准及相关文献报道进行多黏菌素 E 和氨曲南-阿维巴坦的体外杀菌试验[11, 13]。
过夜培养菌液比浊至 0.5 麦氏浊度（McFaland），以 1∶1000 加入 10 mL CAMHB 肉汤中，依据测定的氨曲南-阿维巴坦 MIC 加入终浓度为 1×MIC、2×MIC、4×MIC 的氨曲南，阿维巴坦的终浓度固定为 4 μg/mL。参照多黏菌素 E 的平均稳态血药浓度 1.27 μg/mL[14]和 CLSI 2022 版对多黏菌素 E 判断的折点[10]，选取多黏菌素 E 的 3 个浓度即 1 μg/mL（中介）、2 μg/mL（中介）和 4 μg/mL（耐药），进行多黏菌素 E 杀菌试验。以未加抗菌药物的一管菌液作为对照组，通过琼脂倾注法以 0、2、4、8、12 及 24 h 为时间间隔进行体外杀菌试验。两种抗菌药物每个浓度、每个时刻均进行 3 个技术重复。37℃培养 18 h 后分别统计不同时刻的菌落数，并绘制时间-杀菌曲线。菌量下降≥3 log10 CFU/mL 时判定为该浓度的抗菌药物有杀菌效果[13]。
2 结果
2.1 CREn 鉴定结果及相关临床信息
共纳入 110 株 CREn 临床菌株。其菌种分布为：香坊肠杆菌 91 株，霍夫曼肠杆菌 11 株，阴沟肠杆菌 2 株，Enterobacter dykesii 2 株，另有成都肠杆菌、神户肠杆菌、布干达肠杆菌和 Enterobacter soli 各 1 株。2 株 Enterobacter dykesii 和 1 株 Enterobacter soli 的 gyrB基因与肠杆菌属模式菌株 gyrB 相似度分别为 97.84%、97.30%及 97.97%，其余菌株相似度> 98%。
临床科室分布显示，CREn 最多的 5 个科室为重症监护病房（30 株，27.27%）、心脏外科（13 株，11.82%）、呼吸内科（9 株，8.18%）、骨科（7 株，6.36%）及急诊科（7 株，6.36%）。呼吸道来源的标本占比超过 40%（45 株，40.91%），其次是血液（28 株，25.45%）、尿液（15 株，13.64%）、分泌物（12 株，10.91%）及其他（10 株，9.09%）。
2.2 CREn 药敏结果
Vitek Ⅱ药敏结果见表1。CREn 对β-内酰胺类、喹诺酮类、磺胺类等抗菌药物的耐药率均超过 70%，仅有氨基糖苷类的阿米卡星（7.00%）和四环素类的替加环素（4.90%）耐药率低于 10%。
表1
110 株 CREn 临床菌株的 Vitek Ⅱ抗菌药物药敏结果
药敏试验显示，所有菌株对 3 种碳青霉烯类药物均耐药（美罗培南和亚胺培南 MIC≥4 μg/mL，厄他培南 MIC≥2 μg/mL）且大多为高水平耐药（MIC≥16 μg/ml）。高水平耐药菌株数：亚胺培南 96 株（87.27%），美罗培南 103 株（93.64%），厄他培南 108 株（98.18%）。有 26 株 CREn 的多黏菌素 E MIC≥4 μg/mL（耐药），耐药率 23.64%，其余均中介。氨曲南-阿维巴坦仅 1 株 MIC=8 μg/mL（中介），其余 MIC 均≤2 μg/mL（敏感），未发现对其耐药的菌株（耐药率为 0）。
2.3 CREn 时间-杀菌曲线
多黏菌素耐药菌株 020122（Enterobacter dykesii，多黏菌素 E MIC 32 μg/mL，氨曲南-阿维巴坦 MIC 0.25/4 μg/mL）和多黏菌素中介菌株 020038（香坊肠杆菌，多黏菌素 E MIC 1 μg/mL，氨曲南-阿维巴坦 MIC 1/4 μg/mL）的时间-杀菌曲线结果见图1。
