引用本文： 郭婷婷, 周杰, 郭建. 氟西汀预处理对脑出血模型小鼠的影响研究. 华西医学, 2022, 37(3): 431-436. doi: 10.7507/1002-0179.202104046 复制
脑出血是导致情绪障碍的常见病因，约 20%的脑出血患者可并发抑郁症，严重影响未来生活质量[1]。选择性五羟色胺再摄取抑制剂（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）是目前使用最广泛的抗抑郁药物之一。然而，由于 SSRI 有抑制血小板聚集作用，可能增加脑出血风险。既往已经有研究表明 SSRI 可能导致脑出血增加[2-3]，而其他研究却得出相反的结论[4]。因此，有必要设计一个严格、混杂因素可控的动物实验以进一步探索这一问题。氟西汀是一种强效 SSRI，可通过神经保护作用促进脑卒中后运动恢复而常用于脑出血患者[5]。但目前尚无针对其是否增加脑出血的动物实验。因此，本研究旨在利用标化的小鼠脑出血模型，考察氟西汀预处理是否有加重脑出血可能。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
42 只 12～14 个月龄无特定病原体级雌性 C57BL/6 小鼠，体质量 25～35 g，购于成都药康生物科技有限公司，许可证号 SCXK（川）2020-034。所有小鼠健康状况良好，分笼饲养在通风良好的恒温环境，给予充足的水和食物，使其能够自由饮水和进食，并以 12 h/12 h 的昼夜周期循环。动物术前 12 h 禁食，但自由进水。本研究通过四川大学华西医院实验动物伦理委员会批准，伦理备案号：20211160A。
1.2 方法
小鼠由简单随机法分配为氟西汀组（氟西汀预处理，1 mL 生理盐水稀释氟西汀腹腔注射，20 mg/kg、1 次/d，美国西格玛奥德里奇公司）和对照组（生理盐水 1 mL 腹腔注射，1 次/d），各 21 只。42 只小鼠中，22 只用于脑组织血红蛋白含量和鼠尾出血时间测定（每组 11 只），20 只用于神经功能、组织病理、出血损伤体积、脑含水量、脑肿胀等其他实验（每组 10 只）。氟西汀给药方案基于以前的研究[6]，于脑出血造模前 7 d 每日腹腔注射。
7.1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，所有小鼠仰卧位固定于立体定位仪。胶原酶（0.075 U，美国西格玛奥德里奇公司）注射至小鼠右侧纹状体诱导脑出血。注射位置选用前囟前 0.40 mm、侧 2.00 mm、深 3.00 mm，原因在于该位置不会损伤中央前回，使得神经系统损害评估与脑出血严重程度的一致性更强[7]。胶原酶匀速注射 5 min，并保持 10 min 以防止回流。在整个实验和恢复期均使用热垫保持小鼠肛温在（37.00±0.50）°C。
1.3 神经功能评估
在脑出血后第 1 天（建模后第 2 天）和第 3 天，采用神经功能缺损评分（neurologic deficit scoring，NDS）和悬绳实验盲评小鼠神经功能损伤情况[8]。利用 NDS 对小鼠进行了包括身体平衡、步态、攀爬、绕圈行为、前肢力量和强制绕圈 6 个方面测试。每个测试 0～4 分，最差 24 分。在悬绳实验中，将小鼠前肢挂于铁丝（55 cm 宽、2 mm 厚），记录其完全松开前肢并掉落的时间，用于评估小鼠的握力、平衡和耐力。
1.4 组织病理学
脑出血后第 3 天深度麻醉处死小鼠，用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）和 4%多聚甲醛经心脏灌注固定脑组织。整个纹状体行冠状位切片后进行劳克坚牢蓝-甲苯酚紫双染（luxol fast blue/cresyl violet，LFB-CV）以检测脑损伤和髓鞘损伤体积，采用fluoro-jade C（FJC）染色以检测退化神经元，普鲁士蓝染色以检测铁含量。每只小鼠选择 3 个连续病灶切片，每个切片选择 4 个区域共 12 个位置，测量平均髓鞘面积（%）和每平方毫米的 FJC 及普鲁士蓝阳性细胞数。所有的脑切片均由 1 名研究者盲法进行分析。