图1
时间-杀菌曲线
020038：多黏菌素中介 CREn 临床菌株；020122：多黏菌素耐药 CREn 临床菌株。ATM：氨曲南，AVI：阿维巴坦，COL：多黏菌素 E，对照组：未加抗菌药物的菌液。药物后面的数字为终浓度（μg/mL），例如 ATM 0.25/AVI 4 代表 0.25 μg/mL 氨曲南和 4 μg/mL 阿维巴坦；COL 1 代表1 μg/mL 多黏菌素 E
多黏菌素中介菌株 020038 在氨曲南-阿维巴坦浓度为 1×MIC 组中，菌量在 8 h 内随时间缓慢下降约 3 log10 CFU/mL，随后开始上升，24 h 上升至约 6 log10 CFU/mL。在氨曲南-阿维巴坦浓度为 2×MIC 及 4×MIC 组中，菌量随时间呈缓慢下降趋势（曲线无反弹），下降幅度与药物浓度无明显关联，12 h 均下降约 5 log10 CFU/mL。而多黏菌素 E 浓度为 1、2 和 4 μg/mL 时，2 h 内均能使 020038 的菌量下降 5 log10 CFU/mL 左右，直到 24 h 菌量均未出现反弹。
多黏菌素耐药菌株 020122 在氨曲南-阿维巴坦浓度为 1～4 倍 MIC 时菌量随时间缓慢下降（无反弹），24 h 均下降约 5 log10 CFU/mL。而多黏菌素 E 无论 1、2、4 μg/mL，菌量在 2 h 内下降约 3 log10 CFU/mL ，随后均出现反弹，然后迅速上升，24 h 上升至对照组水平，与其多黏菌素耐药的表型一致。
对多黏菌素中介菌株，多黏菌素相比氨曲南-阿维巴坦能在更短时间内达到杀菌效果（图1），但无论菌株是否对多黏菌素耐药，2 μg/mL 的氨曲南-阿维巴坦在 24 h 的杀菌率均能超过 99%。
3 讨论
肠杆菌属细菌是医院感染的常见病原体，也是肠杆菌科细菌中仅次于埃希菌属和克雷伯菌属的第三常见菌属[3]。本研究中，肠杆菌属细菌的呼吸道来源样本最多，与其他报道一致[15]。重症监护病房是分离 CREn 最多的科室，因此临床工作中需注意病房环境、人员仪器是否存在 CREn 潜伏的“储存库”。
我国流行的肠杆菌属细菌因其多产金属酶而对碳青霉烯类耐药[16-17]，如何治疗 CREn 所致感染已成为临床难点[18]。本研究中，华西医院 6 年内分离的所有 CREn 药敏结果显示其对临床常用的大多数种类的抗菌药物耐药率都很高，仅少数耐药率低于 10%，可选药物十分有限。其中临床常用的治疗药物多黏菌素 E 的耐药率达 23.64%，并且可能存在异质性耐药菌株使患者治疗效果同体外药敏结果不一致[3]。而阿米卡星和替加环素虽耐药率较低，但与多黏菌素一样因严重副作用、适应证局限性或治疗效果不确切而未被美国感染病学会和欧洲临床微生物与感染性疾病学会指南推荐用于产金属酶的革兰阴性杆菌所致严重感染[19-20]。