1.5 出血损伤体积、脑含水量和脑肿胀
利用 Image pro plus 5.0 软件对脑出血后第 3 天 LFB-CV 切片进行图像分析，通过厚度×各切片损伤面积之和，得出损伤体积。通过测定脑含水量以评估脑水肿，对比病侧及对侧纹状体，同时以小脑作为内部对照。脑含水量百分比=（湿重−干重）/湿重×100%。脑肿胀通过计算半球增大百分比来量化，即（同侧半球体积−对侧半球体积）/对侧半球体积×100%。
1.6 脑组织血红蛋白含量
由于血脑屏障破坏后血红蛋白代谢较快，取脑出血后第 1 天纹状体行血红蛋白含量检测。用 Drabkin 试剂（美国西格玛奥德里奇公司）溶解纹状体，以分光光度计在 540 nm 处检测氰化正铁血红蛋白的吸光度，测定血红蛋白含量。
1.7 鼠尾出血时间
为确定氟西汀是否抑制血小板聚集从而延长出血时间，因此在脑出血后第 1 天检测两组鼠尾出血时间，小鼠麻醉后置于恒温垫上维持体温，用刀片横切尾尖 3 mm，并立即浸入温 PBS［（37.00±0.50）°C］中。监测鼠尾出血时间，当停止出血超过 30 s 时记录为出血停止时间。鼠尾出血时间大于 15 min 均记录为 900 s。
1.8 统计学方法
用 GraphPad Prism 7 软件进行统计处理。计量资料首先进行正态性检验，若满足正态分布则以均数±标准差表示，在满足方差齐性的同时，组间比较采用成组 t 检验，否则采用校正 t 检验。若计量资料不满足正态性，则对原始数据进行对数转换。对于呈对数正态分布的资料，在满足方差齐性时采用成组 t 检验，反之采用校正 t 检验。若对数转换后仍不满足正态分布，则采用两独立样本 Wilcoxon 秩和检验。计数资料采用只数表示。双侧检验水准均为α=0.05。
2 结果
2.1 氟西汀预处理对小鼠脑出血后损伤体积、脑含水量和脑肿胀影响
脑出血后第 3 天，对照组和氟西汀组出血体积分别为（4.59±1.80）mm3 和（6.09±1.08）mm3。由图1a、1b 可见，与对照组相比，氟西汀组出血体积增加（t=−2.251，P=0.037）。由图1c、1d 可见，氟西汀组病侧纹状体脑含水量（t=−2.600，P=0.018）和脑肿胀（t=−2.069，P=0.035）均增加。
图1
氟西汀预处理对脑出血小鼠脑损伤体积、脑含水量、脑肿胀的影响（n=10）
a. 小鼠脑切片 LFB-CV 染色，标尺=5 mm；b. 出血体积；c. 脑含水量；d. 脑肿胀。*与对照组比较，
2.2 氟西汀预处理对小鼠脑出血后 NDS 结果的影响
对照组和氟西汀组小鼠各 10 只，体重分别为（29.71±2.30）g 和（31.23±1.73）g，差异无统计学意义（t=−1.144，P=0.268）。采用 NDS 和悬绳实验评估小鼠神经功能损伤情况。结果显示，与对照组相比，氟西汀组在脑出血后第 1 天及第 3 天，NDS 均增高，尤其脑出血后第 1 天对照组和氟西汀组评分分别为（10.10±4.53）、（17.20±3.58）分，两组比较差异有统计学意义（t=−3.886，P=0.001）。悬绳实验时间在脑出血后第 1 天，对照组和氟西汀组分别为（52.40±44.46）、（18.30±9.94）s，由于两组数据不满足正态性故进行对数转换，其对数值分别为（3.69±0.75）、（2.79±0.51）s，满足正态分布和方差齐性，结果显示与对照组比较，氟西汀组用时降低（t=2.367，P=0.029）。脑出血后第 3 天两组用时比较差异无统计学意义（t=1.845，P=0.081）。见图2a、2b。
图2
氟西汀预处理对脑出血小鼠神经功能（n=10）、悬绳实验（n=10）、脑血红蛋白含量（n=11）、鼠尾出血时间（n=11）的影响
a. NDS；b. 悬绳实验；c. 脑组织血红蛋白含量；d. 鼠尾出血时间。*与对照组比较，
2.3 氟西汀预处理对小鼠脑出血后血红蛋白含量及血小板聚集能力的影响
脑出血后第 1 天，对照组和氟西汀组纹状体血红蛋白吸光度分别为0.94±0.29 和 1.22±0.27，相比对照组，氟西汀组明显增加，差异有统计学意义（t=−2.259，P=0.035）。脑出血后 1 d 两组鼠尾出血时间检测显示，对照组和氟西汀组分别为（276.73±211.06）、（438.00±236.79）s，虽然与对照组相比差异无统计学意义（t=−1.686，P=0.055），但氟西汀预处理有延长鼠尾出血时间的趋势。见图2c、2d。
2.4 氟西汀预处理对小鼠脑出血后组织病理的影响
脑出血后第 3 天的组织病理学发现，氟西汀预处理可增加胶原酶诱导的脑出血髓鞘损伤，使得髓鞘面积减少（t=3.671，P=0.002），可增加铁沉积（t=−2.151，P=0.045），可加重神经元变性（t=−3.046，P=0.007）。见表1，图3、4。
表1
两组小鼠出血后组织病理情况（n=10，
）
图3
两组小鼠脑出血后脑组织染色彩色像
LFB-CV，标尺=100 μm；普鲁士蓝染色，标尺=100 μm；FJC 染色，标尺=50 μm
图4
氟西汀预处理对小鼠脑出血后髓鞘损伤、铁沉积及神经元变性的影响
a. 髓鞘面积；b. 铁染色阳性细胞；c. FJC阳性细胞。*与对照组比较，
3 讨论
本研究希望通过建立较稳定的小鼠脑出血模型，考察氟西汀预处理对脑出血的影响。结果发现，与对照组相比，氟西汀预处理 7 d 的脑出血小鼠在出血体积、神经行为学缺损、神经元死亡及变性、血红蛋白及铁沉积、脑水肿等方面均更为严重。同时鼠尾出血时间有延长的趋势，提示氟西汀可能导致血小板聚集障碍，从而诱发出血增加。
本研究的主要发现是氟西汀预处理可加重脑出血。既往已有许多研究发现 SSRI 可增加消化道出血，但对脑出血的影响尚存在争议。一项纳入 1 279 例参与者，平均随访时间长达 53.2 个月的观察性研究显示，使用 SSRI 与脑出血之间存在明显的联系，特别是对于颅内影像学多发微出血，或伴有特定易出血基因型的患者[9]。但另外一项纳入 24 个随机对照试验共计 4 844 090 例被试者的 meta 分析则显示，并无强有力的证据证明 SSRI 会明显增加脑出血风险[10]。事实上，在临床工作中，SSRI 一直被用于治疗脑出血后情绪障碍，甚至被认为有利于脑出血后的神经功能恢复[5]。产生这种矛盾结论的原因有很多。首先，由于采用观察性研究而缺乏随机对照试验，在 SSRI 类药物导致出血增加的病例中存在研究偏倚；其次，脑出血易受多种混杂因素的影响，如不同的基础疾病、SSRI 不同使用情况等。在这些研究中，所纳入患者未进行分组，因此研究结果可能有偏差[11]；此外，之前众多研究是针对使用 SSRI 的普通抑郁症而非脑出血患者[12]。普通人群即使在 SSRI 抑制血小板聚集作用下，发生脑出血的风险非常小，难以被检出。而对于脑出血患者，血脑屏障的损伤可能加重 SSRI 所致的血肿体积增加，从而体现出统计学差异。
本研究发现，氟西汀预处理可加重脑出血。推测其机制在于 SSRI 药理作用为通过抑制中枢神经系统的五羟色胺转运体（serotonin transporters，SERT）以提高突触间隙五羟色胺浓度，从而治疗抑郁症。而此时血小板膜处的 SERT 也受到抑制。血小板无法结合五羟色胺，但位于血小板膜的 SERT 会将五羟色胺转移到血小板内参与凝血功能。因此，SSRI 会使血小板五羟色胺转运能力下降，进而损害凝血能力[13]。此外，依赖五羟色胺的促血小板活化细胞内信号转导通路也会受到 SSRI 抑制，降低血小板黏附功能从而加重出血[14]。相关临床研究证实，五羟色胺摄取能力抑制越强，诱发脑出血的可能性越大[2]，这与 SSRI 的生物学效应是一致的。众所周知，氟西汀是一种对五羟色胺再摄取能力强抑制作用的 SSRI 类药物。因此，本研究选择氟西汀而不是其他弱抑制剂来进行实验。此外，SSRI 可影响中枢神经系统血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达[15]。VEGF 促进脆弱新生血管的形成，进一步破坏血脑屏障，这可能是引起脑出血血肿扩大的潜在因素[16]。