氨曲南-阿维巴坦是目前正在进行 3 期临床试验的新抗菌药物-酶抑制剂组合，氨曲南对金属酶稳定，而阿维巴坦可抑制其他丝氨酸类β-内酰胺酶以保护氨曲南不被水解[21]，因此这一组合被视为对抗耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌的有效方案。欧美指南均推荐使用已用于临床的头孢他啶-阿维巴坦联合氨曲南，以实现事实上的氨曲南-阿维巴坦来治疗产金属酶的肠杆菌科细菌所致严重感染[19-20]。研究表明氨曲南-阿维巴坦对碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE）有优秀的体外抗菌活性[21-22]，临床研究也发现氨曲南-阿维巴坦治疗产金属酶 CRE 感染的患者相比传统药物有更高的临床缓解率和更低的死亡率[23]。本研究中，对 CREn 的药敏结果显示其对氨曲南-阿维巴坦的敏感率超过 99%，而对多黏菌素的耐药率达到 23.64%。因此，相比多黏菌素，选择氨曲南-阿维巴坦治疗产金属酶 CRE 感染更可能使患者获益，尤其是多黏菌素耐药菌株所致感染。本研究中，对多黏菌素耐药的 CREn 临床菌株的杀菌试验显示，2 μg/mL（小于治疗浓度及敏感的折点浓度 4 μg/mL）的氨曲南-阿维巴坦对多黏菌素耐药菌株即有杀菌活性，可用于多黏菌素耐药菌株的治疗。对多黏菌素中介的 CREn 菌株，治疗浓度的氨曲南-阿维巴坦和多黏菌素 E（2 μg/mL，也是其判读为中介的折点浓度）都具有杀菌作用，但氨曲南-阿维巴坦达到杀菌效果的时间要长于多黏菌素 E。这提示多黏菌素对其中介的菌株有杀菌作用，临床治疗可能有效。研究表明氨曲南联合阿维巴坦对产新德里金属β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌杀菌作用良好，时间-杀菌曲线显示菌量下降超过 3 log10 CFU/mL 后在 24 h 内无明显反弹[24]，而部分多黏菌素敏感的肠杆菌属细菌应用多黏菌素菌量降为 0 之后的 24 h 内菌量可再次上升至对照组水平[25]。
与 CLSI 标准中仅有中介和耐药而没有敏感分类不同，欧洲抗菌药敏试验委员会对多黏菌素保留了敏感这一分类（MIC≤2 μg/mL）。因此在治疗产金属酶的 CREn 所致感染时，多黏菌素仍有其价值。尤其是虽然本研究中并未发现对氨曲南-阿维巴坦耐药的 CREn 菌株，但此种耐药菌已有报道[12, 26-27]。因此，氨曲南-阿维巴坦和多黏菌素作为治疗 CREn 的 2 种选择时，若 CREn 对其中一种药物耐药或疗效不佳，则另一种可作为替代选择。值得注意的是，氨曲南为β-内酰胺类，是时间依赖性抗菌药物。体外杀菌试验也表明 1×MIC 浓度的氨曲南-阿维巴坦作用下 8 h 有菌株的菌量出现反弹，提示至少需要每 8 小时给药一次。
本研究也存在一些局限性：① 相应菌株尚未行进一步深度测序分析；② 杀菌快慢仅为观察性研究结果，尚需纳入更多菌株进行统计学分析得出更为可靠的结论；③ 还缺少体内试验的相应结果来进一步说明多黏菌素和氨曲南-阿维巴坦的优劣。
综上，CREn 最常见于呼吸道样本中，重症监护病房是分离最多的科室。药敏结果显示 CREn 对多黏菌素有约 1/4 的耐药率，但其对氨曲南-阿维巴坦的敏感率接近 100%。多黏菌素相比氨曲南-阿维巴坦更快达到杀菌效果，但无法抑制耐药菌株的生长。氨曲南-阿维巴坦在 24 h 内对多黏菌素中介或敏感的 CREn 杀菌率超过 99%，提示临床上在治疗 CREn 所致感染时可首选氨曲南-阿维巴坦。多黏菌素 E 对其中介的 CREn 菌株也有杀菌作用，但考虑到不良反应，可以作为对多黏菌素中介菌株所致感染的替代选择。总之，本研究为治疗 CREn 所致临床感染的药物选择提供了体外试验证据，但尚需更多体内试验及临床研究予以验证。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