鼠尾出血时间是评价血小板功能的常用工具。而在本实验中，氟西汀预处理在增加鼠尾出血时间并无统计学差异。可能的原因是鼠尾出血时间受多种因素影响，如小鼠年龄、性别、麻醉情况、小鼠切尾方法、评价方法等[17]。在本实验中，尽量使用一致的方法来切断小鼠尾巴，判断出血时间和程度，但因实验小鼠在适应环境和氟西汀预处理 1 周后，体重状况均不同，最终也可能影响结果。不过，与对照组相比，氟西汀组小鼠有尾出血时间延长的趋势，这提示氟西汀可能通过降低血小板功能引起凝血功能障碍。
本研究也有一定的局限性。首先，没有同时对雄性和雌性小鼠进行实验，只纳入雌性小鼠。这是因为一些临床研究认为大多数脑卒中后抑郁症患者是女性[18]。因此，本研究结果可能仅提示氟西汀可加重女性患者的脑出血，将此结果应用于男性患者还需要更多的证据。其次，本研究仅使用了中年小鼠，因为脑出血患者多为中老年[1]，中年小鼠可以模拟这部分群体的生理特性。另一个局限性是本研究没有深入研究造成这种现象的机制。因此，未来实验需详细观察氟西汀预处理后外周血和脑脊液中五羟色胺含量、血肿周围 VEGF 表达的变化等。同时，可利用五羟色胺缺乏，如 TPH2 基因敲除（TPH2−/−）转基因小鼠进行实验，以进一步探索氟西汀加重脑出血的机制。
综上所述，本研究表明氟西汀预处理可能会进一步加重脑出血，其可能原因在于 SSRI 对血小板聚集的抑制作用。因此，脑出血尤其是再出血风险较高的患者应谨慎使用 SSRI 类药物。未来尚需更多设计精良的双盲随机对照实验以验证这一结论。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
脑出血是导致情绪障碍的常见病因，约 20%的脑出血患者可并发抑郁症，严重影响未来生活质量[1]。选择性五羟色胺再摄取抑制剂（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）是目前使用最广泛的抗抑郁药物之一。然而，由于 SSRI 有抑制血小板聚集作用，可能增加脑出血风险。既往已经有研究表明 SSRI 可能导致脑出血增加[2-3]，而其他研究却得出相反的结论[4]。因此，有必要设计一个严格、混杂因素可控的动物实验以进一步探索这一问题。氟西汀是一种强效 SSRI，可通过神经保护作用促进脑卒中后运动恢复而常用于脑出血患者[5]。但目前尚无针对其是否增加脑出血的动物实验。因此，本研究旨在利用标化的小鼠脑出血模型，考察氟西汀预处理是否有加重脑出血可能。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
42 只 12～14 个月龄无特定病原体级雌性 C57BL/6 小鼠，体质量 25～35 g，购于成都药康生物科技有限公司，许可证号 SCXK（川）2020-034。所有小鼠健康状况良好，分笼饲养在通风良好的恒温环境，给予充足的水和食物，使其能够自由饮水和进食，并以 12 h/12 h 的昼夜周期循环。动物术前 12 h 禁食，但自由进水。本研究通过四川大学华西医院实验动物伦理委员会批准，伦理备案号：20211160A。
1.2 方法
小鼠由简单随机法分配为氟西汀组（氟西汀预处理，1 mL 生理盐水稀释氟西汀腹腔注射，20 mg/kg、1 次/d，美国西格玛奥德里奇公司）和对照组（生理盐水 1 mL 腹腔注射，1 次/d），各 21 只。42 只小鼠中，22 只用于脑组织血红蛋白含量和鼠尾出血时间测定（每组 11 只），20 只用于神经功能、组织病理、出血损伤体积、脑含水量、脑肿胀等其他实验（每组 10 只）。氟西汀给药方案基于以前的研究[6]，于脑出血造模前 7 d 每日腹腔注射。
7.1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，所有小鼠仰卧位固定于立体定位仪。胶原酶（0.075 U，美国西格玛奥德里奇公司）注射至小鼠右侧纹状体诱导脑出血。注射位置选用前囟前 0.40 mm、侧 2.00 mm、深 3.00 mm，原因在于该位置不会损伤中央前回，使得神经系统损害评估与脑出血严重程度的一致性更强[7]。胶原酶匀速注射 5 min，并保持 10 min 以防止回流。在整个实验和恢复期均使用热垫保持小鼠肛温在（37.00±0.50）°C。
1.3 神经功能评估
在脑出血后第 1 天（建模后第 2 天）和第 3 天，采用神经功能缺损评分（neurologic deficit scoring，NDS）和悬绳实验盲评小鼠神经功能损伤情况[8]。利用 NDS 对小鼠进行了包括身体平衡、步态、攀爬、绕圈行为、前肢力量和强制绕圈 6 个方面测试。每个测试 0～4 分，最差 24 分。在悬绳实验中，将小鼠前肢挂于铁丝（55 cm 宽、2 mm 厚），记录其完全松开前肢并掉落的时间，用于评估小鼠的握力、平衡和耐力。
1.4 组织病理学
脑出血后第 3 天深度麻醉处死小鼠，用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）和 4%多聚甲醛经心脏灌注固定脑组织。整个纹状体行冠状位切片后进行劳克坚牢蓝-甲苯酚紫双染（luxol fast blue/cresyl violet，LFB-CV）以检测脑损伤和髓鞘损伤体积，采用fluoro-jade C（FJC）染色以检测退化神经元，普鲁士蓝染色以检测铁含量。每只小鼠选择 3 个连续病灶切片，每个切片选择 4 个区域共 12 个位置，测量平均髓鞘面积（%）和每平方毫米的 FJC 及普鲁士蓝阳性细胞数。所有的脑切片均由 1 名研究者盲法进行分析。
1.5 出血损伤体积、脑含水量和脑肿胀
利用 Image pro plus 5.0 软件对脑出血后第 3 天 LFB-CV 切片进行图像分析，通过厚度×各切片损伤面积之和，得出损伤体积。通过测定脑含水量以评估脑水肿，对比病侧及对侧纹状体，同时以小脑作为内部对照。脑含水量百分比=（湿重−干重）/湿重×100%。脑肿胀通过计算半球增大百分比来量化，即（同侧半球体积−对侧半球体积）/对侧半球体积×100%。
1.6 脑组织血红蛋白含量
由于血脑屏障破坏后血红蛋白代谢较快，取脑出血后第 1 天纹状体行血红蛋白含量检测。用 Drabkin 试剂（美国西格玛奥德里奇公司）溶解纹状体，以分光光度计在 540 nm 处检测氰化正铁血红蛋白的吸光度，测定血红蛋白含量。
1.7 鼠尾出血时间
为确定氟西汀是否抑制血小板聚集从而延长出血时间，因此在脑出血后第 1 天检测两组鼠尾出血时间，小鼠麻醉后置于恒温垫上维持体温，用刀片横切尾尖 3 mm，并立即浸入温 PBS［（37.00±0.50）°C］中。监测鼠尾出血时间，当停止出血超过 30 s 时记录为出血停止时间。鼠尾出血时间大于 15 min 均记录为 900 s。
1.8 统计学方法
用 GraphPad Prism 7 软件进行统计处理。计量资料首先进行正态性检验，若满足正态分布则以均数±标准差表示，在满足方差齐性的同时，组间比较采用成组 t 检验，否则采用校正 t 检验。若计量资料不满足正态性，则对原始数据进行对数转换。对于呈对数正态分布的资料，在满足方差齐性时采用成组 t 检验，反之采用校正 t 检验。若对数转换后仍不满足正态分布，则采用两独立样本 Wilcoxon 秩和检验。计数资料采用只数表示。双侧检验水准均为α=0.05。
2 结果
2.1 氟西汀预处理对小鼠脑出血后损伤体积、脑含水量和脑肿胀影响
脑出血后第 3 天，对照组和氟西汀组出血体积分别为（4.59±1.80）mm3 和（6.09±1.08）mm3。由图1a、1b 可见，与对照组相比，氟西汀组出血体积增加（t=−2.251，P=0.037）。由图1c、1d 可见，氟西汀组病侧纹状体脑含水量（t=−2.600，P=0.018）和脑肿胀（t=−2.069，P=0.035）均增加。
图1
氟西汀预处理对脑出血小鼠脑损伤体积、脑含水量、脑肿胀的影响（n=10）
a. 小鼠脑切片 LFB-CV 染色，标尺=5 mm；b. 出血体积；c. 脑含水量；d. 脑肿胀。*与对照组比较，
2.2 氟西汀预处理对小鼠脑出血后 NDS 结果的影响
对照组和氟西汀组小鼠各 10 只，体重分别为（29.71±2.30）g 和（31.23±1.73）g，差异无统计学意义（t=−1.144，P=0.268）。采用 NDS 和悬绳实验评估小鼠神经功能损伤情况。结果显示，与对照组相比，氟西汀组在脑出血后第 1 天及第 3 天，NDS 均增高，尤其脑出血后第 1 天对照组和氟西汀组评分分别为（10.10±4.53）、（17.20±3.58）分，两组比较差异有统计学意义（t=−3.886，P=0.001）。悬绳实验时间在脑出血后第 1 天，对照组和氟西汀组分别为（52.40±44.46）、（18.30±9.94）s，由于两组数据不满足正态性故进行对数转换，其对数值分别为（3.69±0.75）、（2.79±0.51）s，满足正态分布和方差齐性，结果显示与对照组比较，氟西汀组用时降低（t=2.367，P=0.029）。脑出血后第 3 天两组用时比较差异无统计学意义（t=1.845，P=0.081）。见图2a、2b。
图2
氟西汀预处理对脑出血小鼠神经功能（n=10）、悬绳实验（n=10）、脑血红蛋白含量（n=11）、鼠尾出血时间（n=11）的影响
a. NDS；b. 悬绳实验；c. 脑组织血红蛋白含量；d. 鼠尾出血时间。*与对照组比较，
2.3 氟西汀预处理对小鼠脑出血后血红蛋白含量及血小板聚集能力的影响
脑出血后第 1 天，对照组和氟西汀组纹状体血红蛋白吸光度分别为0.94±0.29 和 1.22±0.27，相比对照组，氟西汀组明显增加，差异有统计学意义（t=−2.259，P=0.035）。脑出血后 1 d 两组鼠尾出血时间检测显示，对照组和氟西汀组分别为（276.73±211.06）、（438.00±236.79）s，虽然与对照组相比差异无统计学意义（t=−1.686，P=0.055），但氟西汀预处理有延长鼠尾出血时间的趋势。见图2c、2d。
2.4 氟西汀预处理对小鼠脑出血后组织病理的影响
脑出血后第 3 天的组织病理学发现，氟西汀预处理可增加胶原酶诱导的脑出血髓鞘损伤，使得髓鞘面积减少（t=3.671，P=0.002），可增加铁沉积（t=−2.151，P=0.045），可加重神经元变性（t=−3.046，P=0.007）。见表1，图3、4。
表1
两组小鼠出血后组织病理情况（n=10，）
图3
两组小鼠脑出血后脑组织染色彩色像
LFB-CV，标尺=100 μm；普鲁士蓝染色，标尺=100 μm；FJC 染色，标尺=50 μm
图4
氟西汀预处理对小鼠脑出血后髓鞘损伤、铁沉积及神经元变性的影响
a. 髓鞘面积；b. 铁染色阳性细胞；c. FJC阳性细胞。*与对照组比较，
3 讨论
本研究希望通过建立较稳定的小鼠脑出血模型，考察氟西汀预处理对脑出血的影响。结果发现，与对照组相比，氟西汀预处理 7 d 的脑出血小鼠在出血体积、神经行为学缺损、神经元死亡及变性、血红蛋白及铁沉积、脑水肿等方面均更为严重。同时鼠尾出血时间有延长的趋势，提示氟西汀可能导致血小板聚集障碍，从而诱发出血增加。
本研究的主要发现是氟西汀预处理可加重脑出血。既往已有许多研究发现 SSRI 可增加消化道出血，但对脑出血的影响尚存在争议。一项纳入 1 279 例参与者，平均随访时间长达 53.2 个月的观察性研究显示，使用 SSRI 与脑出血之间存在明显的联系，特别是对于颅内影像学多发微出血，或伴有特定易出血基因型的患者[9]。但另外一项纳入 24 个随机对照试验共计 4 844 090 例被试者的 meta 分析则显示，并无强有力的证据证明 SSRI 会明显增加脑出血风险[10]。事实上，在临床工作中，SSRI 一直被用于治疗脑出血后情绪障碍，甚至被认为有利于脑出血后的神经功能恢复[5]。产生这种矛盾结论的原因有很多。首先，由于采用观察性研究而缺乏随机对照试验，在 SSRI 类药物导致出血增加的病例中存在研究偏倚；其次，脑出血易受多种混杂因素的影响，如不同的基础疾病、SSRI 不同使用情况等。在这些研究中，所纳入患者未进行分组，因此研究结果可能有偏差[11]；此外，之前众多研究是针对使用 SSRI 的普通抑郁症而非脑出血患者[12]。普通人群即使在 SSRI 抑制血小板聚集作用下，发生脑出血的风险非常小，难以被检出。而对于脑出血患者，血脑屏障的损伤可能加重 SSRI 所致的血肿体积增加，从而体现出统计学差异。
本研究发现，氟西汀预处理可加重脑出血。推测其机制在于 SSRI 药理作用为通过抑制中枢神经系统的五羟色胺转运体（serotonin transporters，SERT）以提高突触间隙五羟色胺浓度，从而治疗抑郁症。而此时血小板膜处的 SERT 也受到抑制。血小板无法结合五羟色胺，但位于血小板膜的 SERT 会将五羟色胺转移到血小板内参与凝血功能。因此，SSRI 会使血小板五羟色胺转运能力下降，进而损害凝血能力[13]。此外，依赖五羟色胺的促血小板活化细胞内信号转导通路也会受到 SSRI 抑制，降低血小板黏附功能从而加重出血[14]。相关临床研究证实，五羟色胺摄取能力抑制越强，诱发脑出血的可能性越大[2]，这与 SSRI 的生物学效应是一致的。众所周知，氟西汀是一种对五羟色胺再摄取能力强抑制作用的 SSRI 类药物。因此，本研究选择氟西汀而不是其他弱抑制剂来进行实验。此外，SSRI 可影响中枢神经系统血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达[15]。VEGF 促进脆弱新生血管的形成，进一步破坏血脑屏障，这可能是引起脑出血血肿扩大的潜在因素[16]。
鼠尾出血时间是评价血小板功能的常用工具。而在本实验中，氟西汀预处理在增加鼠尾出血时间并无统计学差异。可能的原因是鼠尾出血时间受多种因素影响，如小鼠年龄、性别、麻醉情况、小鼠切尾方法、评价方法等[17]。在本实验中，尽量使用一致的方法来切断小鼠尾巴，判断出血时间和程度，但因实验小鼠在适应环境和氟西汀预处理 1 周后，体重状况均不同，最终也可能影响结果。不过，与对照组相比，氟西汀组小鼠有尾出血时间延长的趋势，这提示氟西汀可能通过降低血小板功能引起凝血功能障碍。
本研究也有一定的局限性。首先，没有同时对雄性和雌性小鼠进行实验，只纳入雌性小鼠。这是因为一些临床研究认为大多数脑卒中后抑郁症患者是女性[18]。因此，本研究结果可能仅提示氟西汀可加重女性患者的脑出血，将此结果应用于男性患者还需要更多的证据。其次，本研究仅使用了中年小鼠，因为脑出血患者多为中老年[1]，中年小鼠可以模拟这部分群体的生理特性。另一个局限性是本研究没有深入研究造成这种现象的机制。因此，未来实验需详细观察氟西汀预处理后外周血和脑脊液中五羟色胺含量、血肿周围 VEGF 表达的变化等。同时，可利用五羟色胺缺乏，如 TPH2 基因敲除（TPH2−/−）转基因小鼠进行实验，以进一步探索氟西汀加重脑出血的机制。
综上所述，本研究表明氟西汀预处理可能会进一步加重脑出血，其可能原因在于 SSRI 对血小板聚集的抑制作用。因此，脑出血尤其是再出血风险较高的患者应谨慎使用 SSRI 类药物。未来尚需更多设计精良的双盲随机对照实验以验证这一结论。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
